Name: Extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour analyse métabolomique par électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-09T23:59:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Apprenez l'extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes pour analyse métabolomique par électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse. Cette méthode simple et fiable facilite l'étude du métabolisme cellulaire et la recherche sur le cancer.

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Nous remercions tous les membres du centre de promotion de l’industrie régionale de Shonai pour leur aide. Ce travail a été appuyé en partie par des fonds de recherche de la préfecture de Yamagata et de la ville de Tsuruoka, par le Fonds national de recherche et de développement du centre du cancer [Grant number 28-A-9], et par la société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) KAKENHI [Grant number 17K07189] à HM.

1. culture cellulaire au jour 1
Note: chaque échantillon d’extraction de métabolite doit être préparé à partir d’un seul plat de culture tissulaire de 100 mm qui est modérément mais pas entièrement anastomosé (contenant approximativement 2 à 5 millions de cellules). Calculez le nombre de plats nécessaires au dosage et préparez-les en conséquence.
<ol><li>Culture HCC827 et PC-9 cellules dans 5% CO2 à 37 ° c dans le milieu RPMI-1640 complété par 10% de sérum bovin FŒTAL (FBS).</li>
	<li>Aspirer les milieux de culture cellulaire des plats de culture de 100 mm.</li>
	<li>Laver les cellules de chaque plat à l’aide de 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium. Agiter délicatement chaque plat de sorte que la solution PBS recouvre complètement la surface du plat.</li>
	<li>Aspirer le tampon de lavage des plats de culture.</li>
	<li>Réchauffer 0,25% de solution de trypsine-EDTA à 37 ° c et ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA avec une pipette sérologique de 5 mL. Roche doucement chaque plat de sorte que la trypsine recouvre complètement la surface du plat.</li>
	<li>Incuber les plats de culture à 37 ° c pendant environ 5 min.</li>
	<li>Ajouter 4 mL de milieu de croissance complet préchauffé par plat. Resuspendre les cellules en milieu par pipetage en douceur plusieurs fois.</li>
	<li>Transférer chaque suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL séparé et centrifuger à 800 × g pendant 5 min.</li>
	<li>Resuspendre chaque culot de cellule dans 2 mL de milieu de croissance complet préchauffé.</li>
	<li>Déterminez le nombre total et la viabilité en pourcentage des cellules à l’aide du compteur de cellules automatisé et de la solution bleue 0,4% trypan.<ol>
<li>Mélanger 10 μL de suspension cellulaire et 10 μL de solution de bleu trypan de 0,4%.</li>
		<li>Chargez 10 μL d’échantillon dans la chambre de comptage de cellules par action capillaire.</li>
		<li>Insérez la glissière de la chambre dans le compteur de cellules automatisé. La lumière transmise s’allume automatiquement et l’instrument auto se concentre sur la cellule.</li>
		<li>Appuyez sur le bouton capture pour capturer l’image et afficher les résultats.</li>
		<li>Si nécessaire, ajouter un autre milieu de croissance pour obtenir la concentration de cellules désirée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Semences d’environ 1 à 2,5 millions de cellules par plat de culture cellulaire de 100 mm. Remarque: les concentrations de métabolite déterminées par l’analyse CE-MS seront normalisées en fonction du nombre de cellules viables. Aux fins du comptage de cellules, il est nécessaire de préparer au moins un plat de culture à ensemencement supplémentaire pour chaque groupe.</li>
	<li>Incuber les plats de culture dans 5% CO2 à 37 ° c pendant 18 h.</li>
</ol>2. préparation des réactifs
<ol><li>Diluer une solution étalon interne commerciale incluant la L-méthionine sulfone et l’acide d-camphre-10-sulfonique 1000 dans de l’eau ultrapure. NOTE: pour moins de 80 échantillons, mélanger simplement 50 μL de la solution étalon interne 1 et 45 mL d’eau ultrapure dans une fiole jaugée de 50 mL, puis apporter la solution jusqu’à 50 mL avec de l’eau ultrapure.</li>
	<li>Préparer une solution de mannitol de 0,05 g/mL dans de l’eau ultrapure comme tampon de lavage. Remarque: pour moins de 30 échantillons, dissoudre simplement 25 g de mannitol dans 500 mL d’eau ultrapure. Il faut environ 15 mL de tampon de lavage par plat de culture de 100 mm, afin de préparer un volume suffisant de tampon de lavage en fonction du nombre d’échantillons.</li>
</ol>3. prélavage des unités de filtration centrifuge
<ol><li>Pipetter 250 μL d’eau ultrapure dans la cuvette filtrante de chaque unité de filtration centrifuge (voir le tableau des matériaux). Remarque: deux unités filtrantes par échantillon sont requises.</li>
	<li>Visser hermétiquement les unités filtrantes et centrifuger à 9 100 × g à 4 ° c pendant 5 min.</li>
	<li>Vérifier le volume de chaque filtrat — si un filtrat significatif s’est accumulé pendant la première rotation courte, l’unité filtrante peut être défectueuse. Dans ce cas, jetez l’unité de filtration et utilisez une nouvelle unité de filtrage à la place.</li>
	<li>Fermez fermement les couvercles des unités filtrantes et Centrifugez à nouveau à 9 100 × g à 4 ° c pendant 30 min.</li>
	<li>S’assurer qu’aucune eau ultrapure ne reste dans l’une des tasses filtrantes; enlever l’eau ultrapure filtrée dans chaque tube collecteur avec une pipette et la jeter. Remarque: n’essayez pas d’enlever l’eau résiduelle dans une cuvette de filtre avec une pipette car elle pourrait endommager le filtre.</li>
	<li>Remplacez les tasses filtrantes dans leurs tubes de prélèvement. Remarque: utilisez les filtres centrifuges en moins d’une heure, car ils risquent d’être endommagés lors du séchage.</li>
</ol>4. culture cellulaire au jour 2
<ol><li>
Sortez les plats de culture de 100 mm de l’incubateur. Remarque: la durée de culture de la cellule recommandée est de 18 h.</li>
	<li>Aspirer le milieu de culture cellulaire de chaque plat de culture de 100 mm.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de milieu de culture cellulaire qui comprend les concentrations appropriées de composés ou de médicaments à chaque plat, en prenant soin de ne pas déranger la couche cellulaire. Remarque: à des fins de démonstration, nous avons ajouté 10 μL de diamure de 250 mM dissous dans le PBS (concentration finale de 250 μM) dans cette expérience.</li>
	<li>Incuber les plats de culture à 37 ° c pendant 30 min en présence de diamide ou de PBS comme contrôle.</li>
	<li>Aspirer le milieu de culture cellulaire de chaque plat de culture de 100 mm.</li>
	<li>Lavez les cellules en ajoutant doucement 2 mL de solution de mannitol à 5% au bord de chaque plat, en prenant soin de ne pas déranger la couche cellulaire, puis inclinez légèrement le plat. Remarque: le PBS ou la solution saline interfère avec l’analyse métabolomique basée sur le CE-MS et affecte négativement les résultats de mesure, et ne doit donc pas être utilisé comme tampon de lavage.</li>
	<li>Aspirer le tampon de lavage de chaque plat de culture, puis laver les cellules à nouveau en ajoutant doucement 10 mL de tampon de lavage par plat et en inclinant légèrement le plat.</li>
	<li>Aspirer complètement le tampon de lavage du bord de chaque plat de culture. NOTE: aspirer autant de tampon de lavage que possible, tout en prêtant attention à ne pas aspirer les cellules. Le mannitol résiduel peut interférer avec l’analyse CE-MS; l’aspiration des cellules diminuera le nombre de cellules et deviendra ainsi une source d’erreur dans la normalisation des données.</li>
</ol>5. extraction des métabolites des cellules cultivées
<ol><li>Ajouter 800 μL de 99,7% de méthanol par plat de culture. Roche doucement chaque plat de culture d’avant en arrière pour couvrir toute sa surface. Laisser la vaisselle à température ambiante pendant 30 s.</li>
	<li>Ajouter lentement 550 μL de la solution étalon interne diluée par plat en immergeant la pointe de la pipette dans le méthanol et en le pipetant doucement plusieurs fois.</li>
	<li>Roche doucement chaque plat de culture d’avant en arrière pour couvrir toute sa surface.</li>
	<li>Laisser la vaisselle à température ambiante pendant 30 s.</li>
</ol>6. ultrafiltration des extraits cellulaires
<ol><li>Transférer la solution extraite de chaque plat de culture à un tube de microcentrifugation de 1,5 mL séparé.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 2 300 × g à 4 ° c pendant 5 min.</li>
	<li>Transférer 350 μL de chaque surnageant dans deux unités filtrantes centrifuges par échantillon. NOTE: à partir de chaque plat de culture, un total de 700 μL de la solution extraite est transféré dans deux tubes filtrants (350 μL/tube).</li>
	<li>Centrifuger les tubes filtrants à 9 100 × g à 4 ° c pendant environ 2 h jusqu’à ce qu’aucun liquide ne reste dans les tasses filtrantes.</li>
	<li>Retirez les tasses filtrantes et Fermez hermétiquement les couvercles des tubes de prélèvement.</li>
</ol>7. évaporation de l’échantillon
<ol><li>Préparez un évaporateur centrifuge — typiquement, il s’agit d’un évaporateur, d’un piège à froid et d’une pompe à vide.</li>
	<li>Placer les tubes de prélèvement dans l’évaporateur centrifuge. Remarque: laissez les couvercles des tubes ouverts.</li>
	<li>Évaporez les solutions d’échantillonnage extraites dans des conditions de vide à température ambiante. NOTE: les configurations typiques pour le nombre de rotations et la pression sont 1 500 RPM et 1 000 PA, respectivement, et il faut généralement environ 3 h pour évince complètement les échantillons.</li>
	<li>Vérifiez qu’aucun liquide ne reste dans l’un des tubes de prélèvement et fermez fermement les couvercles des tubes.</li>
	<li>Conserver les tubes de prélèvement dans un congélateur profond à température ultra basse (− 80 ° c) jusqu’à l’analyse métabolomique.</li>
</ol>8. analyse métabolomique par CE-MS
<ol><li>Resuspendre le filtrat dans 50 μL d’eau ultrapure immédiatement avant l’analyse CE-MS.</li>
	<li>Effectuer l’analyse ce-ms par des méthodes décrites précédemment12,13 utilisant le système d’électrophorèse capillaire et le système de spectromètre de masse de temps de vol équipé d’une pompe isocratique, d’un adaptateur ce-ms, et d’un pulvérisateur ce-ESI-MS. Remarque: les deux systèmes peuvent être contrôlés par le logiciel des vendeurs du système et sont reliés par un capillaire en silice fondue (50 μM de diamètre interne × 80 cm de longueur totale).<ol>
<li>Mettre en place des instruments et des flacons d’échantillon, préparer le capillaire avec une cassette capillaire, reconstituer les liquides de gaine et les tampons d’électrophorèse appropriés en fonction du mode d’analyse des anions ou des cations, puis appliquer des tensions. Remarque: les conditions d’instrumentation et d’analyse sont décrites en détail ailleurs12,13.</li>
		<li>Ouvrez le logiciel et préparez une réserve de travail contenant des méthodes d’acquisition de données et des exemples d’informations.</li>
		<li>Démarrez une série de tests et vérifiez les données telles que l’intensité du signal et la forme maximale des étalons internes et la résolution maximale d’autres composés standard.</li>
		<li>Affiner les conditions analytiques si nécessaire.</li>
		<li>Injecter les solutions d’échantillonnage à 50 mbar pour 3 s et une tension de 30 kV. Remarque: CE-MS a été effectué soit en mode ion positif ou négatif. Réglez le spectromètre pour numériser la plage de masse m/z 50 – 1000. La tension capillaire a été fixée à 4 kV; le débit d’azote gazeux (température du chauffe-eau 300 ° c). Pour le mode positif, le fragmentor, le skimmer et la tension de RFV OCT ont été fixés respectivement à 75, 50 et 125 V. Pour le mode d’ion négatif, la tension de fragmenteur, d’écumoire et de RFV OCT a été fixée respectivement à 100, 50 et 200 V.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysez les données du spectre.<ol>
<li>Extrayez les pics des données spectrales de masse à l’aide d’un logiciel d’intégration automatique afin d’obtenir des informations de pointe, y compris m/z, zone de crête et temps de migration (MT). Remarque: la méthode est décrite en détail ailleurs14.</li>
		<li>Exclure les pics de signal correspondant aux isotopomères, aux ions d’adduit et à d’autres ions de produits de métabolites connus.</li>
		<li>Annotez les pics restants avec les informations de la base de données du métabolite HMT selon les valeurs m/z et MTS.</li>
		<li>Normalisez les zones des pics annotés aux niveaux standard internes et au nombre de cellules par échantillon.</li>
		<li>Évaluer la concentration de chaque métabolite dans les cellules cultivées (pmol/106 cellules) à l’aide de courbes standard préparées pour chaque métabolite.</li>
		<li>Utiliser les concentrations de métabolite quantifiées pour les analyses statistiques ultérieures et les interprétations biologiques14.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+glycolysis%3A+meeting+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism%3A+key+players+in+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming.</a> Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).</li>
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<li>Fukuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+for+cancer+diagnosis+with+positron-labeled+fluorinated+glucose+analogs%3A+%5B18F%5D-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose%3A+a+new+tracer+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Meddicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection.</a> European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).</li>
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<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Determinants+of+Sensitivity+to+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathway+Inhibitor+in+Small-Cell+Lung+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma.</a> Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).</li>
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<li>Ooga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+anatomy+of+an+animal+model+revealing+homeostatic+imbalances+in+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia.</a> Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).</li>
<li>Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+mass+spectrometry-based+saliva+metabolomics+identified+oral%2C+breast+and+pancreatic+cancer-specific+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles.</a> Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).</li>
<li>Patra, K. C., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pentose+phosphate+pathway+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The pentose phosphate pathway and cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous décrivons une méthodologie largement accessible pour préparer les métabolites des cellules cancéreuses cultivées pour l’analyse métabolomique basée sur le CE-MS. Un des points les plus critiques dans ce protocole est la préparation appropriée des cellules cancéreuses, parce que les concentrations mesurées de métabolite sont normalisées au nombre de cellules viables. Pour une estimation précise du nombre de cellules, il est nécessaire de préparer au moins un plat de culture supplémentaire par groupe expérimental pour compter le nombre de cellules viables en parallèle avec l’extraction des métabolites pour l’analyse métabolomique. En outre, le même nombre de cellules doit être ensemencé dans chaque plat pour les répliques et dans le plat pour le comptage; à l’avenir, cela serait facilité par un protocole de comptage cellulaire rapide et sans stress (p. ex., sans trypsine) qui permet d’utiliser le même plat pour le comptage de cellules viables et l’extraction de métabolites. Les précautions doivent être prises pendant les lavages afin que les cellules ne se détachent pas de la surface des plats. Des tests de cytotoxicité sévère et d’autres expériences qui réduisent l’adhérence des cellules peuvent ne pas convenir à ce protocole d’extraction en raison d’une perte potentielle de cellules pendant la procédure de lavage.
Il est important d’utiliser une solution de mannitol à 5% comme tampon de lavage pour extraire les métabolites des cellules cultivées pour une analyse métabolomique basée sur le CE-MS, car les tampons à base de sel, tels que le PBS, interfèrent avec l’analyse métabolomique et nuisent à la mesure.
Deux ou trois plats peuvent être combinés en un seul échantillon en extrayant individuellement des métabolites de chaque plat, puis en regroupant des échantillons; Cependant, la combinaison de plusieurs plats augmente souvent le mannitol résiduel dans la solution de métabolite extrait. Cela peut également interférer avec l’analyse métabolomique par CE-MS. par conséquent, il est recommandé de ne pas utiliser plusieurs plats ou des puits comme un seul échantillon.
Cette méthode d’analyse métabolomique utilisant CE-MS a été développée pour la mesure complète des molécules chargées avec des poids moléculaires entre 50 et 1000 da; ainsi, ce protocole est optimisé pour l’extraction de composés aqueux, de faible poids moléculaire. Par conséquent, ce protocole ne convient pas à l’extraction de métabolites hydrophobes tels que les lipides ou les macromolécules telles que les protéines et les acides nucléiques. Étant donné qu’il y a une demande croissante d’analyses lipidiques complètes ou de lipidomique d’échantillons de cellules cultivées, le développement d’un protocole facile et efficace pour l’extraction simultanée de métabolites hydrophiles et hydrophobes est nécessaire.
La première étape de l’extraction du métabolite — milieu aspirant et cellules de lavage avec le mannitol — doit être effectuée aussi rapidement que possible pour minimiser les changements au profil métabolique des cellules. Le traitement des cellules avec le méthanol après le lavage avec le mannitol est supposé pour dénaturer les protéines et ainsi empêcher les enzymes de catalyser d’autres réactions métaboliques. Cependant, même après le traitement au méthanol, des réactions chimiques non enzymatiques — telles que des réactions redox, certains processus de décarboxylation et des liaisons THIOLÉES — peuvent avoir lieu. Ainsi, toutes les concentrations de métabolites impliqués dans ces réactions mesurées par ce protocole doivent être interprétées avec prudence. Contrairement au génome ou au transcriptome, le métabolome est constitué de molécules possédant une grande variété de propriétés chimiques; par conséquent, aucun protocole unique ne peut extraire tous les métabolites sans aucune perte ou perturbation. Pour des mesures plus précises de ces métabolites hautement réactifs, un protocole spécifiquement conçu pour extraire certains groupes de métabolites, qui nécessite des fractionnements et des dérivations, doit être consulté. Le protocole présenté ici, cependant, décrit une extraction simple et rapide de métabolites aqueux à partir d’échantillons de cellules cultivées pour l’analyse métabolomique par CE-MS. Dans ce document, nous ne pouvions pas décrire comment mettre en place CE-MS en détail parce que le présent manuscrit est différent, cependant, décrivant les étapes détaillées pour mettre en place CE-MS peut nécessiter un article distinct dédié.

Otto Warburg a observé que les cellules cancéreuses acquièrent la capacité inhabituelle de prendre du glucose et de la fermenter pour produire du lactate en présence d’oxygène adéquat — un phénomène appelé effet de Warburg ou glycolyse aérobie1,2. Les anomalies de la respiration mitochondriale sont spéculé comme base sous-jacente pour la glycolyse aérobie dans les cellules cancéreuses3. En effet, l’effet de Warburg est la base de l’imagerie tumorale par le fluorodésoxyglucose (FDG)-tomographie par émission de positrons (PET), qui est largement utilisée dans la pratique clinique4,5. Un taux élevé de glycolyse aérobie est considéré comme une caractéristique clé du cancer et a été récemment adopté comme l’un des «poinçons du cancer bien connus», comme décrit par D. Hanahan et B. Weinberg6. Les mutations somatiques dans les oncogènes et les gènes suppresseurs tumoraux — tels que HRAS/Kras/nras, EGFR, BRAF, myc, TP53, isocitrate déshydrogénase (IDH) et fumarate hydratase (FH ) — ont été liés à des changements métaboliques spécifiques dans les cellules cancéreuses, censés être le résultat de l’effet de Warburg7.
L’analyse métabolomique est une approche prometteuse non seulement pour comprendre la régulation métabolique dans les cellules cancéreuses, mais aussi pour identifier les biomarqueurs du cancer au stade précoce et la prédiction de la réponse chimiothérapique. Après le traitement des cellules cancéreuses sensibles ou résistantes avec des composés anticancéreux, le suivi de leurs réponses métaboliques facilite l’identification des biomarqueurs métaboliques pour prédire l’efficacité des thérapies anticancéreuses spécifiques chez les patients cancéreux8 ,9,10,11. Dans cet article, les lignées cellulaires cancéreuses dérivées d’un adénocarcinome pulmonaire avec une mutation EGFR traitée avec du diamide — qui provoque un stress oxydatif — ont été utilisées comme modèles pour l’analyse métabolomique. L’avantage de cette méthode analytique utilisant l’électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse (ce-ms) est sa mesure complète des métabolites chargés avec la gamme de masse m/z 50-100012,13. Le but de cet article est de fournir aux novices un protocole visuel détaillé par étapes pour la préparation des métabolites aqueux des cellules cancéreuses cultivées et l’analyse métabolomique subséquente, en particulier par CE-MS.

<table><tbody><tr><td>Compteur de cellules automatisé</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Countess II Compteur de cellules automatisé</td></tr><tr><td>Logiciel d’intégration automatique</td><td>Agilent Technologies</td><td>MassHunter G3335-60041</td><td>version B.02.00</td></tr><tr><td>Système CE</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 7100 Système CE</td><td></td></tr><tr><td>Kit adaptateur CE/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1603A</td><td></td></tr><tr><td>CE-ESI-MS Kit de pulvérisation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1607A</td><td></td></tr><tr><td>Lame de chambre de comptage</td> cellulaire <td>Thermo Scientific</td><td>C10282</td><td>Lames de chambre de comptage cellulaire Countess</td></tr><tr><td>Dispositif de filtre centrifuge, 5 kDa</td> Human <td>Metabolome Technologies</td><td>ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique stérile en polypropylène, 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339651</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique stérile en polypropylène, 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339653</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 10 ml</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar stripette, 5 ml</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Wako</td><td>133-00845</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’électrophorèse</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3301-1001</td><td>pour l’analyse des cations</td></tr><tr><td>Tampon d’électrophorèse</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3302-1021</td><td>pour l’analyse anionique</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Biowest</td><td>S1780</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de filtre, 1000 &mu ; l</td><td>Watson</td><td>124P-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Pointe de filtre, 20 &mu ; l</td><td>Watson</td><td>124P-20S</td><td></td></tr><tr><td>Embout filtre, 200 &mu ; l</td><td>Watson</td><td>1252-703CS</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en silice fondue</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>50 &mu ; m i.d. et temps ; 80 cm de longueur totale</td></tr><tr><td>HCC827</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2868</td><td></td></tr><tr><td>Solution étalon interne</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1002</td><td></td></tr><tr><td>Pompe isocratique</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 1100 Series Pompe</td><td></td>isocratique</tr><tr><td>Méthanol</td><td>Wako</td><td>138-14521</td><td>1 L, LC/MS</td></tr><tr><td>microtube, 1,5 ml</td><td>Watson</td><td>131-415C</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’exploitation</td><td>Agilent Technologies</td><td>ChemStation G2201AA</td><td>version B.03.01 pour CE</td></tr><tr><td>PC-9</td><td>RIKEN Bio Resource Center</td><td>RCB4455</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire stérile, 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse à temps de vol</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0,4 %</td><td>Thermo Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Eau ultrapure</td><td>Merck</td><td>Milli-Q eau</td><td>18,2 M&Omega ; &#183 ; cm d’eau pure</td></tr><tr><td>Fiole jaugée, 50 ml</td><td>Iwaki</td><td>5640FK50E</td><td>TE-32</td></tr></tbody></table>

extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour analyse métabolomique par électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

L’analyse métabolomique est une approche de l’omiques prometteuse non seulement pour comprendre la régulation métabolique spécifique dans les cellules cancéreuses par rapport aux cellules normales, mais aussi pour identifier les biomarqueurs pour la détection précoce du cancer et la prédiction de la réponse à la chimiothérapie dans patients atteints de cancer. La préparation d’échantillons uniformes pour l’analyse métabolomique est une question cruciale qui reste à traiter. Ici, nous présentons un protocole facile et fiable pour l’extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour l’analyse métabolomique par électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse (CE-MS). Les métabolites aqueux des cellules cultivées sont analysés par la culture et le lavage des cellules, le traitement des cellules avec du méthanol, l’extraction de métabolites, et l’élimination des protéines et des macromolécules avec des colonnes de spin pour l’analyse CE-MS. Les résultats représentatifs utilisant des lignées cellulaires de cancer du poumon traitées avec le diamide, un réactif oxydatif, illustrent le déplacement métabolique clairement observable des cellules sous le stress oxydatif. Cet article serait particulièrement utile pour les étudiants et les enquêteurs impliqués dans la recherche sur la métabolomique, qui sont nouveaux à récolter des métabolites de lignées cellulaires pour analyse par CE-MS.

Étant donné que les concentrations de métabolites dans les cellules cancéreuses (pmol/106 cellules) sont normalisées au nombre de cellules viables, des conditions expérimentales devraient être établies avec précaution afin de minimiser la variation du nombre de cellules viables entre les conditions. Par exemple, le traitement diamide était à une concentration relativement élevée (250 μM), mais pendant une courte période pour permettre à toutes les cellules de croître aussi équitablement que possible, ce qui équivaut à égaliser le nombre de cellules viables analysées. Dans ces conditions expérimentales, les cellules HCC827 et PC-9 ont augmenté également pendant 3 h (figure 1). L’analyse CE-MS des cellules traitées au diamide par rapport aux cellules traitées par PBS (témoins) a révélé des métabolites différentiels 175 et 150 dans les cellules HCC827 et PC-9, respectivement. Parmi ceux-ci, plusieurs intermédiaires dans la voie du pentose phosphate (PPP) et dans la glycolyse supérieure étaient significativement plus élevés dans les conditions traitées au diamide dans les deux lignées cellulaires, alors que quelques intermédiaires du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) étaient plus faibles dans les conditions (figure 2 et figure 3).
Le PPP génère des équivalents réducteurs sous la forme d’une réduction de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH), qui est utilisé pour l’entretien de l’homéostasie redox et la biosynthèse des acides gras15. Après traitement diamide, le niveau d’acide gluconique — un glucose oxydé — a augmenté de 12 fois dans les cellules HCC827 et de 10 fois dans les cellules PC-9; de même, après un traitement diamide, le taux de glucose 6-phosphate (G6P) — un glucose phosphorylé et le premier produit de glycolyse catalysé par l’hexokinase — a également augmenté de 6,3 et de 3,5 fois dans les cellules HCC827 et PC-9, respectivement (figure 4). De plus, après traitement diamide, les concentrations de 6-phosphogluconate (6PG) — le premier intermédiaire en PPP — ont considérablement augmenté de 89 dans les cellules de HCC827 et de 231 fois dans les cellules PC-9 comparativement aux concentrations observées dans les contrôles du PBS (figure 4). En revanche, les concentrations d’autres intermédiaires glycolytiques, comme le fructose 6-phosphate (F6P) et le fructose 1,6-bisphosphate (F1, 6P), n’ont pas changé dans la condition expérimentale diamide (figure 4). Les concentrations totales de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP+) étaient presque équivalentes entre le traitement diamide et les conditions de contrôle du PBS (figure 4), suggérant que le glucose était principalement catabolisé via le PPP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig1.jpg"> La figure 1. Nombre de cellules inchangé sur traitement diamide. Les réponses de croissance cellulaire à 250 μm de diamide ont été mesurées à l’aide d’une coloration bleue trypane. Les nombres cellulaires de (A) HCC827 et (B) les cellules PC-9 traitées avec PBS (bleu) ou diamide (rouge; 250 μM) pendant 1 ou 3 h sont affichées. Les données sont affichées comme la moyenne ± SD (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig2.jpg"> La figure 2. Les pics représentatifs de la SEP des métabolites. Electropherogrammes annotés comme (A) acide gluconique, (B) glucose 6-phosphate (G6P), (C) 6-phosphogluconate (6PG), et (D) nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP+) obtenu par analyse ce-ms. Chaque ligne indique la ligne de la cellule (solide, HCC827; pointillé, PC-9) et le traitement (bleu, PBS; rouge, diamide) utilisé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig3.jpg"> La figure 3. Profils métabolome des métabolites intracellulaires. Les changements de pli des métabolites dans (A) HCC827 et (B) les cellules de PC-9 traitées aveclediamide sont montrées comme log2(diamide/PBS). Au total, 175 et 150 métabolites ont été annotés respectivement dans les cellules HCC827 et PC-9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig4.jpg"> La figure 4. Up-Regulation du PPP sur le traitement diamide. Les concentrations intracellulaires (pmol/106 cellules) des métabolites clés impliqués dans la glycolyse et la voie du pentose phosphate (PPP) après le traitement par le diamide sont montrées. Les métabolites ont été extraits des cellules HCC827 et PC-9 traitées avec du PBS (bleu) ou du diamide (rouge, 250 μM) pendant 30 min. métabolites représentatifs tels que l’acide gluconique, le glucose 6-phosphate (G6P), le fructose 6-phosphate (F6P), 6 -le phosphogluconate (6PG) et le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP+) sont montrés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Le but de cet article est de décrire un protocole pour l’extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour l’analyse métabolomique, en particulier, l’électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse.

Extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour analyse métabolomique par électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Le but de cet article est de fournir un protocole visuel détaillé et étapewise pour extraire des métabolites aqueux des cellules cancéreuses cultureneuses pour l’analyse suivante de métabolome. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité et sa fiabilité pour extraire les métabolites des cellules adhérentes. Mais surtout, il est bien optimisé pour l’analyse des métabolomes à l’aide de spectrométrie capillaire électrophoresis-masse ou CEMS.La métabolomique est une technique puissante pour identifier les biomarqueurs ou détecter le cancer à un stade précoce et prédire la réponse de la chimiothérapie aux patients atteints de cancer. Nous utilisons des cellules cancéreuses dans cette démonstration. Cependant, cette technique peut également être appliquée pour récolter des métabolites d’autres cellules adhérentes telles que les fibroblastes dans les cellules iPS.Les concentrations de métabolites sont normalisées en fonction du nombre de cellules viables. Une préparation si minutieuse de la culture, c’est la clé pour obtenir de bonnes données reproductibles. Ami Maruyama, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure.Pour commencer, plaque HCC827 et PC-9 cellules dans des plats de 100 millimètres contenant 10 millilitres de RPMI-1640 moyen complété par 10% sérum bovin fœtal. Placez les plats dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant 24 heures à la culture. Après l’incubation, inclinez doucement les plats de culture de 100 millimètres pour aspirer le média de culture cellulaire.Laver les cellules de chaque plat à l’aide de deux millilitres de solution saline tamponnée de phosphate sans calcium et magnésium. Secouez doucement chaque plat de sorte que la solution PBS couvre complètement la surface du plat, puis inclinez la vaisselle pour aspirer le tampon de lavage. Chaud 0,25%trypsine-EDTA solution à 37 degrés Celsius.Avec une pipette sérologique de cinq millilitres, ajouter deux millilitres de la solution trypsine-EDTA réchauffée à chaque plat. Bercer délicatement chaque plat de sorte que la trypsine recouvre complètement la surface du plat. Incuber les plats de culture à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes.Ajouter ensuite quatre millilitres de milieu de croissance complet préchauffé à chaque plat. Et pipette doucement plusieurs fois pour re-suspendre les cellules à moyen. Transférer chaque suspension cellulaire dans un tube conique séparé de 15 millilitres.Centrifugeuse à 800 fois g pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez chaque granulé cellulaire en deux millilitres du milieu de croissance complet préchauffé. Mélangez 10 microlitres de la suspension cellulaire avec 10 microlitres de solution bleue trypan de 0,4 %, dans un microtube de 1,5 millilitre.Chargez 10 microlitres du mélange dans une chambre de comptage cellulaire glisser à travers l’action capillaire. Insérez la glissière de chambre dans le compteur de cellules automatisé et appuyez sur le bouton de capture pour capturer l’image et afficher les résultats du nombre total et de la viabilité en pourcentage des cellules. Si le nombre total de cellules est supérieur à 0,5 million de cellules par millilitre, ajouter un autre milieu de croissance au tube conique de 15 millilitres pour obtenir la concentration cellulaire désirée.Maintenant, ajoutez deux à cinq millilitres de la culture à chaque plat de culture cellulaire de 100 millimètres pour ensemencer approximativement un à deux 1/2 million de cellules par plat. Incuber les plats de culture en 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 18 heures. Tout d’abord, dans un flacon volumétrique de 15 millilitres, diluer une solution standard interne commerciale contenant du sulfone L-Methionine et de l’acide sulfonique D-Camphor-10 10 fois dans de l’eau ultrapure.Dissoudre le mannitol dans de l’eau ultrapure pour préparer une solution de mannitol de 0,05 gramme par millilitre dans de l’eau ultrapure comme tampon de lavage. Puis, dans la tasse filtrante de chaque unité de filtre centrifuge, pipette 250 microlitres d’eau ultrapure. Capuchon les unités de filtre étroitement, et centrifugeuse à 9, 100 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Vérifiez le volume de chaque filtrate. Si un filtrate important s’est accumulé au cours de la première rotation courte, l’unité de filtre peut être défectueuse. Jetez l’unité de filtre et utilisez plutôt une nouvelle unité de filtre.Fermez les couvercles des unités de filtre hermétiquement et centrifugez à nouveau à 9, 100 fois g à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Assurez-vous qu’il ne reste pas d’eau ultrapure dans l’une ou l’autre des tasses filtrante et retirez l’eau ultrapure filtrée dans chaque tube de collecte à l’l’huile de pipette. Remettre les gobelets filtrants dans leurs tubes de collecte et utiliser les unités de filtre centrifuge dans l’heure qui suit pour éviter les dommages lors du séchage.Sortez les plats de culture de 100 millimètres de l’incubateur et aspirez le milieu de culture cellulaire de chaque plat. Ajouter 10 millilitres de milieu de culture PBS avec ou sans diamide micromolaire à chaque plat, en prenant soin de ne pas perturber la couche cellulaire. Incuber les plats de culture à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après incubation, aspirer le milieu de culture cellulaire de chaque plat de culture de 100 millimètres. Inclinez légèrement le plat, et ajoutez doucement deux millilitres de tampon de lavage de 5% de mannitol au bord de chaque plat pour laver les cellules, en prenant soin de ne pas déranger la couche cellulaire. Aspirez le tampon de lavage de chaque plat de culture, et lavez les cellules à nouveau en inclinant légèrement le plat et en ajoutant doucement 10 millilitres de tampon de lavage par plat.Ensuite, aspirez complètement le tampon de lavage du bord de chaque plat de culture. Maintenant, ajoutez 800 microlitres de 99,7% de méthanol par plat de culture, et secouez doucement chaque plat de culture d’avant en arrière, pour couvrir toute sa surface. Laisser la vaisselle à température ambiante pendant 30 secondes.Ajouter lentement 550 microlitres de la solution standard interne diluée par plat en immergeant la pointe de la pipette dans le méthanol et en pipetting doucement de haut en bas, plusieurs fois. Bercer délicatement chaque plat de culture d’avant en arrière pour couvrir toute sa surface et laisser les plats à température ambiante pendant 30 secondes. Ensuite, transférez la solution extraite de chaque plat de culture dans un tube de microcentrifugeuse séparé de 1,5 millilitre.Centrifuger les tubes à 2300 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférer 700 microlitres de chaque supernatant en deux unités de filtre centrifuge, avec 350 microlitres par unité. Centrifuger les tubes filtrants à 9 100 g à quatre degrés Celsius pendant environ deux heures, jusqu’à ce qu’aucun liquide ne reste dans les gobelets filtrants.Retirer les gobelets filtrants et fermer hermétiquement les couvercles des tubes de collecte. Dans cette étude, les cellules HCC827 et PC-9 se sont développées également pendant trois heures. L’analyse cems indique la différence entre les cellules diamide-traitées et les cellules PBS-traitées pour les deux lignes cellulaires.Parmi ceux-ci, plusieurs intermédiaires dans la voie de phosphate de pentose et dans la glycolyse supérieure étaient sensiblement plus élevés dans les conditions diamide-traitées, tandis que quelques intermédiaires tricarboxylic de cycle étaient inférieurs dans les conditions traitées. Les profils de métabolome des métabolites intracellulaires ont indiqué 175 et 150 métabolites différentiels dans HCC827 et PC-9 cellules, respectivement. Après traitement diamide, le niveau d’acide gluconique et de glucose oxydé a été multiplié par 12 dans les cellules HCC827 et 10 fois dans les cellules PC-9.De même, le niveau de glucose 6-phosphate, un glucose phosphorylated dans le premier produit de glycolyse hexokinase-catalysé, a également augmenté 6.3- et 3.5-fois dans les cellules HCC827 et PC-9, respectivement. En outre, les niveaux de 6-phosphogluconate, le premier intermédiaire dans la voie de phosphate de pentose, ont augmenté considérablement 89 fois dans les cellules HCC827 et 231 fois dans les cellules PC-9. En revanche, les niveaux d’autres intermédiaires glycolytiques tels que le fructose 6-phosphate n’ont pas changé dans l’état expérimental de diamide.Les niveaux totaux de phosphate d’adénone d’adénone de nicotinamide étaient presque équivalents entre le traitement de diamide et les conditions de contrôle de PBS. L’utilisation de la solution 5% mannitol, autre que PBS, comme tampon de lavage pour les cellules de lavage est très important pour l’analyse CEMS, parce que les tampons à base de sel interférer avec l’analyse et nuire à la mesure. Ce protocole n’est pas approprié pour extraire des métabolites hydrophobes comme les lipides, nous devons donc développer un protocole pour extraire commodément les métabolites hydrophiles et hydrophobes pour une analyse métabolome plus complète.Cette technique réalise une extraction facile des métabolites de presque toutes les cellules adhérentes, et donc, est applicable pour une variété de recherches telles que le cancer, les cellules souches, la pharmacologie, la nutrition et la science cosmétique.

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Extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour analyse métabolomique par électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse

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