Détermination du niveau d’Expression de protéine dans des cellules cultivées par immunocytochimie sur des blocs de paraffine cellulaire

L’objectif global de cette procédure est d’analyser l’expression de marqueurs de prolifération d’intérêt par des analyses immunocytochimiques et histologiques d’amas de tissus intégrés dans des blocs cellulaires de thromboplastine-plasma. Cette méthode peut aider à répondre à la question clé sur la pathologie clinique du blocage cellulaire par les tissus. Le principal avantage de cette méthode alternative pour l’analyse immunocytochimique des blocs cellulaires inclus dans la paraffine est la simplicité technique des procédures.

Lorsqu’une boîte de 100 millimètres de culture cellulaire HeLa atteint la confluence, remplacez le surnageant par 10 millilitres de milieu de culture cellulaire HeLa sans FBS et remettez la boîte dans l’incubateur de culture cellulaire. Après 48 heures, lavez les cellules avec deux millilitres de PBS suivis d’une incubation dans deux millilitres de 0,25 % d’EDTA plus de trypsine pendant deux à trois minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction avec cinq millilitres de milieu complet et transférez la solution cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres.

Recueillir les cellules par centrifugation suivie de deux lavages dans deux millilitres de PBS froid par lavage. Après le deuxième lavage, remplacez le surnageant par un millilitre d’éthanol à 95 % et mélangez le granulé par vortex. Placez ensuite les cellules fixes sur de la glace.

Pour préparer un bloc cellulaire de paraffine, après avoir collecté du plasma EDTA à partir de sang de donneur sain, centrifugez les échantillons et transférez 200 à 400 microlitres d’aliquotes de plasma surnageant dans des tubes de microfuge individuels. Ensuite, ajoutez environ 200 microlitres de plasma, environ 200 microlitres de thromboplastine et environ 200 microlitres de chlorure de calcium 025 molaire aux cellules HeLa fixées. Laissez les mélanges former des caillots cellulaires à température ambiante pendant dix minutes, puis lavez les caillots deux fois avec un millilitre de PBS en décantant complètement les caillots sur des morceaux individuels de papier filtre humidifié au formol après le deuxième lavage.

Enveloppez les caillots dans le papier filtre et utilisez un jeu d’épingles pour placer les chiffons dans des cassettes de tissus individuelles au centre de quatre autres morceaux de papier humidifié au formol. Ensuite, placez les cassettes de tissus dans des bocaux en verre contenant 50 millilitres de formol tamponné pour une fixation nocturne au formol à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, chargez les cassettes dans un processeur de tissus pour l’évacuation de l’eau pendant la nuit et le conditionnement des cellules fixes.

Au moins une heure avant la fin de la procédure de traitement, allumez une station d’enrobage chauffée pour faire fondre la paraffine. Lorsque la station d’enrobage et le caillot sont prêts, confirmez la présence de paraffine fondue dans le moule métallique et transférez un caillot cellulaire formé dans la paraffine. Placez une nouvelle cassette de mouchoir sans couvercle dans le moule métallique et recouvrez la cassette de paraffine fondue.

Laissez la paraffine se solidifier dans une plaque froide pendant 30 à 60 secondes. Séparez ensuite la cassette de tissu du moule métallique. Pour préparer des coupes pour l’analyse immunocytochimique, localisez le caillot cellulaire dans un bloc de cellules de paraffine et utilisez un microtome pour couper le bloc en tranches de trois à quatre micromètres d’épaisseur.

Placez des sections de paraffine sur des lames de verre recouvertes de solution saline et placez les lames dans un four à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Lorsque les sections ont adhéré aux lames, déparaffiner les lames dans 15 millilitres de xylène pendant quatre minutes, puis déshydrater les sections avec des incubations séquentielles d’éthanol descendantes de deux minutes. Après l’incubation à 80 % d’éthanol, rincez les sections à l’eau courante pendant 10 minutes et faites bouillir les lames dans un bocal contenant 40 millilitres de tampon de récupération tris-EDTA pendant 30 minutes.

À la fin de l’incubation, laver les lames récupérées de l’antigène sous l’eau courante, suivie d’une incubation de 10 minutes dans de l’éthanol à 95 % à quatre degrés Celsius. Après le séchage à l’air, utilisez un stylo hydrophobe pour encercler la zone de coloration cellulaire sur chaque lame. Laver les lames dans du TBS-T, puis les incuber dans un bloc de peroxyde d’hydrogène pendant 15 minutes à température ambiante afin d’éliminer toute activité résiduelle de la peroxydase.

Lavez les lames trois fois dans du TBS-T pendant deux minutes à chaque lavage, puis étiquetez les sections avec 100 microlitres de mélange d’anticorps primaires du kit de coloration immunocytochimique d’intérêt pendant une heure, suivie de cinq lavages TBS-T de deux minutes. Après le dernier lavage, incubez les lames dans un activateur d’anticorps primaire du kit pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. À la fin de l’incubation, laver les sections quatre fois dans du TBS-T en ajoutant environ 200 microlitres d’anticorps secondaires marqués à la peroxydase de raifort après le dernier lavage pour une incubation de 30 minutes à température ambiante.

Lavez les sections améliorées cinq fois dans du TBS-T frais, puis ajoutez 100 microlitres de solution de diaminobenzidine par section pendant trois minutes. Lavez les lames deux fois dans du TBS-T et étiquetez les sections avec 100 microlitres de solution d’hématoxyline pendant une minute. Ensuite, lavez les lames une fois de plus dans du TBS-T et incubez les lames dans de l’éthanol à 95 % pendant deux minutes, puis un trempage dans de l’éthanol frais à 95 % et deux trempages dans de l’éthanol à 100 %.

Incuber les sections déshydratées à l’éthanol dans 40 millilitres de xylène dans un bocal en verre pendant cinq minutes et laisser les lames sécher à l’air. Fixez ensuite une lamelle sur chaque lame et observez les échantillons au microscope optique. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine du tissu inclus dans la paraffine, comme nous venons de le démontrer, révèle principalement dans les noyaux intacts et le cytoplasme, suggérant une excellente conservation morphologique des échantillons cellulaires par cette méthode.

Les blocs cellulaires mal préparés, cependant, présentent une mauvaise morphologie et un marquage irrégulier, même si les échantillons sont correctement colorés. La protéine deux associée au cytosquelette est généralement observée dans la chromatine condensée, le fuseau mitotique et le cytoplasme. Seules les cellules avec la coloration de la protéine deux associée au cytosquelette dans la chromatine condensée sont des cellules mitotiques, tandis que peu de cellules positives de la protéine deux associée au cytosquelette se trouvent dans la population de culture cellulaire HeLa affamée de sérum.

La plupart des cellules HeLa hautement mitotiques sont également positives au Ki-67 et une coloration au Ki-67 est observée dans les noyaux cellulaires. Seulement environ la moitié des cellules HeLa affamées de sérum expriment ce marqueur de prolifération. Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en six heures si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de diluer les cellules à une densité appropriée pour former un bon caillot. Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que l’analyse cytométrique en flux des cellules fixes, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la phase du cycle cellulaire pendant la synchronisation. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à un avenir dans le domaine de la pathologie hépatique pour explorer le profilage d’expression dans les lignées cellulaires tout en préservant les informations morphologiques dans les cellules cultivées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’immunocytochimie et de préparer des blocs de thromboplastine plasmatique à partir des cellules cultivées. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs dangereux comme le xylène peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et d’une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lors de cette procédure.