Name: Utilisation des larves de Zébrafish pour étudier les conséquences pathologiques de l’AVC hémorragique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Découvrez un protocole pour quantifier les lésions cérébrales et la neuroinflammation chez les larves de zèbre Danio rerio après hémorragie intracérébrale. Ce modèle préclinique permet l'imagerie en temps réel des réponses cellulaires.

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Nous aimerions remercier le Dr David Spiller et l’Université de Manchester Systems microscopie Core Facility pour l’utilisation de l’équipement, le Prof. Richard Baines pour l’utilisation de DanioVision et Dr. Jack Rivers-Auty pour la consultation statistique. La ligne BBH a été aimablement partagée par Nicole Munsie du laboratoire du Dr. Sarah Child à l’Université de Calgary. Nous remercions également le Prof. Stephen Renshaw, le Dr Adam Hurlstone, le Dr Andrew Badrock et le Dr Helen Young pour les lignes et l’équipement de poisson.
Cette étude a été appuyée par la NC3Rs (NC/N002598/1), Association AVC (TSA LECTI2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) et la British Heart Foundation (FS/15/67/32038). Nous sommes également particulièrement reconnaissants à la Natalie Kate Moss Trust et à la faculté de biologie, médecine et santé de l’Université de Manchester pour leur soutien financier continu.

Les zebrafish ont été élevés et maintenus à l’unité des services biologiques de l’Université de Manchester dans des conditions normales comme décrit précédemment21. L’élevage de zébrafish adultes a été approuvé par le Conseil de l’éthique et de la protection des animaux de l’Université de Manchester. Toutes les expériences ont été effectuées conformément au règlement du Royaume-Uni sur les bureaux à domicile (PPL: P132EB6D7).
NOTE: les lignées transgéniques utilisées dans cette étude comprennent la lignée de macrophage spécifique MPEG1:mCherry (construite en interne comme décrit précédemment22), MPO spécifique au neutrophile :GFP23, GATA1 spécifique à l'érythroid: DsRed24 et Ubiq:secannexinv-mvenus, un reporter pour la mort cellulaire (re-dérivé dans la maison25)sur les milieux Wild-type, nacre (mitfaW2/W2) et mutant (BBHM292). La figure 1 montre la chronologie expérimentale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figure 1 : Graphique de chronologie expérimentale pour caractériser les lésions cérébrales, les résultats locomoteurs et neuroinflammatoires. ICH, hémorragie intracérébrale; BBH, Bubblehead. La figure a été reproduite à partir de Crilly et al.20 avec la permission sous une licence Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 
1. jour 0: production et collecte des oeufs
<ol><li>Prélever des embryons fertilisés de la fraye naturelle dans des boîtes de reproduction produites à partir de 1 mâle et 1-2 femelle adulte zebrafish. Remarque: pour le protocole d’atorvastatine, tout animal sauvage/transgénique peut être utilisé mais les taux d’hémorragie diffèrent légèrement entre les souches.</li>
	<li>Incuber 100 embryons à 28 ° c dans un milieu embryonnaire E3 standard par boîte de Petri et par étape conformément aux directives standard26.</li>
	<li>À ~ 6 heures après la fertilisation (HPF), retirer les embryons morts et non fertilisés du plat à l’aide d’une pipette Pasteur.</li>
</ol>2. jour 1: traitement par atorvastatine à 24 HPF
<ol><li>Embryons de déchorionate pour traitement par atorvastatine à l’aide de forceps de dissection ultra-minces27. Les nombres requis pour l’expérimentation peuvent être ajustés en conséquence.</li>
	<li>Ajouter 30 mL de milieu embryonnaire E3 à deux boîtes de Petri propres. Utiliser un plat pour 100 embryons. NOTE: si les plaques sont conçues pour la culture cellulaire, le zébrafish déchorioné à ce stade précoce s’en tenir souvent au fond. Pour éviter cela, Rincez soigneusement les plaques dans de l’eau propre avant utilisation.</li>
	<li>Retirer 60 μL d’eau de l’embryon de la plaque de traitement et ajouter 60 μL de 0,5 mM d’atorvastatine (ATV). À une concentration de 0,5 mM, la dilution ci-dessus entraînera une concentration finale de 1 μM, ce qui entraînera environ 20% des larves non hémorragées (ICH-) et ~ 80% des larves hémorragies (ICH +). Utiliser l’autre plaque pour les contrôles non traités NOTE: l’atorvastatine est solubilisée dans l’eau distillée (3 mg dans 10 mL) pour fabriquer une solution d’action de 0,5 mM. Incuber la nuit à température ambiante dans l’obscurité avec agitation que la solubilisation prend un certain temps. La solubilisation complète peut prendre jusqu’à 1 semaine. N’utilisez pas DMSO. La solution est aliquotée et stockée à-20 ° c. Ne congelez pas le dégel.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer 100 embryons dans le moins d’eau possible aux plaques de traitement.</li>
	<li>Incuber les plaques à 28 ° c. Remarque: le PCI se produira entre 33 et 48 HPF. L’atorvastatine n’a pas besoin d’être enlevée car l’incubation de plus de 24 h ne provoque pas d’autres problèmes de développement.</li>
</ol>3. jour 2: séparation des populations ICH-et ICH + à 50 HPF
<ol><li>Séparez les poissons ICH + des populations ICH et transférez-les à de nouveaux plats pour plus de facilité.<ol>
<li>Si vous utilisez le modèle ATV à une concentration de 1 μM, 75-100% des larves présentent une hémorragie (ICH +) à ce moment-là. NOTE: la réponse des larves diffère entre les souches, si les larves ne sont pas une hémorragie aux fréquences souhaitées, utiliser un nouveau lot d’atorvastatine ou une concentration plus élevée. Si les larves n’ont pas présenté d’hémorragie par 48 HPF alors les considérer ICH-.</li>
		<li>Si vous utilisez le modèle BBH, tous les mutants homozygotes présentent une hémorragie par 48 HPF. En cas d’utilisation d’un incroisement hétérozygote, les frères et sœurs hétérozygotes et wildtypes de l’ICH peuvent être utilisés comme animaux témoins pour des expériences.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si nécessaire, anesthésier les larves en ajoutant 0,02% MS222 au support E3. À l’aide d’une pipette Pasteur, trier les larves pour la présence de sang dans la tête dans des milieux frais de l’E3. Voir la figure 2. NOTE: le sang dans la tête peut apparaître dans l’avant, le milieu ou le cerveau postérieur ou en combinaison, et le volume de saignement peut varier entre les animaux. Chez les mutants BBH, le PCI est souvent associé à un œdème sévère reconnaissable par des têtes plus larges, un espace plus large entre les yeux et un saignement plus diffus. Cependant, toutes les larves de l’ICH + BBH présentent un œdème.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> La figure 2 : Phénotypes ich + hémorragies cérébrales. Exemples de phénotypes de larves ICH maintenus sur un GATA1 transgénique: fond de nacre de reporter DsRed observé avec un stéréomicroscope de fond clair (panneaux supérieurs) et une fluorescence (panneau inférieur) à ~ 48 h après la fécondation. Aucune hémorragie n’a été observée chez les larves ICH (panneaux de gauche). Une accumulation distincte de globules rouges dans le cerveau antérieur et le cerveau postérieur (flèches) ont été observées chez les larves ICH + (panneaux de droite). Les barres d’échelle représentent 250 μm. la figure a été reproduite à partir de Crilly et al.20 avec la permission sous une licence Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 
4. jour 3: la mort cellulaire et l’analyse des leucocytes à 72 HPF
<ol><li>L’écran des larves à l’aide d’un microscope à fluorescence pour assurer l’expression de la protéine fluorescente. NOTE: dans cette étude, les larves transgéniques Ubiq: secannexinv-mvenus ont été utilisées pour signaler la mort des cellules cérébrales et le double MPOtransgénique: GFP; MPEG1: mCherry ou Ubiq: Secannexinv-mvenus; MPEG1: mCherry utilisé pour l’analyse des leucocytes.</li>
	<li>Remplissez la chambre de montage lightsheet avec un support E3 contenant 0,02% MS222.</li>
	<li>Anesthésiez les larves à l’aide de 0,02% MS222. Transférer les larves pour le montage (n = 1-6) sur une surface de boîte de Petri sèche en une seule gouttelette. Enlevez le plus de liquide possible. NOTE: 1,5% de l’d’agarose à faible taux de fonte est préparée à l’aide de 0,15 g d’d’agarose à faible fonte dissous dans 10 mL de milieu E3 sans bleu de méthylène dans un four à micro-ondes et maintenu à 45 ° c jusqu’à son utilisation.</li>
	<li>Ajouter une goutte de 1,5% d’d’agarose à faible fonte (maintenue sous forme de liquide dans un bloc de chaleur de 45 ° c) aux larves et en utilisant un capillaire de montage de 800 μm, et tirer les larves vers le haut de la tête en premier. Si le positionnement n’est pas précis, les larves peuvent être expulsées de l’d’agarose et montées à nouveau. Laisser refroidir le capillaire avant de l’insérer dans la chambre de la lightsheet. Remarque: alternativement, un microscope confocale pourrait être utilisé pour cette procédure. Pour cela, les larves doivent être montées latéralement en d’agarose sur un plat de fond de verre.</li>
	<li>Acquérir des images z-Stack de la tête entre les lentilles oculaires (~ 300 μm) et le processus à l’image de projection d’intensité maximale.<ol>
<li>Analysez la région du cerveau à partir d’images recueillies pour le nombre total de cellules fluorescentes et la fluorescence d’intensité totale20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Créez une vidéo de laps de temps de plusieurs composites de projection sur 18-24 h pour suivre la mobilité des leucocytes et l’interaction avec les cellules mourantes. Remarque: si l’imagerie en direct à long terme est exécutée, une seule larve est montée dans le capillaire.</li>
	<li>Lorsque l’imagerie est terminée expulser les larves du capillaire de montage en une overdose létale de 4% MS222 à euthanasier.</li>
</ol>5. jour 3: sélection des larves pour le dosage de la motilité à 72 HPF
<ol><li>Anesthésier les larves dans les boîtes de Petri avec 0,02% MS222.</li>
	<li>Sélectionner au hasard n = 24 larves pour le dosage de la motilité et transférer dans des milieux frais de l’E3 et permettre aux animaux de se rétablir de l’anesthésique. Remarque: anesthésique à ce stade élimine le biais de sélection pour les nageurs lents qui sont faciles à attraper.</li>
</ol>6. jour 3-5: Assaying locomotion à 72, 96 et 120 HPF
<ol><li>Transférer les larves sélectionnées à 72 HPF en milieu E3 sans bleu de méthylène. Remarque: pour l’dosage à 3 DPF, les larves ont amplement le temps de se remettre de l’anesthésique (&gt; 1 h).</li>
	<li>Plaque une larve dans 1 mL par puits d’une plaque de 24 puits à l’aide d’une pipette. Remarque: Coupez l’extrémité de l’embout de la pipette pour éviter d’endommager les larves. La taille de la plaque peut être changée selon la conception expérimentale.</li>
	<li>Chargez les plaques dans la chambre de la caméra et le mouvement de dosage pendant 10 min en utilisant une routine de lumière blanche sursaut pour augmenter la natation spontanée. Remarque: le comportement de natation a été suivi à l’aide d’une chambre de caméra et d’un logiciel de suivi (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Répéter l’expérience avec les mêmes larves à 96 et 120 HPF. Déplacer les larves du logement individuel dans la plaque de dosage vers une boîte de Petri et incuber à 28 ° c entre les dosages.</li>
	<li>À l’achèvement du dosage, euthanasier les larves dans une surdose létale de 4% MS222.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette étude montre que le PCI dans les larves de zébrafish induit une réponse aux lésions cérébrales qui récapitule les aspects clés de la condition humaine qui peuvent être systématiquement analysés et quantifiés. Le zébrafish offre un modèle cohérent et reproductible de l’ICH spontané qui aidera les études futures d’intervention médicamenteuse axées sur le ciblage des lésions cérébrales induites par le sang, plutôt que d’empêcher la rupture des vaisseaux17,28. En effet, étant donné le caractère rapide de l’apparition de la maladie qui s’apparente à la situation clinique, une telle approche offre des perspectives intéressantes pour une traduction réussie à l’avenir.
Certaines limitations sont associées à l’utilisation de larves de zébrafish, comme l’utilisation d’un système en développement et le classement taxonomique, mais les avantages pratiques et scientifiques de ce modèle doivent être considérés comme offrant de nouvelles perspectives sur le PCI. Aucune intervention chirurgicale n’est nécessaire pour déclencher une hémorragie ou pour surveiller les processus cellulaires pendant de longues périodes de temps après une blessure. La fécondité élevée des appariements de zébrafish génère des tailles d’échantillon facilement accessibles et de grande taille, et en raison du développement rapide des larves, la chronologie expérimentale est significativement réduite par rapport aux études de rongeurs29,30.
Actuellement, ces modèles sont aptes à être utilisés pour élucider la réponse pathologique et immunologique immédiate au PCI spontané dans le cerveau des animaux vivants intacts. Potentiellement, ce modèle peut être adapté pour les écrans de médicaments à moyen-haut débit pour les thérapies ICH, qu’ils soient préventifs ou valorisant la valorisation. Ainsi, les pathologies post-ICH présentées dans cette étude représentent une plate-forme alternative et complémentaire pour la recherche préclinique du PCI.

L’hémorragie intracérébrale (ICH) est le sous-type le plus sévère de l’AVC associé à la rupture spontanée des vaisseaux cérébraux et aux saignements dans le parenchyme entraînant des lésions cérébrales, une déficience physique et souvent la mort1. Malgré le taux élevé de mortalité et de morbidité associé à l’ICH2, la compréhension de l’étiologie sous-jacente et de la pathologie post-hémorragique fait encore défaut. En tant que tel, il n’y a pas de traitements spécifiques pour prévenir le PCI ou améliorer les résultats des patients. La plupart de notre compréhension de la biologie de la maladie est venu de modèles de rongeurs pré-cliniques de ich3, cependant les études à ce jour dans ces modèles n’ont pas réussi à traduire n’importe quel thérapeutique réussie à la clinique4,5. Cet échec peut être dû en partie à certaines limitations de ces modèles précliniques, y compris l’incapacité de récapituler facilement la nature spontanée de la maladie humaine et l’exigence d’une chirurgie invasive pour générer les modèles chez les mammifères6. En outre, les rongeurs posent des problèmes pratiques en ce qui concerne l’observation de l’apparition rapide des réponses cellulaires au PCI dans les tissus intacts. Étant donné le manque de traduction des modèles de rongeurs, le développement de modèles alternatifs de PCI spontané est impératif si nous voulons surmonter ces problèmes pratiques et aider à identifier de nouveaux objectifs de drogue.
Les mécanismes moléculaires du développement vasculaire sont bien conservés parmi les vertébrés, y compris le zébrafish (Danio rerio)7. En tant que tel, l’adoption de cet organisme modèle devient une stratégie mécaniste de plus en plus utile pour l’étude de la maladie cérébro-vasculaire8. Un certain nombre de modèles de zébrafish ont été générés qui récapitulent les phénotypes associés aux affections liées aux AVC9,10,11,12. L’utilisation de larves de zébrafish pour enquêter sur la pathogenèse des maladies offre des avantages pratiques et scientifiques sur les modèles de mammifères8. Cela inclut des taux de reproduction élevés, un développement rapide et une transparence larvaire qui permet l’imagerie intravitale sans les contraintes invasives associées aux rongeurs. Le couplage de ces avantages avec le large éventail de lignes transgéniques de reporter disponibles dans la communauté de recherche poisson zèbre équivaut à une puissante approche in vivo pour l’étude de la biologie des maladies, non encore utilisée pour l’étude de la pathologie conséquences du PCI.
La réponse de blessure au sang dans le cerveau est biphasique13; l’insulte primaire provoque la mort neuronale et la nécrose cellulaire, qui déclenche alors une vague secondaire de dommages qui est induite par l’activation immunitaire innée. La deuxième phase de lésion cérébrale, en particulier la composante neuroinflammatoire, est considérée comme une cible réaliste pour le traitement futur des médicaments13. Des hémorragies spontanées et cérébrales spécifiques ont été décrites dans les larves de zébrafish précédemment14,15,16,17,18,19. Deux de ces modèles sont l’utilisation de l’atorvastatine (ATV) à 24 h après la fécondation (HPF) pour inhiber la voie du HMGCR et la biosynthèse du cholestérol14, et un mutant de la tête de andouille (BBH) qui expriment une mutation hypomorphe dans le gène arhgef7 , βpix, et inhibe ensuite le remodelage de l’actine pour les jonctions endovasculaires serrées18. Ces modèles présentent une rupture spontanée du vaisseau sanguin spécifique au cerveau au début de la circulation (~ 33 HPF). Récemment, nous avons caractérisé ces modèles plus loin pour révéler que les aspects clés de la réponse aux lésions cérébrales sont conservés entre les humains et les larves de zébrafish20. Cette étude démontre la méthodologie nécessaire pour obtenir et visualiser les hémorragies cérébrales spontanées chez les larves de zébrafish et comment quantifier les lésions cérébrales, et les phénotypes locomoteurs et neuroinflammatoires qui se rapportent à la condition humaine. Ces données et techniques appuient l’utilisation de cette espèce modèle comme un système complémentaire précieux pour la recherche préclinique du PCI.

<table><tbody><tr><td>24 plaques de puits</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>28 &deg ; C incubateur</td><td>LMS</td><td>210</td><td></td></tr><tr><td>Atorvastatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PZ0001-5mg</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes d’élevage</td><td>Thoren Aquatics systems</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>Daniovision chambre d’observation</td><td>Noldus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>E3 medium 1x</td><td></td><td></td><td>4 % Instant Ocean, 500 &micro ; L bleu de méthylène en 1 L dH2O</td></tr><tr><td>Logiciel EthoVision XT</td><td>Noldus</td><td>version 11</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>Grant-Bio</td><td>PHMT-PSC18</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à feuille de lumière</td><td>Zeiss</td><td>Z.1</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à feuille de lumière à montage</td> capillaire <td>Zeiss</td><td>402100-9320-000</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319112-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Microscope&nbsp ;</td><td>Microscope de dissection</td> <td>Leica</td><td>MZ95</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Microscope fluorescent Leica</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>MS222</td><td></td><td></td><td>4g de poudre de tricaïne, 500 mL de dH2O, 10 mL de 1 M de Tris (pH 9). Ajuster le pH à ~7</td></tr><tr><td>Pipette P1000</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pointes de pipette</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur</td><td>Starlab</td><td>E1414-0300</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Corning</td><td>101VR20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra Biosciences</td><td>PIPETBOY</td><td></td></tr><tr><td>Stripette 25ml</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine poudre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection ultra fine</td><td>Agar scientific</td><td>AGT502</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Zen</td><td>Zeiss</td><td>version 2.3</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation des larves de zébrafish pour étudier les conséquences pathologiques de l’avc hémorragique

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

En dépit d’être le sous-type le plus sévère de l’AVC avec une mortalité mondiale élevée, il n’y a pas de traitement spécifique pour les patients atteints d’hémorragie intracérébrale (ICH). La modélisation du PCI pré-clinique a prouvé qu’il était difficile, et les modèles actuels de rongeurs ont peu récapitulé la nature spontanée du PCI humain. Par conséquent, il existe une exigence urgente pour les méthodologies précliniques alternatives pour l’étude des mécanismes de la maladie dans le PCI et pour la découverte potentielle de médicaments.
L’utilisation du zébrafish représente une approche de plus en plus populaire pour la recherche translationnelle, principalement en raison d’un certain nombre d’avantages qu’ils possèdent sur les modèles de maladie de mammifères, y compris les taux de reproduction prolifique et la transparence larvaire permettant de vivre Imagerie. D’autres groupes ont établi que les larves de zébrafish peuvent présenter une ICH spontanée suite à une perturbation génétique ou chimique du développement cérébro-vasculaire. L’objectif de cette méthodologie est d’utiliser de tels modèles pour étudier les conséquences pathologiques de l’hémorragie cérébrale, dans le contexte de la recherche préclinique du PCI. En utilisant des tests d’imagerie et de motilité en direct, les lésions cérébrales, la neuroinflammation et la fonction locomotrice suivant le PCI peuvent être évaluées et quantifiées.
Cette étude montre que les principales conséquences pathologiques de l’hémorragie cérébrale chez l’homme sont conservées dans les larves de zébrafish soulignant l’organisme modèle comme un précieux système in vivo pour l’investigation préclinique du PCI. L’objectif de cette méthodologie est de permettre à la communauté des AVC précliniques d’employer le modèle larvaire du zébrafish comme système de modèle complémentaire alternatif aux rongeurs.

L’évaluation de la mort des cellules cérébrales à l’aide d' Ubiqtransgénique: secannexinv-mvenus aboutit à des grappes claires et définitives de cellules mourantes dans les larves ICH + dans les modèles ATV et BBH qui sont absents chez toutes les larves de l’ICH (figure 3). Les grappes se retirent avant 96 HPF. Grâce à l’analyse d’image, le saignement est associé à une augmentation significative de deux fois de l’intensité totale du signal de fluorescence dans le cerveau, indiquant la mort cellulaire marquée.
Une réponse neuroinflammatoire est identifiée chez les larves ICH + en augmentant significativement le nombre de cellules macrophages positives MPEG1 dans le cerveau. Le nombre total de cellules neutrophiles positives du MPO a également augmenté, mais cela n’a pas atteint une signification statistique (figure 4). La morphologie des macrophages positifs MPEG1 peut également être observée pour changer dans les larves ich + que les cellules adoptent une forme active, arrondie, amiboïde. Ces cellules arrondies activées peuvent également être surveillées au fil du temps pour montrer une réponse phagocytaire accrue de l' Ubiq:secannexinv-mvenus exprimant des cellules mourantes dans les larves ICH + (figure 5). les macrophages positifs de MPEG1 présentant des processus ramifiés ont été classés comme inactifs.
L’hémorragie cérébrale est associée à une diminution significative de la motilité à 72 et à 96 HPF par rapport aux témoins des frères et sœurs de l’ICH dans les modèles BBH et ATV (figure 6). La motilité à 120 HPF récupère à des niveaux de base proches. Il y a souvent des différences dans la motilité de base entre les embrayages et les souches d’oeufs et donc la comparaison doit être faite à ICH-contrôles à chaque fois.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig3.jpg"> Figure 3 : L’hémorragie intracérébrale (ICH) chez les larves de zébrafish entraîne une lésion cérébrale quantifiables. (A) des images représentatives du phénotype des lésions cérébrales dans les larves ICH + (panneaux de droite), comparativement à l’ICH-frères et sœurs (panneaux de gauche), à 72 HPF. Les images Brightfield (panneaux inférieurs, barre d’échelle = 250 μM) démontrent la présence de saignements cérébraux (flèches) dans les larves ICH +. La microscopie fluorescente a été réalisée pour visualiser la mort cellulaire dans la ligne de reporter Ubiq:secannexinv-mvenus (panneaux supérieurs, barre d’échelle = 100 μM). Des grappes de cellules mourantes ont été observées dans les régions péri-hématatomales. Les images ont été rognées dans des régions uniquement cérébrales et analysées pour l’intensité totale de fluorescence verte dans des particules rondes de plus de 30 pixels de diamètre (ligne blanche) à l’aide de la macro dans le fichier supplémentaire 1. (B) quantification du signal de fluorescence dans le cerveau des larves non traitées, ICH-et ICH + obtenues par le modèle ATV (n = 12 par groupe; 3 réplicats indépendants) à 72 HPF. Des différences significatives ont été observées lors de la comparaison de ICH + avec des frères et sœurs (* * p = 0,004) non traités et avec des fratries ICH-(* p = 0,03). Cquantification du signal de fluorescence en lecture pour annexinv liaison dans le cerveau des larves ICH-et ICH + obtenues par le modèle de la tête de Bubble(BBH) (n = 12 par groupe; 2 répliques indépendantes) à 72 HPF. Les graphiques montrent la SD de la moyenne. Une différence significative dans la fluorescence de mVenus a été observée entre ICH + et ICH-frères et sœurs appariés à l’âge (* * p = 0,002). La figure a été reproduite à partir de Crilly et al.20 avec la permission sous une licence Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig4.jpg"> Figure 4 : L’hémorragie intracérébrale (ICH) déclenche une réponse immunitaire cellulaire innée dans le cerveau larvaire des larves de zébrafish. Nombre de leucocytes quantifiés dans les régions cérébrales précédemment décrites pour MPO: GFP; MPEG1: dsRed double larves transgéniques (n = 8 par groupe; 2 répliques indépendantes) à 72 HPF révèle une augmentation significative des macrophages (* p = 0,01), mais pas des neutrophiles (p = 0,5), en réponse au PCI. La figure a été reproduite à partir de Crilly et al.20 avec la permission sous une licence Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig5.jpg"> Figure 5 : Les cellules de macrophages activées montrent une réponse phagocytaire à la lésion cérébrale. A) alambics représentatifs de temps-Lapse20 montrant un macrophages de patrouille ramifié migrant vers une cellule positive annexinv (i-VI). Les alambics sont obtenus à partir d’une série d’images prises de l’ensemble du cerveau à l’aide d’un objectif 20x. La barre d’échelle représente 50 μM. Le macrophages a acquis une morphologie amoeboïde (v) avant de phagocytants la cellule d’annexinv-positive (VI, VII). Après la phagocytose, le macrophages reprend une morphologie ramifiée et migse loin et la cellule annexinV-positive ne peut plus être observée (VIII). Un macrophages ramifié (#), une cellule positive annexinv (flèche), un macrophages amiboïde (*) sont indiqués. Bdes images représentatives de cellules positives au MPEG1dans le cerveau larvaire ICH-et ICH + présentant des morphologies amoeboïdes et ramifiées. Les barres d’échelle représentent 50 μM. (C) une proportion accrue d’amiboïdes (phagocytaires) et une diminution de la proportion de macrophages ramifiés (inactifs) ont été observées dans les cerveaux ich + par rapport aux frères et sœurs ich. La figure a été reproduite à partir de Crilly et al.20 avec la permission sous une licence Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig6.jpg"> Figure 6 : Les lésions cérébrales induites par le PCI se traduit par un déficit locomoteur quantifiables chez les larves de zébrafish. A) des exemples représentatifs des voies de baignade des larves de BBH ICH-et ICH + à 72, 96 et 120 HPF. (B) les larves de ich + ont montré une diminution significative du temps cumulatif passé pendant la période d’enregistrement de 10 min à la fois 72 et 96 HPF. La signification a été perdue au point de temps de 120 HPF, ce qui pourrait faire allusion à la récupération des lésions cérébrales (n = 24 larves par groupe; 3 répliques indépendantes; * * * * p = 0,00006; * * p = 0,003; NS: p = 0,08). Cquantification du temps cumulatif de déplacement des larves de ICH-et ICH + non traitées et traitées à l’ATV à 120 HPF. Les larves de ICH + ont montré une diminution significative du temps cumulatif de mobilité pendant la période d’enregistrement de 10 min. Trois réplicats techniques (n = 24 larves par groupe) ont été utilisés pour calculer la SD à partir de la moyenne (* * * p = 0,00004, * * p = 0,0003). La figure a été reproduite à partir de Crilly et al.20 avec la permission sous une licence Creative Commons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 
Dossier supplémentaire 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/Supplementary_File_1-Macro.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous présentons ici un protocole pour quantifier les lésions cérébrales, les déficits locomoteurs et la neuroinflammation suite à des saignements dans le cerveau chez les larves de zébrafish, dans le contexte de l’hémorragie intracérébrale humaine (ICH).

Utilisation des larves de Zébrafish pour étudier les conséquences pathologiques de l’AVC hémorragique

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Cette méthode fournit une approche préclinique complémentaire pour étudier la réponse cellulaire immédiate au sang dans le cerveau à la suite d’un accident vasculaire cérébral hémorragique, une condition très grave pour laquelle nous n’avons pas de médicaments spécifiques disponibles pour les patients. Contrairement aux modèles de rongeurs, la transparence des larves de poisson zèbre nous permet d’observer les réponses cellulaires dans le cerveau des animaux vivants intacts en temps réel à l’aide d’une microscopie fluorescente. Pour commencer, utilisez une passoire à thé pour recueillir tous les embryons fécondés de frai naturel dans des boîtes de reproduction produites à partir d’un mâle et d’un à deux poissons zèbres adultes femelles.Transférer 100 embryons dans chaque boîte de Pétri contenant un milieu embryonnaire E3 standard. Incuber à 28 degrés Celsius et étape selon les lignes directrices standard. À six heures après la fécondation, retirer les embryons morts et non fécondés du plat à l’aide d’une pipette Pasteur et remettre la vaisselle dans l’incubateur.À 24 heures après la fécondation, sous un microscope stéréo à champ lumineux, utilisez des forceps de dissection ultra minces pointus pour décorionner les embryons pour le traitement à l’atorvastatine. Ajouter ensuite 30 millilitres d’embryons E3 moyens à deux boîtes de Petri propres, l’une pour le traitement et l’autre pour le contrôle. Retirer 60 microlitres d’eau embryonnaire du plat de traitement et ajouter 60 microlitres d’atorvastatine de 0,5 millimolaire pour atteindre 80% des larves hémorragées.À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer 100 embryons dans le moins d’eau possible à chaque plat. Incuber les deux plats à 28 degrés Celsius. À tout moment, après 50 heures après la fécondation, au microscope, utilisez une pipette Pasteur pour séparer soigneusement les poissons hémorraillés des populations non hémorraillées et transférer les larves dans de nouveaux plats contenant des supports E3 frais.Pour faciliter la séparation des larves positives d’hémorragie, vous pouvez utiliser des poissons sans pigment ou des poissons qui expriment des protéines fluorescentes dans les globules rouges. Le troisième jour, sous un microscope fluorescent, les larves s’assurent de l’expression des protéines fluorescentes. Remplissez ensuite la chambre de montage de feuille de lumière avec des supports E3 contenant 0,2%MS-222 pour l’anesthésie.À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer une gouttelette unique contenant une à six larves sur une surface sèche de boîte de Pétri pour le montage. Utilisez une pipette pour enlever autant de liquide que possible. Ajoutez une goutte de 1,5 % d’agarose de fonte faible du bloc thermique de 45 degrés Celsius aux larves et utilisez un capillaire de montage de 800 micromètres pour attirer les larves la tête la première.Si le positionnement n’est pas exact, expulser les larves de l’agarose et monter à nouveau. Laisser refroidir le capillaire, puis insérer dans la chambre de feuille de lumière. Sur le logiciel d’imagerie ZEN, appuyez en continu pour orienter les larves et la presse acquérir pour acquérir des images z-stack de la tête entre les lentilles oculaires.Dans l’onglet traitement, générer une image de projection d’intensité maximale à partir de chaque z-stack. Pour sélectionner au hasard l’analyse de motilité, transférez 24 larves après l’anesthésie dans des supports E3 frais et permettez aux animaux de se remettre de l’anesthésie. Après que les larves se soient complètement remises de l’anesthésie, à l’aide d’une pipette avec le transfert coupé fin, les larves récupérées dans le milieu E3 sans bleu méthylène.Plaque une larve en un millilitre par puits d’une plaque de puits de 24 puits. Chargez la plaque dans la chambre de la caméra. Dans le logiciel de suivi EthoVision XT, ajustez les paramètres de l’expérience pour configurer une routine de sursursage de lumière blanche pour augmenter la natation spontanée et le mouvement d’essai pendant 10 minutes.Répétez l’essai de locomotion à 96 et 120 heures après la fertilizatine. L’évaluation de la mort des cellules cérébrales à l’aide d’une lignée de reporter veineux annexin V M sécrété par ubiquitine transgénique entraîne des grappes claires et définitives de cellules mourantes chez les larves hémorragées qui sont absentes dans toutes les larves non hémorragées indiquées par des images vertes de fluorescence dans les champs lumineux démontrent la présence de saignements cérébraux. Des cellules mourantes ont été observées dans les modèles d’atorvastatine et de tête de bulle pour les larves hémorraillées.La morphologie des macrophages positifs MPEG1 modifie les larves positives d’hémorragie intracerbrale à mesure que les cellules adoptent en forme amoeboid arrondie active. Ces cellules arrondies activées ont été surveillées au fil du temps pour montrer une réponse phagocytique accrue de l’ubiquitine sécrété Annexin V M veineux exprimant les cellules mourantes dans les larves positives d’hémorragie intracerbrale. L’hémorragie cérébrale est associée à une diminution significative de la motilité à 72 et 96 heures après la fécondation par rapport aux contrôles négatifs d’hémorragie intracerbrale de frère.La motilité à 120 heures après la fécondation se rétablit à des niveaux proches de la ligne de base. L’aspect le plus important de cette procédure est de s’assurer d’examiner en profondeur les larves pour la présence ou l’absence d’hémorragies cérébrales avant de procéder aux tests de phénotypage. Ce modèle peut également être utilisé pour le dépistage des médicaments afin de déterminer si la gravité du phénotype peut être améliorée après un saignement, une approche qui pourrait nous amener à identifier de nouveaux candidats médicaments à l’avenir.Cette technique nous permet d’explorer les réponses cellulaires immédiatement après un saignement dans le cerveau au cours d’un moment qui a été si notoirement difficile à étudier avant maintenant. Bien qu’aucun des reagents ou instruments décrits dans ce protocole ne soit spécifiquement dangereux, des précautions et des précautions standard doivent être prises tout au long de chaque fois que vous utilisez des produits chimiques, des objets tranchants ou des lasers.

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