Utilisation des larves de Zébrafish pour étudier les conséquences pathologiques de l’AVC hémorragique

Nous présentons ici un protocole pour quantifier les lésions cérébrales, les déficits locomoteurs et la neuroinflammation suite à des saignements dans le cerveau chez les larves de zébrafish, dans le contexte de l’hémorragie intracérébrale humaine (ICH).

Cette méthode fournit une approche préclinique complémentaire pour étudier la réponse cellulaire immédiate au sang dans le cerveau à la suite d’un accident vasculaire cérébral hémorragique, une condition très grave pour laquelle nous n’avons pas de médicaments spécifiques disponibles pour les patients. Contrairement aux modèles de rongeurs, la transparence des larves de poisson zèbre nous permet d’observer les réponses cellulaires dans le cerveau des animaux vivants intacts en temps réel à l’aide d’une microscopie fluorescente. Pour commencer, utilisez une passoire à thé pour recueillir tous les embryons fécondés de frai naturel dans des boîtes de reproduction produites à partir d’un mâle et d’un à deux poissons zèbres adultes femelles.

Transférer 100 embryons dans chaque boîte de Pétri contenant un milieu embryonnaire E3 standard. Incuber à 28 degrés Celsius et étape selon les lignes directrices standard. À six heures après la fécondation, retirer les embryons morts et non fécondés du plat à l’aide d’une pipette Pasteur et remettre la vaisselle dans l’incubateur.

À 24 heures après la fécondation, sous un microscope stéréo à champ lumineux, utilisez des forceps de dissection ultra minces pointus pour décorionner les embryons pour le traitement à l’atorvastatine. Ajouter ensuite 30 millilitres d’embryons E3 moyens à deux boîtes de Petri propres, l’une pour le traitement et l’autre pour le contrôle. Retirer 60 microlitres d’eau embryonnaire du plat de traitement et ajouter 60 microlitres d’atorvastatine de 0,5 millimolaire pour atteindre 80% des larves hémorragées.

À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer 100 embryons dans le moins d’eau possible à chaque plat. Incuber les deux plats à 28 degrés Celsius. À tout moment, après 50 heures après la fécondation, au microscope, utilisez une pipette Pasteur pour séparer soigneusement les poissons hémorraillés des populations non hémorraillées et transférer les larves dans de nouveaux plats contenant des supports E3 frais.

Pour faciliter la séparation des larves positives d’hémorragie, vous pouvez utiliser des poissons sans pigment ou des poissons qui expriment des protéines fluorescentes dans les globules rouges. Le troisième jour, sous un microscope fluorescent, les larves s’assurent de l’expression des protéines fluorescentes. Remplissez ensuite la chambre de montage de feuille de lumière avec des supports E3 contenant 0,2%MS-222 pour l’anesthésie.

À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer une gouttelette unique contenant une à six larves sur une surface sèche de boîte de Pétri pour le montage. Utilisez une pipette pour enlever autant de liquide que possible. Ajoutez une goutte de 1,5 % d’agarose de fonte faible du bloc thermique de 45 degrés Celsius aux larves et utilisez un capillaire de montage de 800 micromètres pour attirer les larves la tête la première.

Si le positionnement n’est pas exact, expulser les larves de l’agarose et monter à nouveau. Laisser refroidir le capillaire, puis insérer dans la chambre de feuille de lumière. Sur le logiciel d’imagerie ZEN, appuyez en continu pour orienter les larves et la presse acquérir pour acquérir des images z-stack de la tête entre les lentilles oculaires.

Dans l’onglet traitement, générer une image de projection d’intensité maximale à partir de chaque z-stack. Pour sélectionner au hasard l’analyse de motilité, transférez 24 larves après l’anesthésie dans des supports E3 frais et permettez aux animaux de se remettre de l’anesthésie. Après que les larves se soient complètement remises de l’anesthésie, à l’aide d’une pipette avec le transfert coupé fin, les larves récupérées dans le milieu E3 sans bleu méthylène.

Plaque une larve en un millilitre par puits d’une plaque de puits de 24 puits. Chargez la plaque dans la chambre de la caméra. Dans le logiciel de suivi EthoVision XT, ajustez les paramètres de l’expérience pour configurer une routine de sursursage de lumière blanche pour augmenter la natation spontanée et le mouvement d’essai pendant 10 minutes.

Répétez l’essai de locomotion à 96 et 120 heures après la fertilizatine. L’évaluation de la mort des cellules cérébrales à l’aide d’une lignée de reporter veineux annexin V M sécrété par ubiquitine transgénique entraîne des grappes claires et définitives de cellules mourantes chez les larves hémorragées qui sont absentes dans toutes les larves non hémorragées indiquées par des images vertes de fluorescence dans les champs lumineux démontrent la présence de saignements cérébraux. Des cellules mourantes ont été observées dans les modèles d’atorvastatine et de tête de bulle pour les larves hémorraillées.

La morphologie des macrophages positifs MPEG1 modifie les larves positives d’hémorragie intracerbrale à mesure que les cellules adoptent en forme amoeboid arrondie active. Ces cellules arrondies activées ont été surveillées au fil du temps pour montrer une réponse phagocytique accrue de l’ubiquitine sécrété Annexin V M veineux exprimant les cellules mourantes dans les larves positives d’hémorragie intracerbrale. L’hémorragie cérébrale est associée à une diminution significative de la motilité à 72 et 96 heures après la fécondation par rapport aux contrôles négatifs d’hémorragie intracerbrale de frère.

La motilité à 120 heures après la fécondation se rétablit à des niveaux proches de la ligne de base. L’aspect le plus important de cette procédure est de s’assurer d’examiner en profondeur les larves pour la présence ou l’absence d’hémorragies cérébrales avant de procéder aux tests de phénotypage. Ce modèle peut également être utilisé pour le dépistage des médicaments afin de déterminer si la gravité du phénotype peut être améliorée après un saignement, une approche qui pourrait nous amener à identifier de nouveaux candidats médicaments à l’avenir.

Cette technique nous permet d’explorer les réponses cellulaires immédiatement après un saignement dans le cerveau au cours d’un moment qui a été si notoirement difficile à étudier avant maintenant. Bien qu’aucun des reagents ou instruments décrits dans ce protocole ne soit spécifiquement dangereux, des précautions et des précautions standard doivent être prises tout au long de chaque fois que vous utilisez des produits chimiques, des objets tranchants ou des lasers.