Modélisation de toxicité amyloïde-β42 et neurodégénérescence dans le cerveau de poisson-zèbre adulte

L’objectif global de cette méthode est de synthétiser les peptides de l’amyloïde bêta-42 et de les injecter dans le cerveau du poisson-zèbre adulte, afin de générer un modèle particulier de doses d’amyloïde comme on le voit dans la maladie d’Alzheimer. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions importantes dans le domaine des neurosciences, telles que l’effet de la toxicité amyloïde sur les cellules souches neurales, et comment nous pouvons susciter la réponse de rajeunissement dans des conditions aussi préjudiciables. Les principaux avantages de cette technique sont son rapport, elle est reproductible et les phénotypes que nous obtenons rappellent fortement la maladie d’Alzheimer dans le cerveau humain.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la maladie d’Alzheimer car elle fournit un modèle naturel de vertébré, capable d’activer les cellules souches neurales dans l’état de la maladie, donc le poisson-zèbre peut nous apprendre à récupérer la neurodégénérescence. Pour préparer le peptide bêta-amyloïde 42, chargez un synthétiseur peptidique automatisé avec 500 milligrammes de résine protégée par FMOC en tant que phase solide. Chargez ensuite 0,5 molaire d’acides aminés protégés par FMOC dissous dans le volume requis, tel que calculé pour le synthétiseur respectif.

Utilisez le diméthylformamide de DMF pour dissoudre l’activation HBTU à une concentration de 0,48 molaire. Ajouter ensuite 45 % de volume par volume de méthylmorpholine ou NMM, la base et 5 % de volume par volume, d’anhydride acide, le mélange de bouchage, dans du DMF. Chargez les réactifs préparés dans le synthétiseur et exécutez le synthétiseur automatisé pour la synthèse en phase solide du peptide.

Une fois les cycles de synthèse des peptides terminés sur le synthétiseur, cliver les peptides, en transférant la résine dans un tube de réaction et en ajoutant 10 millilitres d’un mélange de clivage fraîchement préparé, composé de ce qui suit. Ensuite, mélangez continuellement le support solide dans le mélange de clivage pendant quatre heures, pour séparer les peptides du support solide. Précipitez le produit clivé en ajoutant le mélange de clivage à 100 millilitres d’éther diéthylique glacé

Faites passer la solution dans une unité de filtration contenant un filtre en PTFE avec une taille de pores de 0,45 micromètre. Ensuite, récupérez le peptide filtré du papier filtre. Et dissoudre 100 milligrammes de peptide précipité dans 5 millilitres de solution 1:1 d’acétonitrile, et distiller de l’eau désionisée, et vortex pour dissoudre le peptide brut.

Ensuite, pour purifier le peptide, via HPLC à base inversée, préparez un semi préparé de HPLC, équipé d’une colonne poreuse de polystyrène divinylbenzène de taille battue 10 micromètres. Préchauffez la colonne à l’aide d’une unité de chauffage de colonne, pour maintenir la colonne à 50 degrés Celsius. Appliquez le peptide sur la colonne et collectez toutes les fractions principales à l’aide d’un collecteur de fractions automatisé.

En appliquant un gradient de 5 % à 100 % d’acrylonitrile à raison de quatre millilitres par minute pendant 25 minutes. Surveillez le chromatogramme à 220 nanomètres, collectez les pics appropriés et analysez les résultats à l’aide du LCMS. Les principales fractions collectées sont transférées dans des flacons d’échantillons et chargées sur une machine LCMS pour un contrôle analytique.

Les échantillons sont surveillés à l’aide d’un détecteur UV, tout en passant l’échantillon dans une colonne analytique de l’équipe CA de taille betterave de 1,7 micromètre. Les fractions correctes sont identifiées par spectrométrie de masse. Lyophilisez les fractions correctes du peptide souhaité en une poudre moelleuse, dans une fiole à fond rond, en appliquant un vide de 0,052 millibar.

Couplez la pompe à vide à une unité de congélation, maintenue à moins 78 degrés Celsius. Stockez ensuite la poudre lyophilisée indéfiniment à moins 80 degrés Celsius. Utilisez le peptide lyophilisé pour préparer une solution mère d’un millimolaire d’un mélange 1:2:1 d’acétonitrile et de DMF.

Et de l’eau de qualité analytique pour les expériences. Pour l’injection, préparer un mélange de 20 micromolaires dans du PBS. Et conservez la solution sur de la glace jusqu’à l’injection.

Utilisez un extracteur d’aiguille avec les paramètres décrits dans le protocole de texte, pour préparer des capillaires d’injection de verre. Ajustez le réglage de la pression sur la source de pression à 25 PSI. Ensuite, sur le micro-injecteur, réglez la pression de maintien à 20 PSI, la pression d’éjection à 10 PSI, la valeur de période à 2,5 et la valeur de négation à 100 millisecondes.

Ensuite, chargez le capillaire en verre avec la solution d’injection. Insérez ensuite le capillaire en verre dans le support de micro-injection et ajustez l’angle d’injection à 45 degrés. Placez un poisson dans une nouvelle boîte de Pétri, remplie de solution d’anesthésie.

Une fois anesthésié, tenez le poisson avec une pince et orientez-le pour l’injection. À l’aide de la pointe d’une aiguille de calibre 30, générez une fente dans le crâne au-dessus du tectum optique, là où les deux plaques latérales se rencontrent. N’utilisez que la pointe de l’aiguille et ne pénétrez pas plus d’un millimètre à travers le crâne.

Ensuite, tout en continuant à tenir le poisson, insérez l’extrémité du capillaire en verre à travers le site d’insertion. Orientez l’extrémité du capillaire de verre vers le télencéphale à un angle de 45 degrés. Injectez ensuite un microlitre de la solution.

Remettez le poisson dans un récipient de transport jusqu’à ce qu’il se rétablisse. Raccordez ensuite le récipient à l’eau de poisson qui circule régulièrement, afin d’assurer une qualité d’eau optimale. Après avoir sacrifié le poisson, selon le protocole de texte, ouvrez le crâne au-dessus du tectum optique du côté dorsal à l’aide d’une pince pointue.

Ensuite, à l’aide d’un scalpel, disséquez la tête juste derrière la nageoire pectorale. Placez les têtes dans trois millilitres de 2 % de PFA. Et incubez le tissu à 4 % Celsius pendant la nuit.

Pour la cytoprotection et la décalcification, laver les têtes trois fois dans un tampon de phosphate à 0,1 molaire, pH 7,4, puis les transférer dans une solution à 20 % de saccharose, 20 % d’EDTA. Et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Transférez ensuite les têtes dans une solution de gélatine à 7,5 % et 20 % de saccharose dans des moules d’histologie en plastique.

Et congelez-les sur de la glace sèche. Utilisez un cryostat pour sectionner les têtes en cryosections de 12 micromètres d’épaisseur. Transférez ensuite les cryosections directement sur des lames de verre et stockez-les à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation à long terme.

Pour tacher les lames, séchez les sections à température ambiante pendant 30 minutes. Après la décongélation, lavez les sections deux fois dans du PBS et une fois dans du PBS avec 0,3 % de Triton X-100 appelé PBSTx. Ajoutez l’anticorps primaire aux lames.

Et incubez les échantillons à 4 % Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lavez les lames une fois avec du PBS et deux fois avec du PBSTx. Ajoutez ensuite aux sections des anticorps secondaires couplés à la fluorescence ainsi que du DAPI et du PBSTx.

Et incubez les lames dans l’obscurité à température ambiante pendant deux heures. Après trois lavages dans PBSTx, utilisez 100 microlitres de glycérol à 70 % et une lamelle pour monter chaque lame. Enfin, acquérez des images fluorescentes à l’aide d’un microscope confocal.

Pour identifier le peptide correctement synthétisé, une analyse par spectroscopie de masse a été effectuée sur toutes les fractions purifiées HPLC pour les peptides amyloïdes bêta-42 natifs et les peptides bêta-amyloïde 42 marqués CPP. La fraction HPLC, qui a donné un pic sur l’UPLC, c’est-à-dire le rapport de charge principal correct du peptide bêta-amyloïde requis, a été traitée pour les expériences.

Après une micro-injection cérébroventriculaire, les peptides s’agrègent dans le cerveau et forment des dépôts amyloïdes comme le montrent les amas verts. Ces agrégats sont principalement considérés comme des dépôts intracellulaires, mais aussi autour des vaisseaux sanguins. De telles agrégations sont des indications d’une accumulation réussie de peptides amyloïdes et de tissus.

Une fois maîtrisée, l’injection peut être réalisée en quelques minutes. Lors de cette procédure, il est important de surveiller de près la santé et le comportement de l’animal. Après avoir développé cette technique, elle nous a aidés à répondre à des questions sur la maladie d’Alzheimer, comme la pathologie et la réponse des cellules souches neurales dans le cerveau du poisson-zèbre.