Quantification du lixiviation des métaux dans la chromatographie d'affinité métallique immobilisée
17 janvier 2020
Nous présentons un analyse pour la quantification facile des métaux introduits aux échantillons préparés utilisant la chromatographie immobilisée d'affinité de métal. La méthode utilise le bleu hydroxynaphthol comme indicateur de métal colorimétrique et un spectrophotomètre UV-Vis comme détecteur.
Notre méthode est significative, car elle permet au biochimiste moyen de déterminer rapidement si les échantillons isolés à l’aide de la chromatographie d’affinité métallique immobilisée sont contaminés par des métaux de transition. Le principal avantage est la facilité par laquelle l’analyse peut être effectuée. L’essai utilise l’instrumentation et les techniques communes à la plupart des laboratoires de biochimie, et il peut être facilement et rapidement mis en œuvre.
Alors que dans cet article, nous appliquons cette méthode pour les échantillons isolés avec une colonne nickel-NTA, la méthode peut être utilisée avec toute autre résine d’affinité métallique. Pour la première fois, les utilisateurs devraient essayer cette méthode avec une solution de stock de nickel de concentration connue. Cela les familiarisera avec le flux de travail, les couleurs de l’échantillon et les résines indiquées dans les changements spectraux.
Cole Swain, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, allumez et réchauffez le spectrophotomètre UV-Vis. Déterminer les fractions de chromatographie à déterminer à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis à diodes avec absorption optique à 280 nanomètres pour quantifier la protéine.
Obtenez un tampon d’échantillon de 10 à 100 millimlaires avec un PH entre 7 et 12, comme tris, HEPES, MOPS et tampon phosphaté. Préparer une solution de 12 % en volume de dispersion hnb dans le tampon de l’échantillon à l’aide de 120 milligrammes de réaccente HNB pour chaque millilitre de solution de stock préparé. Réglez le spectrophotomètre pour recueillir des données à 647 nanomètres.
Utilisez une cuvette à quartz remplie du tampon de l’échantillon pour vider le spectrophotomètre. Préparer une solution de contrôle dans une cuvette contenant 50 microlitres de stock HNB par millilitre de volume total d’analyse. Laissez le contrôle couver pendant au moins trois minutes à température ambiante.
Mesurez et enregistrez l’absorption à 647 nanomètres pour l’échantillon de contrôle. Préparer les échantillons d’analyse en mélangeant 150 microlitres de stock HNB avec 2850 microlitres de fractions de protéines correctement diluées avec le tampon de l’échantillon. Laissez l’échantillon couver pendant au moins trois minutes à température ambiante.
Répétez l’enregistrement du spectre pour chaque fraction à mesurer. Dans le cas où une dilution insuffisante est obtenue, toute la bande spectrale à 647 nanomètres a disparu. Bien qu’avec une dilution trop forte, l’échantillon est indiscernable du contrôle.
Pour déterminer la concentration de métal dans chaque échantillon, trouvez d’abord la différence de chaque absorption de l’échantillon à 647 nanomètres du contrôle HNB. Déterminer la concentration de métal en micromolaire en utilisant la formule où DF est le facteur de dilution pour la fraction d’essai, delta A-B-S 647 est le changement d’absorption à 647 nanomètres, 3,65 fois 10 à la négative 2 représente le coefficient d’extinction de HNB, et l est la trajectoire optique de la cuvette en centimètres. Dans cette étude, le spectre de HNB libre à PH neutre dans les spectres représentatifs des fractions analysées pour l’ion de nickel de l’isolement de MSP1E3D1 sont montrés ici.
Une diminution de l’absorption à 647 nanomètres par rapport au contrôle HNB a été observée, ce qui correspondait à la formation de complexes HNB en présence d’un métal de transition. Pour démontrer l’application de cet essai, deux protéines d’échafaudage de membrane sa-marqués, MSP1E3D1, MSP2N2, et un nouveau, trois-heme, c-type cytochrome GSU0105, de geobacter sulfurreducens, ont été analysés. La teneur en protéines et en ions nickel de chaque fraction pour GSU0105 a été sensiblement déplacée les unes des autres, tandis que les fractions pour MSP1E3D1 et MSP2N2 qui contenaient le plus de protéines avaient également la teneur en nickel la plus élevée.
Il est également illustré que la teneur en métal ne peut pas être répartie uniformément entre les fractions recueillies à l’aide d’une chromatographie d’affinité métallique mobilisée. Il est très important de mélanger adéquatement et uniformément le blanc dans tous les échantillons et de permettre des temps d’incubation égaux pour le blanc dans tous les échantillons. Des fractions protéiques d’intérêt particulier pourraient être analysées plus en détail avec la spectrométrie d’absorption atomique ou l’ICPMS pour confirmer la contamination des métaux et pour tester les ions métalliques protéiques chélifiés ou fortement liés.
Outre la détection des lixiviations métalliques de transition, cette technique peut être utilisée pour mesurer les affinités contraignantes dans les ions métalliques de transition vers les protéines. HNB et tout nickel présent dans les échantillons sont des irritants pour les yeux et la peau respectivement. L’EPI standard, y compris les gants et la protection oculaire, doit être utilisé pendant la méthode.
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Aperçu
Cet article présente un test simple permettant de quantifier les métaux dans des échantillons préparés par chromatographie d'affinité aux métaux immobilisés. La méthode utilise l'hydroxynaphtol bleu comme indicateur colorimétrique et un spectrophotomètre UV-Vis pour la détection.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Chimie analytique
- Chromatographie d'affinité métallique
Contexte
- La contamination des échantillons par des métaux de transition peut affecter les résultats expérimentaux.
- La chromatographie d'affinité aux métaux immobilisés est une technique courante en biochimie.
- Les méthodes existantes pour détecter la contamination métallique peuvent être complexes ou nécessiter un équipement spécialisé.
- Une méthode simple et accessible est nécessaire pour l'analyse de routine dans les laboratoires de biochimie.
Objectif de l'étude
- Offrir un test simple permettant de détecter la contamination métallique dans les échantillons.
- Permettre aux biochimistes d’évaluer rapidement la pureté des échantillons.
- Faciliter l’utilisation d’équipements de laboratoire courants pour la quantification des métaux.
Méthodes utilisées
- Utilisation de l'hydroxynaphtol bleu comme indicateur colorimétrique.
- Application de la spectrophotométrie UV-Vis pour la détection.
- Tests effectués avec des colonnes au nickel-NTA et d'autres résines d'affinité pour les métaux.
- Essais préliminaires réalisés avec des concentrations connues de solutions mères de nickel.
Résultats principaux
- Le test permet une évaluation rapide de la contamination par les métaux.
- Les résultats peuvent être obtenus à l'aide de techniques de laboratoire classiques.
- La méthode est adaptable à diverses résines à affinité métallique.
- Les utilisateurs peuvent se familiariser avec le flux opératoire grâce à des essais initiaux.
Conclusions
- Le test proposé simplifie la détection de la contamination par des métaux.
- Il est accessible aux biochimistes moyens disposant d'un équipement de laboratoire courant.
- La méthode améliore la fiabilité des échantillons préparés par chromatographie d'affinité aux métaux.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
La lixiviation de métaux à partir de colonnes de chromatographie d'affinité aux métaux immobilisés (IMAC) introduit des contaminants métalliques de transition qui peuvent inhiber l'activité enzymatique et compromettre la fiabilité des dosages en recherche et développement biopharmaceutique. Ce protocole propose une méthode simple et accessible pour quantifier cette contamination à l'aide de la spectrophotométrie UV-Vis, largement disponible, et du bleu d'hydroxynaphtol (HNB), permettant un contrôle qualité courant sans instrumentation spécialisée. En offrant une sensibilité nanomolaire avec du matériel de laboratoire standard, ce dosage soutient l'intégrité des données dans les étapes précoces de validation des cibles et les procédés de purification des protéines.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet de déterminer si l'inhibition enzymatique observée résulte de la biologie de la cible ou d'une contamination métallique, réduisant ainsi les faux positifs lors de la validation de la cible.
- Valeur opérationnelle : Utilise des spectrophotomètres UV-Vis existants et des tampons courants, permettant une mise en œuvre rapide au sein des équipes de découverte sans investissement dans de nouveaux équipements.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des mesures quantitatives des ions métalliques à 647 nm, permettant de corréler les niveaux de lessivage avec la pureté de la fraction lors de la purification par CIM.
- Valeur opérationnelle : Normalise l'évaluation de la contamination entre les variants protéiques et les résines, facilitant le développement d'essais reproductibles pour la production de protéines portant une étiquette his.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Confirme l'absence de métal dans les protéines purifiées avant les essais fonctionnels, améliorant ainsi la fiabilité prédictive des études ultérieures d'interaction avec la cible.
- Valeur opérationnelle : Fournit un critère de libération des lots de protéines, permettant de prendre des décisions d'engagement ou de non-engagement avant de procéder à des tests précliniques d'efficacité.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'insère entre la purification par CIMC et la caractérisation biochimique ou biophysique en aval, servant de point de contrôle de la pureté de l'échantillon avant les études de cinétique enzymatique, les tests de liaison ou les analyses structurales.
- Découverte en biologie : Permet de tester des hypothèses en éliminant les artefacts liés aux métaux dans les données d'activité enzymatique ou d'interaction protéique.
- Écrans : Garantit la prêts des tests en vérifiant que les fractions protéiques purifiées sont exemptes de métaux de transition inhibiteurs pouvant fausser les résultats de criblage de composés.
- Analytique : Génère des variations quantitatives d'absorbance à 647 nm, permettant de calculer des concentrations micromolaires en métaux pour des comparaisons entre lots.
- Recherche translationnelle : Relie la qualité de la purification à la continuité préclinique en s'assurant que la contamination par les métaux n'entache pas la validation de cibles ou les mesures de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une étape de contrôle qualité réutilisable, applicable à toute purification fondée sur l'ACIM, indépendamment du type de résine ou de la protéine cible.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles en éliminant une source courante de bruit biochimique dans les dosages enzymatiques.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation entre laboratoires grâce à une méthode colorimétrique associée à des paramètres définis d'incubation et de mesure.
- Valeur stratégique : Réduit le risque d'échec des expériences dû à une inhibition métallique non détectée, améliorant ainsi l'efficacité du capital investi dans les campagnes d'identification de composés candidats.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles protéiques sur la base de leur pureté confirmée, favorisant une meilleure allocation des ressources en phase précoce de découverte.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une bonne connaissance de la spectrophotométrie UV-Vis et de la préparation de solutions de base pour le réactif HNB.
- Suppose l'accès à des cuvettes en quartz et à un spectrophotomètre capable de mesurer l'absorbance à 647 nm.
- Exige un temps de dilution et d'incubation des échantillons constant pour garantir des calculs précis de delta-AB.
- Peut nécessiter une optimisation dans le cas des protéines présentant une absorbance intrinsèque marquée ou des interférences de couleur à 647 nm.
- S'associe idéalement à des méthodes orthogonales telles que l'AAS ou l'ICPMS pour confirmation, lorsque la quantification des métaux exige une grande fiabilité.
