Électrophorèse capillaire d’affinité de décalage de mobilité : une méthode pour analyser les interactions échantillon-ligand en fonction de la migration différentielle de complexes protéine-ligand

Les ligands, tels que les ions métalliques, se lient de manière non covalente à une protéine spécifique, formant un complexe protéine-ion métallique. Cette liaison modifie la charge globale de la protéine, ce qui permet de caractériser ces complexes par électrophorèse capillaire d’affinité.

Pour commencer, prenez un capillaire en verre mince et préconditionné avec des groupes silanol chargés sur la surface interne. Rincez le capillaire avec une solution EDTA. L’EDTA est un agent chélateur qui élimine toutes les impuretés d’ions métalliques. Maintenant, injectez hydrodynamiquement la solution d’échantillon contenant la protéine souhaitée dans le capillaire à partir de son extrémité positive ou de son anode.

Appliquez une tension élevée pour créer un flux électro-osmotique, forçant les protéines dans leur conformation native avec des charges inhérentes à se déplacer à l’intérieur du capillaire vers la cathode. Enregistrer le schéma de migration des protéines non liées à partir du capillaire.

Ensuite, introduisez une solution de ligand spécifique dans le capillaire avec les échantillons de protéines, et appliquez la même tension. À l’intérieur du capillaire, les molécules de ligand se lient de manière non covalente à la protéine cible, formant des complexes.

Cela induit un changement de conformation dans les protéines, entraînant une altération de leurs charges inhérentes et affectant le rapport charge/taille. Ces changements modulent leurs interactions avec la surface chargée du capillaire, ce qui les fait circuler différemment par rapport à la protéine non liée.

Enregistrez ces changements dans la mobilité électrophorétique, qui sont en corrélation avec la force de l’interaction protéine-ligand.

Après avoir préparé la méthode pour les mesures sans ligands, préparez la méthode pour les mesures avec ligands, en utilisant d’abord une solution d’EDTA à 0,1 molaire pour rincer le capillaire à 2,5 bar pendant 1 minute. Ensuite, utilisez de l’eau déminéralisée pour rincer le capillaire. Ensuite, équilibrez le capillaire en utilisant une solution de ligand pour le rincer à 2,5 bars pendant 1,5 minutes.

Ensuite, injectez la solution d’acétanilide à 0,05 bar pendant 6 secondes et remplacez les flacons d’entrée et de sortie par les flacons tampons contenant des ligands. Appliquez 0,05 bar pendant 2,4 secondes, afin de pousser la solution d’acétanilide plus loin à partir de l’extrémité du capillaire. Appliquez 10,0 kilovolts pendant 6 minutes et détectez le pic d’acétanilide à une longueur d’onde de 200 nanomètres.

Après avoir rincé le capillaire avec de l’EDTA, de l’eau déminéralisée et la solution de ligand comme précédemment, injectez l’échantillon de protéines et remplacez les flacons d’entrée et de sortie par des flacons tampons contenant des ligands frais. En fin de compte, répétez la prise de mesures avec et sans ligands.