Multiplexés Immunofluorescence analyse et Quantification d’intratumorale PD-1^{+ +} Tim-3 CD8⁺ T Cells

L’objectif global de cette analyse d’immunofluorescence multiplexée est de compter automatiquement les cellules en fonction de leur phénotype. Cette méthode permet la multifluorescence et le comptage automatique des cellules pour analyser le phénotype et la fonction des cellules immunitaires tumorales au sein d’un microenvironnement tumoral. Cette technologie a facilité la génération de deux types de pronostic composites pour prédire par vos marqueurs dérivés directement du microenvironnement tumoral.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car la procédure de phénotypage est très longue et les données brutes résultantes nécessitent un traitement supplémentaire. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons tenté de caractériser le phénotype et les interactions immunologiques des cellules miranty. Après la décongélation, utilisez une serviette en papier pour sécher soigneusement les lames autour des sections de tissus, puis encerclez les tissus avec un stylo barrière hydrophobe.

Lorsque la barrière a séché, fixez les échantillons à l’acétone à 100 % pendant cinq minutes, puis séchez-les à l’air pendant deux minutes, puis lavez les lames au TBS pendant 10 minutes. Prétraitez les lames avec 3 gouttes d’Avidin à 0,1 % pendant 10 minutes dans l’obscurité, puis tapotez ou effleurez les lames pour couvrir le tissu avec la solution Avidin. Ajoutez 3 gouttes de biotine à 01 % à chaque échantillon, puis tapotez ou effleurez la biotine sur les échantillons, suivie d’un lavage au TBS comme nous venons de le démontrer.

Bloquez ensuite toute liaison non spécifique avec 100 microlitres de sérum normal à 5 % dans du TBS pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, tapotez les lames pour éliminer l’excès de sérum et incubez les lames dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps primaires d’intérêt pendant une heure dans une chambre humidifiée. Lavez les lames d’anticorps marquées dans du TBST pendant cinq minutes.

Après séchage, étiquetez les cellules avec 100 microlitres du cocktail d’anticorps secondaires d’intérêt pendant 30 minutes dans la chambre humidifiée, suivie d’un lavage de 10 minutes dans du TBS. Incuber les lames d’anticorps secondaires séchés marquées avec 100 microlitres du cocktail d’anticorps tertiaires d’intérêt pendant 30 minutes suivies de 10 minutes d’un lavage TBS. À la fin du lavage, séchez les lames et montez les mouchoirs avec un milieu de montage complété par du DAPI.

Ensuite, trèflez chaque diapositive avec une lamelle et laissez le support de montage reposer pendant au moins deux heures. Pour numériser les lames, ouvrez le logiciel du microscope et chargez le protocole de numérisation d’image. Chargez la première lame sur la platine du microscope.

Ensuite, dans la barre de contrôle, cliquez sur régler l’exposition et ajustez le temps d’exposition de chaque filtre jusqu’à ce qu’un signal suffisant mais non saturant soit obtenu. Cliquez sur Démarrer dans le panneau supérieur et ouvrez le dossier LabID. Entrez l’ID de la première diapositive et cliquez sur Suivant.

Pour acquérir la vue d’ensemble de la lame sous une lumière de champ vif à un grossissement de 4x, cliquez sur Imagerie monochrome et recherchez l’échantillon. Pour sélectionner le nombre de tissus à scanner, appuyez sur la touche de commande et utilisez le curseur pour sélectionner ou désélectionner les régions d’intérêt à scanner avec un grossissement de 4x. Pour obtenir une image rouge/bleue/verte fluorescente de chaque région, cliquez sur Low Power Imagine.

Pour la sélection du champ de puissance élevée, appuyez sur la touche de commande et sélectionnez au moins cinq régions d’intérêt qui correspondent aux zones du tissu qui seront balayées à un grossissement de 20x. Ensuite, pour obtenir une acquisition d’image multispectrale de chaque champ, cliquez sur high power imagine, puis sur stockage de données pour stocker les images dans le dossier d’identification de laboratoire approprié. Pour créer un projet dans le menu Fichier, sélectionnez Nouveau projet, dans le menu Rechercher des fonctionnalités, sélectionnez Segmentation des cellules, puis dans le menu Typage phénologique, sélectionnez Typage phénologique, puis cliquez sur Configurer.

Dans le format d’image, sélectionnez multispectral. Dans le format d’échantillon, choisissez fluorescence. Pour intégrer les images représentatives dans le projet, dans le menu Fichier, cliquez sur Ouvrir l’image et sélectionnez 10 à 30 images représentatives de l’ensemble de la série.

Pour supprimer l’autofluorescence, ouvrez la lame non colorée et sélectionnez la source de la bibliothèque et les fluorophores appropriés. Cliquez sur Floraison automatique et sélectionnez la zone de floraison automatique sur la diapositive vierge. Pour générer une image composite, sélectionnez tout préparer pour intégrer la bibliothèque de fluorescence et les spectres de fluorescence automatique.

Cliquez sur l’icône en forme d’œil pour ouvrir le panneau de l’éditeur de vue et désélectionnez l’option autofluorescence pour réduire le signal d’autofluorescence. Sélectionnez une couleur appropriée pour chaque marqueur. Pour segmenter les cellules, dans le menu des compartiments, sélectionnez noyaux et membrane.

Dans le menu des noyaux, définissez DAPI comme contre-coloration nucléaire. Cliquez sur les cellules de segment et vérifiez la segmentation des noyaux dans les membranes cellulaires. Pour phénotyper les cellules, dans le menu Phénotype, cliquez sur Ajouter.

Pour créer les catégories de phénotypes cellulaires, sélectionnez plus de cinq représentants pour Fluorophor et Combinaison Fluorophor, puis cliquez sur Entraîner le classificateur. Le classificateur crée un algorithme qui attribue un phénotype à chaque cellule avec un intervalle de confiance. Zoomez et vérifiez les phénotypes des cellules.

Cliquez ensuite sur phenotype all pour enregistrer l’algorithme de phénotype et le projet d’image, sous le menu Fichier, sélectionnez Enregistrer le projet. Ensuite, nommez le projet et enregistrez-le. Pour effectuer une analyse par lots de la série, sélectionnez Analyse du bain et sélectionnez le projet enregistré.

Sélectionnez un dossier pour stocker les données par lot. Ajoutez les images à analyser puis cliquez sur Exécuter. À la fin de l’analyse, vérifiez la qualité de l’image composite et vérifiez le phénotypage de toutes les images de la série.

L’analyse des lymphocytes T CD8 positifs infiltrant la tumeur, sur un échantillon de carcinome rénal clair par imagerie multispectrale par fluorescence, révèle qu’environ la moitié des lymphocytes T CD8 positifs sont positifs pour-1 et environ 1/3 sont doublement positifs pour-1 et Tim-3. Après avoir intégré ces différents signaux cellulaires sur une coupe de tissu, la mesure de l’intensité de la florescence de-1 sur des cellules T CD8 positives-1 positives par rapport à des cellules T CD8 positives-1 positives, révèle que l’IMF-1 est plus élevée lorsque Tim-3 est coexprimé, renforçant ainsi la pertinence fonctionnelle de l’expression de Tim-3. Dans cette expérience représentative, 66 % des patients atteints de tumeurs rénales étaient également positifs pour l’expression du ligand-1 et 100 % étaient positifs pour le ligand Tim-3 Galactin-9.

L’évaluation clinique des tissus tumoraux de patients atteints d’un carcinome à cellules rénales a également démontré la corrélation positive entre le nombre et le pourcentage de cellules T CD-8 positives infiltrant la tumeur exprimant-1 et Tim-3 et les paramètres de notation pronostique, mais pas les CD-8-1 positifs n’exprimant pas Tim-3. Il est intéressant de noter que les patients atteints d’un carcinome rénal avec des lymphocytes T CD-8 positifs co-exprimant PD1 avec et Tim 3 au-dessus du pourcentage médian étaient plus susceptibles de rechuter, tandis que l’expression de-1 sans co-expression de Tim-3 n’était pas corrélée avec la rechute du patient. Bien que j’aie tenté cette procédure, il est important de se rappeler d’examiner le phénotype des cellules avec deux chercheurs séparés, y compris un pathologiste si possible.

Après cette procédure, d’autres questions, comme la cytométrie, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’impact fonctionnel du phénotype du soi après une stimulation x-vivo. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du cancer pour explorer les réponses immunitaires dans les organes affectés.