Name: Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay pour détermination quantitative de la palmitoylation des protéines de membrane cérébrale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Apprenez l'essai APEGS pour déterminer quantitativement la palmitoylation des protéines membranaires cérébrales chez la souris. Cette méthode biochemique utilise les changements de mobilité en gel sans purification par affinité.

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Les auteurs remercient K. Woolfrey pour ses conseils et leurs commentaires sur l’analyse APEGS. Ces études ont été financées par des subventions de recherche à E.D. de la Whitehall Foundation et du NIH-NIMH (1R01MH119347).

Toutes les procédures animales ont suivi les lignes directrices établies par les National Institutes of Health (NIH) et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Davis.
1. Préparation des membranes cérébrales de souris
<ol><li>Décapiter la souris à l’aide d’un appareil de guillotine et disséquer le cerveau rapidement (en lt;1 min, si possible, pour minimiser les changements de palmitoylation qui peuvent se produire pendant la procédure de dissection). Homogénéisez immédiatement dans 10 ml de tampon d’homogénéisation(tableau 1) dans un homogénéisateur en verre (12 coups) sur la glace.</li>
	<li>Centrifugeuse lysates pendant 15 min à 1 400 x g à 4 oC. Transférer le supernatant dans un nouveau tube sur glace. Réutilisez la granule (6 coups) dans un volume égal de tampon d’homogénéisation et de centrifugeuse à 710 x g pendant 10 min à 4 oC.</li>
	<li>Combinez les supernatants de l’étape 1.2 et la centrifugeuse à 40.000 x g pendant 20 min à 4 oC.</li>
	<li>Jetez la fraction supernatante (fraction cytosolique) et réutilisez la fraction de la membrane granulée (P2) dans le tampon d’homogénéisation. REMARQUE : Les échantillons peuvent être congelés et stockés à -80 oC pour une utilisation ultérieure.</li>
	<li>Effectuez un essai d’acide bicinchoninique (BCA) pour quantifier les niveaux de protéines. Pour l’essai APEGS, commencez par 100 à 200 mg de protéines (maximum 250 mg) dans un volume de 470 l de tampon A(tableau 1) dans un tube de 1,5 mL. Sonicate et centrifugeuse à 13 000 x g pendant 10 min à 25 oC pour éliminer les protéines insolubles. Transférer la protéine solubilisée dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
</ol>2. Acyl-PEGyl échange gel-shift (APEGS) analyse
<ol><li>Perturber les liens de disulfide et bloquer les cystéines libres.<ol>
<li>Perturber les liaisons de disulfide en incuber en tris de 25 mM (2-carboxyethyl)phosphine (TCEP; 25 l,l, ajoutée à partir d’une solution de stock; Tableau 1) pendant 60 min à 55 oC.</li>
		<li>Bloquer les cystéines libres avec 50 mM N-ethylmaleimide (NEM; 12,5 l,l, ajouté à partir d’une solution de stock; Tableau 1) à température ambiante pendant 3 h. REMARQUE : La réaction peut être prolongée du jour au lendemain.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer des précipitations de méthanol chloroforme (CM).<ol>
<li>Transférer la solution protéique du tube de 1,5 mL à un tube de polypropylène ou de verre qui peut être centrifugé dans un rotor de seau oscillant à une vitesse modeste. Un tube de 5 ml est idéal. Ajouter quatre volumes (2 ml) de méthanol (MeOH) et de vortex brièvement.</li>
		<li>Ajouter brièvement deux volumes (1 ml) de chloroforme et de vortex.</li>
		<li>Ajouter trois volumes (1,5 mL) de dH2O et vortex brièvement.</li>
		<li>Centrifuge les échantillons à 3.000 x g pendant 30 min à 25 oC dans un rotor de seau oscillant.</li>
		<li>Retirez et jetez soigneusement la phase supérieure.</li>
		<li>Ajouter 3 volumes (1,5 ml) de MeOH et mélanger doucement mais soigneusement, en prenant soin de ne pas fragmenter la crêpe aux protéines opaques.</li>
		<li>Centrifugeuse à 3 000 x g pendant 10 min à 25 oC dans un rotor de seau oscillant.</li>
		<li>À l’aide d’une pipet sérologique en verre, enlever autant de la phase supérieure que possible sans déranger la crêpe aux protéines.</li>
		<li>Rincer délicatement la boulette avec 1 ml de MeOH.</li>
		<li>Aérer le granulé pendant au moins 10 min. REMARQUE : Les granulés séchés peuvent être entreposés à -20 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuez le clivage des liens palmitoyl-thioester avec l’hydroxylamine (NH2OH, HAM).<ol>
<li>La protéine de résuspendance précipitent dans 125 L de tampon A et sonicate brièvement. Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 10 min à 25 oC pour enlever le matériau insoluble. Transférer la protéine solubilisée dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 375 L de tampon H (HAMMD; Tableau 1) ou tampon T (HAM-; Tableau 1) et incuber des échantillons pendant 60 min à 25 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez les précipitations de CM décrites à l’étape 2.2. REMARQUE : Les granulés séchés peuvent être entreposés à -20 oC.</li>
	<li>Ajouter le mPEG aux cystéines non protégées.<ol>
<li>Pellet de résuspendance dans 100 l de tampon A contenant 10 mM TCEP. Transférer dans un tube de 1,5 mL. REMARQUE : Il est normal que la perte significative de protéines se soit produite pendant les étapes de précipitation de CM. Toutes les étapes suivantes seront effectuées dans un tube de 1,5 mL, ce qui limitera le volume de protéines à un maximum de 120 à 130 ll. Cela réduira la perte de protéines lors des précipitations finales de CM.</li>
		<li>Ajouter 20 mM mPEG-5k (25 ll, ajouté à partir d’une solution de stock; Tableau 1) à l’échantillon de protéines et mélanger par tuyauterie. Incuber pendant 60 min à 25 oC avec rotation de bout en bout.</li>
		<li>Pour enlever le mPEG-5k non constitué en cocorporé, effectuer des précipitations CM telles que décrites à l’étape 2.2 à l’aide de ces volumes ajustés : 4 volumes de MeOH (500 ll), 2 volumes de chloroforme (250 lL) et 3 volumes de dH2O (375 ll). Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 10 min à 25 oC.</li>
		<li>Retirez soigneusement la phase supérieure comme avant, en évitant l’épaisse crêpe flocculente. Ajouter 1 ml de MeOH et mélanger délicatement mais soigneusement. Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 10 min à 25 oC.</li>
		<li>Retirez soigneusement le supernatant et rincez la boulette avec 1 ml de MeOH. Centrifugeuse à 13 000 x g pendant 10 min à 25 oC. Granule sèche à l’air. REMARQUE : Les granulés séchés peuvent être entreposés à -20 oC.</li>
		<li>Réutilisez la granule séchée dans 50 L de tampon A (sans TCEP ou aucun agent de réduction). Réservez 5 ll pour la quantitation des protéines BCA. Après la quantitation, ajoutez une quantité appropriée de tampon d’échantillon de 4x Laemmli et, selon la protéine d’intérêt, potentiellement chauffer l’échantillon à 70 à 100 oC pendant 10 min. REMARQUE : L’ébullition peut causer l’agrégation de certaines protéines membranaires.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analyse occidentale des protéines PEGylated
<ol><li>Charger l’échantillon sur un gel de gel de sulfate de dodéthyle de sodium electrophoresis (SDS-PAGE) gel13. REMARQUE : Dans ce protocole, 10 % de polyacrylamide a été utilisé.</li>
	<li>Utilisez des protocoles standard de séparation, de transfert et de détection pour les ballonnementsoccidentaux 14.</li>
	<li>Utilisez la densitométrie14 pour déterminer les quantités relatives de protéines PEGylated par rapport aux protéines non-TPEGylated.</li>
</ol>

<ol><li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li>
<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li>
<li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li>
<li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG1%3A+an+activity-regulated%2C+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability%2C+Localization%2C+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li>
<li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+%28APEGS%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li>
<li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li>
<li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG4%2FPrrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li>
<li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li>
<li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79%2F150%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans nos travaux précédents, nous avons utilisé l’essai ABE pour démontrer que SynDIG1 est palmitoylated à deux résidus conservés juxta-transmembrane Cys (trouvés dans toutes les protéines SynDIG) d’une manière dépendante de l’activité pour réguler la stabilité, la localisation, et la fonction6. Une limitation est que l’essai ABE nécessite la purification d’affinité avec des résines agarose conjuguées à des moieties avides comme dernière étape dans la procédure, ayant pour résultat la perte signif...

S-palmitoylation est une modification post-translationnelle réversible des protéines cibles qui régule l’association stable de membrane, le trafic de protéine, et les interactions protéine-protéine1. Il s’agit de l’ajout d’une meety palmitate de 16 carbone aux résidus de cystéine via le lien thioester catalysé par les enzymes palmitoyl acyltransferase (PAT). Beaucoup de protéines synaptiques dans le cerveau sont palmitoylated, y compris AMPA-Rs et PSD-95, d’une manière dépendante de l’activité pour réguler la stabilité, la localisation, et la fonction2,3,4. Les modifications dans les niveaux des AMPARs synaptiques dans le PSD par l’interaction des facteurs auxiliaires avec des échafaudages synaptiques tels que PSD-95 sous-tend la plasticité synaptique ; ainsi, les méthodes pour déterminer l’état de palmitoylation des protéines synaptiques fournit un aperçu important des mécanismes de plasticité synaptique.
Auparavant, nous avons identifié la famille SynDIG de quatre gènes (SynDIG1-4) codant des protéines transmémbranes spécifiques au cerveau qui s’associent à DES AMPAR5. La surexpression ou la chute de SynDIG1 dans les neurones hippocampal de rat dissociés augmente ou diminue, respectivement, la taille et le nombre de synapse d’AMPA-R de 50 % détectés à l’aide de l’immunocytochimie et de l’électrophysiologie5. Nous avons utilisé l’essai d’échange d’acyl-biotine (ABE) pour démontrer que SynDIG1 est palmitoylated à deux résidus conservés juxta-transmembrane Cys (trouvés dans toutes les protéines SynDIG) d’une manière dépendante de l’activité pour réguler la stabilité, la localisation, et la fonction6. L’essai ABE repose sur l’échange de biotine sur les cystéines protégées par la modification et la purification d’affinité ultérieure7. Ici, nous décrivons une approche biochimique innovante, le changement de gel d’échange d’acyl-PEGyl (APEGS) assay8,9,10,11,12, qui ne nécessite pas de purification d’affinité et utilise plutôt des changements dans la mobilité de gel pour déterminer le nombre de modifications pour une protéine d’intérêt. Le protocole est décrit pour l’étude des protéines endogènes de membrane du cerveau de souris pour lesquelles des anticorps appropriés sont disponibles.

<table><tbody><tr><td>Hydroxylamine (HAM)</td><td>ThermoFisher</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td><td>NOF</td><td>ME-050MA</td><td>MW ~5000 kDa</td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>ou équipement équivalent</td></tr><tr><td>N-ethylmalemide (NEM)</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>Hautement toxique.</td></tr><tr><td>Imageur optique pour densitométrie</td><td>Azure Biosystems</td><td>Sapphire Biomolecular Imager</td><td>ou équipement équivalent</td></tr><tr><td>Tubes en polypropylène avec capuchon</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (verre)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td>ou équipement équivalent</td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyéthyl)phosphine-chlorhydrate (TCEP)</td><td>EMD Millipore</td><td>580560</td><td></td></tr></tbody></table>

acyl-pegyl exchange gel shift assay pour détermination quantitative de la palmitoylation des protéines de membrane cérébrale

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Les altérations dépendantes de l’activité dans les niveaux des récepteurs synaptiques d’AMPA (AMPA) dans la densité postsynaptique (PSD) sont pensés pour représenter un mécanisme cellulaire pour l’apprentissage et la mémoire. La palmitoylation régule la localisation et la fonction de nombreuses protéines synaptiques, y compris les AMPA-R, les facteurs auxiliaires et les échafaudages synaptiques d’une manière dépendante de l’activité. Nous avons identifié la famille induite par la différenciation synapse (SynDIG) de quatre gènes (SynDIG1-4) codant des protéines transmémbranées spécifiques au cerveau qui s’associent aux AMPARs et régulent la force synapse. SynDIG1 est palmitoylated à deux résidus de cystéine situés aux positions 191 et 192 dans la région de juxta-transmembrane importante pour le développement de synapse excitatrice activité-dépendante. Ici, nous décrivons une approche biochimique innovante, l’essai de changement de gel d’échange d’acyl-PEGyl (APEGS), pour étudier l’état de palmitoylation de toute protéine d’intérêt et démontrer son utilité avec la famille SynDIG des protéines dans les lysates de cerveau de souris.

L’immunoblotting avec des anticorps contre la protéine d’intérêt révèle l’état palmitoylated (non, individuellement, doublement, etc.) dans les lysates de cerveau de souris comme déterminé par décalage de mobilité comparé aux échantillons dans lesquels HAM n’a pas été inclus. Auparavant, nous avions démontré que SynDIG1 était palmitoylated à deux sites en utilisant l’essai ABE6; cependant, nous n’avons pas pu déterminer si les deux sites ont été modifiés dans le ti...

La palmitoylation implique l’incorporation d’une noisette palmitate de 16 carbone aux résidus de cystéine des protéines cibles d’une manière réversible. Ici, nous décrivons une approche biochimique, l’essai de gel d’échange d’acyl-PEGyl (APEGS), pour étudier l’état de palmitoylation de toute protéine d’intérêt pour les lysates de cerveau de souris.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay pour détermination quantitative de la palmitoylation des protéines de membrane cérébrale

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Cette méthode biochimique permet de déterminer l’état de palmitoylation de toute protéine membranaire exprimée dans le cerveau pour laquelle un anticorps approprié est disponible. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas de purification par affinité et utilise plutôt des changements dans la mobilité du gel pour déterminer le nombre de modifications d’une protéine d’intérêt. Après avoir disséqué le cerveau, homogénéisez-le immédiatement en 10 millilitres de tampon d’homogénéisation dans un homogénéisateur de verre sur la glace.À l’aide d’environ 12 coups, centrifuger les lysates pendant 15 minutes à 1400 fois G et quatre degrés Celsius. Transférer le surnatant dans un nouveau tube sur glace. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de tampon d’homogénéisation.Homogénéisez-le à l’aide d’environ six coups. Centrifuger la suspension à 710 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Combinez les supernatants et centrifugez-les à 40 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.Jetez le supernatant et resuspendez la fraction de membrane granulée dans un tampon d’homogénéisation en brisant la pastille avec une pointe de pipette et pipetting de haut en bas. Effectuez un test ABCA pour quantifier les niveaux de protéines. Pour effectuer l’analyse APEGS, placez 470 microlitres de tampon A dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez environ 100 à 200 milligrammes de protéines.Sonicate le tube, puis séparer la protéine insoluble en centrifugant le tube à 25 degrés Celsius et un minimum de 13.000 fois G pendant 10 minutes. Transférer la protéine solubalisée dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Tout d’abord, perturber les liaisons disulphide en incubant la protéine solubalisée dans 25 microlitres de TCEP pendant 60 minutes à 55 degrés Celsius.Ensuite, bloquez les cystéines libres en incubant la solution avec 12,5 microlitres de la solution de stock de NEM pendant trois heures à température ambiante. Ensuite, commencer le processus de précipitations de méthanol chloroforme. Transférez la solution protéique du tube de 1,5 millilitre à un tube en polypropylène ou en verre qui peut être centrifugé dans un rotor balançant à une vitesse modeste.Ajouter brièvement deux millilitres de méthanol et de vortex. Ajouter brièvement un millilitre de chloroforme et de vortex. Ajouter ensuite 1,5 millilitres d’eau déionisée et vortex brièvement à nouveau.Si nécessaire, inverser le tube pour assurer un mélange complet. Centrifuger les échantillons à 3000 fois G et 25 degrés Celsius pendant 30 minutes dans un rotor balançant seau. Retirer soigneusement et jeter la phase supérieure de la solution dans un tube.Ajouter 1,5 millilitres de méthanol. Mélanger délicatement mais soigneusement par une inversion douce du tube, en prenant soin de ne pas fragmenter la crêpe protéinée opaque. Centrifuger l’échantillon à 3000 fois G et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un rotor balançant seau.À l’aide d’une pipette sérologique en verre, retirer le plus possible la phase supérieure de la solution sans perturber la crêpe protéique. Rincez soigneusement la pastille avec un millilitre de méthanol et laissez-la sécher à l’air libre pendant au moins 10 minutes. Une fois les précipitations de méthanol chloroforme terminées, commencez le clivage des liaisons palmitoyl thioester en résusant le précipité protéique dans 125 microlitres de tampon A.Transfer vers un nouveau tube de 1,5 millilitre.Soniquez brièvement le tube, puis centrifugez-le à 13 000 fois G ou plus et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes pour enlever les matières insolubles. Transférer la protéine solubalisée dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et ajouter 375 microlitres de tampon H ou tampon T.Après avoir incubé les échantillons pendant 60 minutes à température ambiante, répéter les précipitations de méthanol chloroforme. Pour ajouter m-PEG aux cystéines non protégées, commencez par résuser la pastille dans 100 microlitres de tampon A contenant 10 mil ou plus de TCEP.Ensuite, transférez la suspension dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter 25 microlitres de solution m-PEG 5K de stock et mélanger par pipetting. Incuber à température ambiante avec la rotation de bout en bout.Après 60 minutes d’incubation, retirer le m-PEG 5K non incorporé en effectuant à nouveau des précipitations de méthanol chloroforme. Centrifugeuse à plus de 13 000 fois G et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez soigneusement la phase supérieure comme avant, en évitant la crêpe épaisse et flocculente.Ajouter un millilitre de méthanol et mélanger délicatement mais bien. Centrifugeuse à plus de 13 000 fois G et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirer délicatement le surnatant et rincer la pastille avec un millilitre de méthanol.Encore une fois, centrifugeuse à plus de 13 000 fois G et 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après séchage à l’air de la pastille, la resuspendre en 50 microlitres de tampon A sans TCEP ni agent réducteur. Réservez 5 microlitres de la solution pour la quantitation des protéines BCA.Après la quantitation, ajouter une quantité appropriée de tampon échantillon 4x Laemmli. Chargez l’échantillon sur un gel de page SDS. Utilisez des protocoles standard de transfert et de détection de séparation pour les ballonnements occidentaux.Pour étudier l’état de palmitoylation des protéines SynDIG, des fractions de membrane P2 provenant de cerveaux de souris homogénéisés ont été soumises à l’analyse APEGS. La séparation et l’enquête avec des anticorps ont démontré que SynDIG1, SynDIG4 Prrt1, et Prrt2 sont palmitoylated dans le cerveau de souris. Le but des précipitations de méthanol chloroforme est d’empêcher un produit chimique, tel que nem, interférer avec la prochaine étape du protocole.Une bonne précipitation de méthanol chloroforme éliminera les produits chimiques indésirables tout en minimisant la perte de protéines. Cette méthode peut être appliquée aux lysates cérébraux de souris de différents âges ou de différentes régions du cerveau pour étudier les règlements spatio-temporels de la palmitoylation.

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Endocytose régulée régit les niveaux de surface des cellules d'expression de la majorité des protéines membranaires. Ici, nous utilisons réductible, réactifs à membrane biotinylation imperméants pour mesurer le taux d'endocytose du transporteur de la dopamine (DAT), une protéine membranaire polytopique. La méthode facilite une approche simple pour mesurer le taux d'endocytose de la plupart des protéines de la membrane plasmique.

Mesure du taux plasmatique des protéines membranaires par endocytique Biotinylation réversible

La vidéo montre l’analyse de l’état de palmitoylation de protéines membranaires cellulaires isolées de tissu cérébral de souris. Le processus consiste à exposer les cystéines non palmitoylées et à les bloquer, puis à utiliser un polymère qui se lie aux cystéines palmitoylées, ce qui aide à évaluer l’état de palmitoylation des protéines isolées.

Évaluation de l’état de palmitoylation des protéines de la membrane cellulaire du tissu cérébral de la souris

L'addition réversible aux protéines de palmitate est un régulateur important du trafic intracellulaire des protéines. Ceci est d'un intérêt particulier dans les neurones où de nombreuses protéines synaptiques sont palmitoylées. Nous utilisons une méthode simple biochimique pour détecter les protéines dans les neurones en culture palmitoylées, qui peuvent être adaptés à plusieurs types de cellules et de tissus.

Détection de la palmitoylation des protéines dans les neurones de l&#39;hippocampe en culture par immunoprécipitation et Acyl-biotine Exchange (ABE)

Trafic membranaire neuronal contrôle dynamiquement la membrane plasmique disponibilité des protéines et un impact significatif sur la neurotransmission. À ce jour, il a été difficile de mesurer le trafic endocytose neuronale dans les neurones adultes. Ici, nous décrivons une méthode très efficace, quantitative pour mesurer les changements rapides dans l'expression des protéines de surface ex vivo dans des tranches de cerveau de courte durée.

Tranche de cerveau Biotinylation: Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approche de Mesure région spécifique membrane de protéines plasmatiques traite des adultes neurones

PI (4,5) P2 régule diverses fonctions cellulaires, mais son organisation à l' échelle nanométrique dans la membrane plasmique de la cellule est mal comprise. Par étiquetage PI (4,5) P 2 avec une sonde fluorescente à double couleur fusionnée au domaine Pleckstrin Homology, nous décrivons une nouvelle approche pour étudier la PI (4,5) P2 distribution spatiale dans la membrane plasmatique à l'échelle du nanomètre .

Simple-molécule Super-résolution Imaging de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique avec nouveaux Fluorescent Probes

Nous décrivons un haut-débit, multiplex, et le liquide céphalorachidien protéomique ciblée (CSF) test développé avec le potentiel pour la traduction clinique. Le test peut quantifier des marqueurs potentiels et les facteurs de risque pour la neurodégénérescence, telles que les variantes de l'apolipoprotéine E (E2, E3 et E4), et mesurer leur expression allélique.

A High Throughput, multiplexée et ciblée protéomique CSF Assay à Quantifier neurodégénératifs Biomarqueurs et apolipoprotéine E isoformes Status

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) est une méthode très sensible, fiable et facile à exécuter pour détecter la modification réversible des lipides des résidus de cystéine (S-acylation) dans une variété d’échantillons biologiques.

Détection de la protéine S-Acylation à l’aide de capture assistée Acyl-Resin

Présenté ici est un test de fluorescence sensible pour surveiller l’activité de l’apolipoprotéine N-acyltransférase en utilisant le peptide diacylglycéryle et les alcyne-phospholipides comme substrats avec la chimie click.

Dosage fluorométrique basé sur la chimie Clic pour l’apolipoprotéine N-acyltransférase de la caractérisation enzymatique au criblage à haut débit

L’étude de l’acylation graisseuse a des implications importantes dans les interactions et les maladies des protéines cellulaires. Présenté ici est un protocole modifié pour améliorer la détection chimique du clic des protéines acylées grasses, qui peut être appliqué dans divers types de cellules et combiné avec d’autres tests, y compris la chasse au pouls et la spectrométrie de masse.

Incorporation optimisée d’analogues d’acides gras alcynyles pour la détection de protéines acylées grasses à l’aide de la chimie du clic

Ici, nous décrivons des protocoles utilisant des capteurs lipidiques fluorescents et des liposomes pour déterminer si une protéine extrait et transporte de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

Mesures basées sur la fluorescence de l’échange phosphatidylsérine/phosphatidylinositol 4-phosphate entre les membranes

Nous décrivons une méthode d’utilisation de la cyclodextrine pour médier l’échange entre les lipides de la membrane plasmique et les lipides exogènes. Cette technique peut être associée à des expériences étudiant les protéines transmembranaires, qui se comportent différemment dans des environnements de type radeau lipidique que dans des environnements non semblables à un radeau.

Dosage de l’échange lipidique dans les cellules vivantes

Apprenez l'essai APEGS pour déterminer quantitativement la palmitoylation des protéines membranaires cérébrales chez la souris. Cette méthode biochemique utilise les changements de mobilité en gel sans purification par affinité.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay pour détermination quantitative de la palmitoylation des protéines de membrane cérébrale

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