Test de compétition Oligopeptide pour la détermination du site de phosphorylation

L’objectif global de cette procédure est d’évaluer simultanément plusieurs sites de phosphorylation potentiels et d’identifier des sites pour une validation ultérieure par des mutants de sites de phosphorylation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biochimie et de la biologie cellulaire sur le rôle des modifications post-traductionnelles dans la signalisation cellulaire. Cette technique permet un criblage préliminaire facile et économique des sites de phosphorylation et de la protéine d’intérêt.

L’implication de cette technique s’est étendue au diagnostic et au traitement de maladies, y compris l’inflammation et le cancer, car la phosphorylation est un événement biochimique important dans les voies de signalisation des maladies humaines. L’aide à la démonstration serait assurée par Sol-Bi Shin, un étudiant diplômé de mon laboratoire, qui, tout en effectuant une mutagénèse dirigée. Combinez d’abord 50 nanogrammes de plasma pGEX JST NRF2, 125 nanogrammes d’amorce directe, 125 nanogrammes d’amorce inverse, un microlitre de DNTP mélangez 2,5 unités d’ADN polymérase PFU et 10x tampon de réaction sur glace.

Ajoutez de l’eau distillée stérile pour porter le volume à 50 microlitres. Effectuez une PCR pour incorporer le brin mutant, puis refroidissez l’échantillon sur de la glace pendant deux minutes. Ajoutez un microlitre d’enzyme de restriction DPNI à l’échantillon refroidi.

Mélangez l’échantillon avec un pipetage doux, puis centrifugez-le pendant une minute à 13 000 fois G.Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour digérer l’ADN double brin parental. Ensuite, jetez sur de la glace des cellules E. coli supercompétentes avec des mutations endA1 et RACA1. Ajoutez 50 microlitres du mélange réactionnel dans les cellules réfrigérées et incubez sur de la glace pendant 30 minutes.

Pendant ce temps, préchauffez un bloc chauffant à 42 degrés Celsius. Une fois l’incubation terminée, chauffez le mélange à 42 degrés Celsius pendant 90 secondes, puis refroidissez le mélange sur de la glace pendant deux minutes. Ajoutez du bouillon de lysogénie préchauffé aux cellules transformées.

Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant une heure tout en secouant à 180 tr/min. Ensuite, étalez les cellules sur des plaques de gélose à l’ampicilline LB et incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Transférez une seule colonie dans cinq millilitres de bouillon de Lysogeny avec de l’ampicilline.

Incuber les échantillons pendant la nuit à 37 degrés Celsius tout en secouant à 180 tr/min. Extrayez l’ADN de l’échantillon à l’aide d’un mini kit de préparation standard pour l’analyse de la séquence d’ADN. Exécutez au moins 200 nanogrammes de construction HDNA dans un analyseur d’ADN pour vérifier la séquence mutante.

Exprimer et purifier la protéine mutante NRF2 validée. Déterminer la quantité de NRF2 mutée produite avant de procéder au dosage des kinases. Pour commencer l’essai de compétition peptidique, préparez une solution tampon de kinase 5X avec une concentration d’adénosine monophosphate de 500 micromolaires.

Ensuite, décongelez des échantillons congelés d’AMPK de type sauvage humain NRF2 et de trois oliogopeptides imitant les sites de phosphorylation AMPK de NRF2. Pour chaque peptide, pendant que vous êtes sur la glace, combinez 0,43 milligramme du peptide avec 0,15 microgramme d’AMPK, 0,4 microgramme de NRF2 et six microlitres de tampon de kinase 5X. Ajouter de l’eau distillée stérile pour obtenir un volume final de 30 microlitres.

Ensuite, dans une zone protégée, réglez un bloc chauffant à 30 degrés Celsius. Ajoutez une microcurie d’ATP gamma 32P dans chaque tube, en mélangeant soigneusement chaque solution en pipetant de haut en bas. Incuber les mélanges réactionnels à 30 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes.

Pendant l’incubation, préparez 7,5 % de gel STS PAGE. Ajoutez ensuite trois microlitres de tampon d’échantillon 10X STS dans chaque tube et mélangez soigneusement pour arrêter la réaction kinase. Faites passer les échantillons dans le gel à 70 volts pendant 20 minutes, puis à 140 volts pendant une heure.

Une fois l’électrophorèse sur gel terminée, retirez soigneusement le gel hautement radioactif sous la ligne bleue du bromophénol. Transférez doucement le gel de la roulette dans un tube en verre. Fixez le gel dans une solution de 50 % de méthanol, 40 % d’eau et 10 % d’acide acétique pendant 20 minutes.

Ensuite, placez délicatement le gel sur du papier filtre et couvrez-le d’un film transparent. Séchez le gel avec un séchoir à gel sous vide pendant une heure à 80 degrés Celsius. Exposez le gel sec soit à un écran au phosphore, soit à un film radiographique pendant environ 16 heures pendant deux jours respectivement.

Utilisez un Phosphorimager pour générer un fichier TIFF ou Bitmap haute résolution de l’écran. Pour commencer l’activité de l’AMPK, analysez la décongélation d’échantillons d’AMPK et de GST NRF2 de type mutant et sauvage sur glace. Combinez 0,4 microgramme de GST NRF2 mutant avec 0,15 microgramme d’AMPK et six microlitres de tampon 5X Kinase.

Ajoutez de l’eau distillée stérile pour porter le volume à 30 microlitres. Préparez un autre mélange réactionnel de cette manière avec 0,4 microgramme de GST de type sauvage NRF2. Ajouter une microcurie d’ATP gamma 32P dans chaque flacon de réaction.

Pipetez les mélanges de haut en bas plusieurs fois, puis centrifugez brièvement les mélanges. Incuber les mélanges à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes dans une zone protégée, puis terminer la réaction kinase avec trois microlitres de tampon d’échantillon 10X STS. Exécutez STS PAGE, fixez le gel et séchez le gel dans les mêmes conditions que le test de kinase compétitive.

Exposez le gel à un tamis au phosphore pendant la nuit et scannez le tamis avec le Phosphorimager. Un test AMPK in vitro a été réalisé en présence de trois oligopeptides de 10 résidus imitant les sites de phosphorylation de l’AMPK sur NRF2 humain. L’oligopeptide imitant le site Serine 558 offrait la plus grande concurrence pour la phosphorylation de l’AMPK.

Un mutant NRF2 remplaçant la sérine 558 par de l’alanine a ensuite été synthétisé et évalué dans un test d’activité in vitro. Très peu de phosphorylation AMPK du mutant S558 A a été observée, indiquant que l’AMPK phosphoryle directement NRF2 humain à la sérine 558. Étant donné que les peptides se lient de manière compétitive aux protéines, le principe de cette méthode peut également être appliqué à l’identification d’autres modifications post-traduction, telles que l’acétylisation et les résidus de lysine et les interactions protéiques.

N’oubliez pas que travailler avec des radio-isotopes peut être extrêmement dangereux. Une formation sur la sécurité des radio-isotopes doit déjà être suivie avant d’effectuer cette procédure.