Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués

L’objectif global de ce test est de détecter les interactions protéine-ADN à l’aide de sondes non radioactives. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie moléculaire et de la biochimie, telles que la détermination de la séquence cible de l’ADN des protéines. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une alternative facile, sûre et rapide à l’utilisation de sondes radioactives.

Pour commencer cette procédure, préparez un gel de polyacrylamide natif à cinq pour cent contenant 0,5 fois plus de trisborate EDTA ou TBE, et 2,5 % de glycérol à l’aide d’un système de mini gel protéique. Pour préparer 30 millilitres de solution gélifiée pour quatre gels, mélangez de l’eau distillée, du TBE, du persulfate d’ammonium, du TEMED, de l’acrylamide bis et du glycérol. Passez immédiatement la solution gélifiée.

Après la polymérisation, enveloppez les gels dans une pellicule plastique transparente pré-humidifiée avec 0,5x TBE et stockez-les à quatre degrés Celsius. Ensuite, concevez un oligonucléotide long pour environ 51 mers. Concevoir des oligonucléotides courts complémentaires pour environ 14 mers avec modification du colorant fluorescent infrarouge à l’extrémité cinq principales.

Une fois les oligonucléotides préparés, les remettre en suspension dans 1x tampon Tris-EDTA jusqu’à une concentration finale de 100 micromolaires. Pour le recuit, mélangez 0,6 microlitre d’oligonucléotide court à cinq colorants primaires, 1,2 microlitre d’oligonucléotide long et 28,2 microlitres de tampon Tris-EDTA de chlorure de sodium dans un tube de 1,5 millilitre. Placez le tube dans de l’eau bouillante pendant cinq minutes, puis éteignez la source de chaleur et laissez l’eau avec les oligonucléotides recuits refroidir pendant la nuit dans l’obscurité.

Pour fabriquer des sondes d’ADN double brin, mélangez 30 microlitres d’oligonucléotides recuits avec des DNTP, un tampon Klenow, un marqueur à cinq premiers colorants Klenow et de l’eau distillée deux fois dans un tube PCR de 0,2 millilitre. Incuber le mélange pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius dans une machine PCR. Ensuite, ajoutez 3,4 microlitres d’EDTA 0,5 molaire pour arrêter la réaction et inactivez la chaleur à 75 degrés Celsius pendant 20 minutes dans la machine PCR.

Ensuite, diluez les sondes remplies avec du tampon Tris-EDTA de chlorure de sodium jusqu’à une concentration finale de 0,1 micromolaire. Conservez les oligonucléotides à moins 20 degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’au moment de l’utiliser. Pour préparer des sondes non marquées, mélangez 20 microlitres d’oligonucléotide long, 20 microlitres d’oligonucléotide Long R et 60 microlitres de tampon Tris-EDTA de chlorure de sodium dans un tube de 1,5 millilitre.

Placez le tube dans de l’eau bouillante pendant cinq minutes, puis éteignez la source de chaleur et laissez l’eau avec les oligos recuits refroidir pendant la nuit. Préparez un millilitre de tampon de liaison 5x en mélangeant du Tris HCl, du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du chlorure de magnésium, de l’EDTA, du DTT, du BSA et de l’eau distillée deux fois. Avant de mettre en place les réactions de liaison, pré-exécutez le gel de polyacrylamide natif à 5 % dans du TBE 0,5x et du glycérol à 2,5 % pour éliminer toutes les traces de persulfate d’ammonium à 80 volts pendant 30 minutes à une heure, ou jusqu’à ce que le courant ne varie plus avec le temps.

Ensuite, mélangez quatre microlitres de tampon de liaison 5x, 80 à 200 nanogrammes de protéine A purifiée, un microlitre de sonde conjuguée à colorant micromolaire de 0,1 micromolaire et de l’eau distillée deux fois. Incuber le mélange à température ambiante dans l’obscurité pendant 15 minutes. Après l’incubation, chargez toute la réaction de liaison sur le gel et faites fonctionner le gel à 10 volts par centimètre à la distance souhaitée.

Couvrez l’appareil à gel avec de l’aluminium pour garder le gel dans l’obscurité autant que possible. Nettoyez le lit du scanner d’un système d’imagerie infrarouge avec de l’eau distillée. Essuyez les plaques de verre contenant le gel et placez-les sur le lit du scanner.

Ouvrez le logiciel d’imagerie infrarouge et cliquez sur l’onglet Acquérir. Pour les plaques plus épaisses, utilisez les paramètres 700 pour le canal, automatique pour l’intensité, 84 micromètres pour la résolution, moyen pour la qualité et 3,5 millimètres pour le décalage de mise au point. Sélectionnez la zone occupée par le gel sur le scanner.

Enfin, cliquez sur Démarrer pour commencer l’analyse. La progression de l’électrophorèse peut être visualisée avec le colorant de chargement Orange G, tandis que le bleu de bromophénol est détecté lors du balayage et interfère donc avec l’analyse de l’image. L’ajout de dI-dC à la réaction de liaison a aboli la liaison du 6xHis-SOX-2 purifié avec les cinq sondes d’ADN à colorant premier.

Le mutant LIM-4 et la sonde froide SOX-2 mutés dans le site de liaison LIM-4 sont aussi efficaces que la sonde froide de type sauvage pour rivaliser avec la sonde marquée au colorant fluorescent infrarouge pour la liaison à 6xHis-SOX-2. Cependant, l’efficacité de compétition de la sonde froide mutante LIM-4 et SOX-2 mutée dans le site de liaison de SOX-2 est beaucoup plus faible que celle de la sonde froide de type sauvage pour la liaison à 6xHis-SOX-2. Les tests Supershift du complexe d’ADN SOX-2 à l’aide de 6xHis et d’épitopes de drapeau ont abouti à une bande d’ADN SOX-2 superdécalée.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à quatre heures si elle est bien exécutée. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder les sondes infrarouges dans l’obscurité. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’édition du génome CRISPR cas9 peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’importance d’une séquence de liaison à l’ADN particulière.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biochimie pour explorer les interactions protéine-ADN dans divers organismes modèles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer les interactions protéine-ADN à l’aide de marqueurs d’ADN non radioactifs. N’oubliez pas que travailler avec de l’acrylamide peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles qu’un équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.