Name: Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Apprenez un protocole fEMSA optimisé pour détecter les interactions protéine-ADN avec des sondes fluorescentes infrarouges. Cette méthode non radioactive offre une alternative sûre et efficace utilisant des protéines SOX-2 purifiées.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche Alfred P. Sloan (à C.-F.C.) et une subvention NIH R01 (5R01GM098026-05 à C.-F.C.). Nous remercions David Crowe pour l’accès au système d’imagerie infrarouge avancé.

REMARQUE: Les EMSA en utilisant des sondes d&#39;ADN marquées par fluorescence ou d&#39; autres formes d&#39;ADN marqué partagent les mêmes protocoles pour une protéine ou d&#39;une préparation d&#39;extrait cellulaire, la réaction de liaison protéine-ADN, et la préparation du gel PAGE et l&#39; exécution (figure 1A). Les principales différences sont des procédures d&#39;ADN d&#39;étiquetage, post-exécution des étapes de traitement de gel, et les méthodes de détection. 1. Préparation du gel <ol><li> Préparer 5% de gel de Polyacrylamide natif contenant 0,5 x TBE (45 mM de Tris-borate, 1 mM EDTA) et 2,5% de glycerol, en utilisant un système de gel de protéine mini-(8,3 cm de largeur x 7,3 cm d&#39;épaisseur longueur x 0,75 mm). <ol><li> Afin de préparer 30 ml de solution de gel pour 4 gels, mélanger 5 ml de 30% d&#39;acrylamide / bis (37,5: 1), 3 ml de 5 x TBE (0,45 M de Tris-borate, 10 mM d&#39;EDTA), 1,5 ml de glycerol à 50%, 300 pi de 10% persulfate d&#39; ammonium, 15 pi de TEMED et 20,2 ml de O 2 ddH soigneusement. NOTE: Acrylamide est nocif et toxique, à manipuler avec un équipement de protection individuelle approprié. </li&gt; </ol></li><li> Jeter immédiatement la solution de gel. Après polymérisation, envelopper les gels dans une pellicule de plastique transparent pré-humidifié avec 0,5x TBE et de les stocker à 4 ° C. </li></ol> 2. Préparation des sondes infrarouge Fluorescent Dye marqués REMARQUE: Conservez les oligonucléotides marqués par un colorant fluorescent infrarouge loin de la lumière autant que possible au cours de la préparation, le stockage et les expériences. <ol><li> Conception et commande oligonucléotides. <ol><li> Conception à long oligonucléotide pour ~ 51-mers. NOTE: La séquence de la / SOX-2 sonde LIM-4 oligonucléotide longue est TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. oligonucléotides longs ne nécessitent pas PAGE ou une purification par HPLC. </li><li> Concevoir des oligonucleotides courts complémentaires pour ~ 14 monomères avec une modification du colorant fluorescent infrarouge à l&#39;extrémité 5 &#39;(5&#39;Dye) et une température de fusion supérieure à 37 ° C. NOTE: La séquence d&#39;oligonucléotide courte de la LIM-4 / SOX-2 sonde est 5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTG. L&#39;échelle de synthèse minimale d&#39;oligonucléotides courts 5&#39;Dye marqués est de 100 nM. Par conséquent, les oligonucléotides nécessitent une purification par HPLC. </li></ol></li><li> oligonucléotides Remettre en suspension dans 1 x tampon de Tris-EDTA (TE: 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) jusqu&#39;à une concentration finale de 100 uM. </li><li> Recuire (Short 5&#39;Dye) et des oligonucléotides longs. <ol><li> Mélanger 0,6 pi de 5&#39;Dye-Short oligo (100 uM), 1,2 ul d&#39;oligo long (100 uM) et 28,2 ul de tampon chlorure de sodium-EDTA-Tris (STE: 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM d&#39;EDTA) dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Placer le tube dans l&#39;eau bouillante pendant 5 min. Eteignez la source de chaleur et de laisser l&#39;eau avec les oligos annelés refroidissent O / N dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> Remplissez surplombs 5 &#39;des recuits longs oligos 5&#39;Dye-Court / avec l&#39;ADN polymérase Klenow pour rendre doubles sondes ADN simple brin. <ol><li> Préparer la réaction en mélangeant30 pi de recuits courts longs oligos / avec 5&#39;Dye tag, 8,5 pi de 10x tampon Klenow, 1,7 pi de mM dNTP 10, 1,7 pi de Klenow (3 &#39;-&gt; 5&#39; exo) (5 u / ul), et 43,1 ul de ddH 2 O dans un tube de 0,2 ml PCR. </li><li> Incuber 60 min à 37 ° C dans une machine de PCR. </li><li> Ajouter 3,4 ul d&#39;EDTA 0,5 M pour arrêter la réaction et inactivent de chaleur à 75 ° C pendant 20 min dans une machine PCR. </li></ol></li><li> Les sondes diluées remplis à 0,7 pm (STE) à la concentration finale de 0,1 uM. </li><li> oligos Conserver à -20 ° C dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à l&#39;utilisation. Oligos peuvent être stockés pendant jusqu&#39;à un an dans cet état. REMARQUE: Pour générer des sondes d&#39;ADN avec des sites de liaison de mutants, les versions mutantes de longs oligonucléotides sont annelés avec des oligonucléotides courts 5&#39;Dye marqués, suivie de fill-in de 5 &#39;surplombs avec Klenow. Il a été démontré que la sonde avec un brin marqué par une fluorescence infrarougele colorant a seulement 30% de l&#39;intensité de la sonde avec les deux brins marqués avec le colorant. Si l&#39;intensité du signal doit être renforcé, de longues oligos des deux brins sont étiquetés avec des colorants fluorescents infrarouges à extrémités 5 &#39;et recuites pour faire des sondes marquées par un colorant fluorescent infrarouge. </li></ol> 3. Préparation du Unlabeled froid / Sondes (concurrents) Remarque: Longs oligonucléotides de séquences complémentaires (Long et LongR) ont été annelés pour faire des sondes non marquées pour l&#39;analyse de la concurrence avec des sondes marquées par un colorant fluorescent infrarouge. <ol><li> Mélanger 20 pi de 100 uM Long, 20 pl de 100 uM LongR oligonucléotides, et 60 pi de STE dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Placer le tube dans l&#39;eau bouillante pendant 5 minutes, éteignez la source de chaleur et de laisser l&#39;eau avec les oligos annelés refroidir pendant une nuit. </li></ol> 4. Réaction Binding et Électrophorèse <ol><li> Préparer 1 ml de tampon de liaison 5 fois en mélangeant 50 ul60, de 1 M de Tris-HCl, pH 7,5; 10 pl de 5 M de NaCl; 200 pi de KCl 1 M, 5 pl de 1 M de MgCl2, 10 pl de 0,5 M d&#39; EDTA, pH 8,0; 5 ul de 1 M DTT; 25 ul de 10 mg / ml de BSA et 695 ul de ddH 2 O. NOTE: Le 5x Binding Buffer peut être aliquote et stocké à -20 ° C. Un autre point à considérer est que les différents facteurs de transcription auront différentes modifications du tampon de liaison. </li><li> Juste avant la mise en place des réactions de liaison, pré-exécuter le gel de polyacrylamide natif de 5% de 0,5x TBE + 2,5% de glycérol pour éliminer toute trace de persulfate d&#39;ammonium à 80 V pour 30 - 60 min, ou jusqu&#39;à ce que le courant ne varie avec le temps. </li><li> Mettre en place la réaction de liaison dans un volume final de 20 ul. <ol><li> Mélanger 4 pi de tampon de liaison 5x, 80-200 ng de protéine purifiée A (50% de glycerol, à savoir, SOX-2), 1 ul de 0,1 uM de colorant sonde conjuguée (concntration: 5 nM), et ddH 2 O. </li><li> Facultatif: Lorsque les concurrents de sondes froides sont nécessaires, ajouter différentes concentrations (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) des sondes froides. </li><li> Facultatif: Lorsque l&#39;interaction entre les protéines A et B ( à savoir, SOX 2 et MFR-4) est testé, ajouter 80-200 ng de protéine purifiée B (50% de glycerol, à savoir MFR-4). </li><li> Facultatif: Une fois la préparation d&#39;extrait nucléaire est utilisé et la liaison spécifique de la protéine A est à valider, ajouter un anticorps spécifique à la protéine A (ie, anti-6xHis, anti-FLAG, etc.). </li><li> Incuber à R / T dans l&#39;obscurité pendant 15 min. </li></ol></li><li> Chargez tout de la réaction de liaison sur le gel et exécuter le gel à 10 V / cm à la distance souhaitée. </li></ol> 5. Imaging REMARQUE: Le gel a été balayée directement dans les plaques de verre avec un système d&#39;imagerie infrarouge avancé. Par conséquent, le gel peut être résolu de façon répétée et numérisé en outre (figures 1C et <strong&gt; 2). Un système d&#39;imagerie fluorescente proche infrarouge principalement pour Western blots a également été testé pour analyser le gel, mais seul le système d&#39;imagerie infrarouge de pointe est capable de scanner le gel avec une bonne résolution. La méthodologie décrite est spécifique à un logiciel particulier d&#39;imagerie infrarouge, bien que d&#39;autres logiciels peuvent être utilisés. <ol><li> Nettoyer le lit du scanner avec ddH 2 O et séchez bien avant la numérisation. Essuyez les plaques de verre du gel et placer les plaques contenant le gel sur la vitre du scanner. </li><li> Ouvrez le logiciel d&#39;imagerie infrarouge et passez à l&#39;onglet «Acquire». Lorsque la plaque mince (1 mm) est placé sur la vitre du scanner, utilisez les paramètres de canal: 700, Intensité: Auto, Résolution: 169 um, Qualité: moyenne, et Focus offset: 1,5 mm. Lorsque la plaque plus épaisse (3 mm) est placé sur la vitre du scanner, utilisez les paramètres de canal: 700, Intensité: Auto, Résolution: 84 pm, Qualité: moyenne, et Focus offset: 3,5 mm. décalage de focalisation dépend de lal&#39;épaisseur de la plaque de verre. </li><li> Sélectionnez la zone que le gel occupe sur le scanner. Cliquez sur &#39;Start&#39; pour lancer la numérisation. </li><li> Répétez l&#39;électrophorèse et de numérisation en outre, si nécessaire. </li></ol>

<ol><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA%2C+ssDNA+or+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li>
<li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+background+problems+in+nonradioactive+northern+and+Southern+blot+analyses+enables+higher+sensitivity+than+32P-based+hybridizations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations.</a> Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).</li>
<li>Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-color+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+detecting+both+nucleic+acids+and+protein+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels.</a> Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).</li>
<li>Alqadah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmitotic+diversification+of+olfactory+neuron+types+is+mediated+by+differential+activities+of+the+HMG-box+transcription+factor+SOX-2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2.</a> EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).</li>
<li>Jullien, N., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUEGO%3A+a+cost+and+time+saving+gel+shift+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure.</a> Biotechniques. 51, 267-269 (2011).</li>
<li>Poulin-Laprade, D., Burrus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Radiolabeled+DNA+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes.</a> Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).</li>
<li>Ruscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+based+non-radioactive+electrophoretic+mobility+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay.</a> J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+goes+beyond+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Sox2 goes beyond stem cell biology.</a> Cell cycle. , (2016).</li>
<li>Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+competitor+poly%28dI-dC%29.poly%28dI-dC%29+levels+is+advised+in+DNA-protein+interaction+studies+involving+enriched+nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins.</a> Biotechniques. 20, 439-444 (1996).</li>
<li>Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+detection+of+biotin-protein+conjugates+with+a+green+fluorescent+streptavidin+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe.</a> Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).</li>
<li>Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+fluorescent+electrophoretic+mobility+shift+assay+improved+for+the+quantitative+and+multiple+analysis+of+protein-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).</li>
<li>Steiner, S., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+electrophoretic+mobility+shift+assay+in+the+analysis+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins.</a> Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

fEMSAs sont un outil efficace pour étudier les interactions protéine-ADN, et sont une alternative à un marquage radioactif de l&#39;ADN. Les colorants fluorescents tels que les colorants infrarouges sont disponibles dans le commerce, et de fournir une méthode plus sûre et plus respectueuse de l&#39;environnement par rapport à l&#39;étiquetage radioactif de l&#39;ADN. EMSA utilisant fluorescentes infrarouge oligonucléotides marqués par un colorant ne nécessitent pas d&#39;étapes postrun de traitement de gel, et donc de g...

EMSA sont utilisés pour analyser les interactions entre l&#39; ADN et les protéines en utilisant l&#39; électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (PAGE) pour résoudre un mélange d&#39;une protéine d&#39;intérêt et une sonde d&#39;ADN marquée contenant des sites cibles potentiels de la protéine 1. Une sonde d&#39;ADN liée à la protéine migre plus lentement par rapport à une sonde d&#39;ADN libre, et est donc retardé dans sa migration à travers une matrice de polyacrylamide. Le marquage radioactif de l&#39; ADN par 32P a été la principale méthode pour la détection dans EMSA. Bien que l&#39;application de radiomarquage dans la recherche biochimique a été bénéfique, les méthodes de remplacement marquage d&#39;ADN avec une sensibilité comparable sont employés en raison des risques pour la santé et la sécurité associés à la radioactivité de manutention. Ces méthodes comprennent la conjugaison de l&#39; ADN avec de la biotine ou la digoxigénine 2 (DIG) 3 (dont les deux sont ensuite détectés par des systèmes de chimioluminescence), SYBR coloration verte des gels PAGE 4,ou la détection directe des conjugués colorant ADN fluorescent en scannant le 5,6 gel. Les gels de résolus EMSA en utilisant des sondes d&#39;ADN radiomarquées nécessitent un traitement postrun à travers des films d&#39;autoradiographie ou un système Phosphorimager pour détecter des signaux radioactifs 1,7. Gels de 2 EMSA à l&#39; aide de biotine ou DIG-conjugués sondes d&#39;ADN 3 doivent également être traitées et transférées sur une membrane appropriée et ensuite détectés par chimioluminescence 6. SYBR coloration verte du gel nécessite une coloration de gel postrun et un scanner fluorescent 4. Etant donné que les étapes de traitement de gel de postrun sont nécessaires pour EMSA à l&#39;aide des techniques de marquage d&#39;ADN, le gel peut être résolu doser une seule fois. En revanche, les sondes d&#39;ADN marquées avec des fluorophores peuvent être directement détectés dans le gel à l&#39;intérieur des plaques de verre par un scanner. Par conséquent, les interactions ADN-protéines peuvent être surveillés et analysés plusieurs fois à différents moments pendant la course, quiréduit considérablement le temps et le coût. Les conjugués de colorant d&#39; ADN fluorescent qui ont été utilisés pour EMSA comprennent 6,8 Cy3, Cy5 6,8, 9 fluorescéine, et des colorants fluorescents infrarouges 4-6. la régulation transcriptionnelle nécessite des interactions protéine-ADN des facteurs de transcription et de leurs gènes cibles. La coordination de ces interactions génère divers types de cellules à partir d&#39;un ancêtre commun au cours du développement des animaux. Un écran avant génétique impartiale a identifié une mutation faux - sens, G73E, dans le domaine HMG liaison à l&#39; ADN hautement conservée du Caenorhabditis elegans facteur de transcription SOX-2. Les résultats de mutation dans une transformation d&#39;identité de cellule de AWB neurones olfactifs dans AWC neurones olfactifs aux niveaux moléculaires, morphologiques et fonctionnels 5,10. SOX-2 régule de façon différentielle la différenciation terminale des neurones AWB et AWC en interagissant avec des facteurs de transcription partenaire dépendant du contexte et respectiveDes sites cibles d&#39;ADN. 5,10 SOX-2 partenaires avec LIM-4 (LHX) dans le terminal AWB différenciation neuronale, tandis que SOX-2 partenaires avec CEH-36 (OTX / OTD) dans le terminal AWC différenciation neuronale. Dosages de rapporteur luciférase montrent que SOX-2 et mutantes SOX-2 protéines G73E ont des interactions de coopération avec des cofacteurs de transcription LIM-4 et CEH-36 pour activer un promoteur exprimé dans les neurones AWB et AWC. Cependant, SOX-2 et mutant SOX-2 G73E affichent des propriétés d&#39;activation différentielle du promoteur. Pour étudier la base moléculaire des activités de liaison d&#39;ADN dérivées de SOX-2 et SOX-2 G73E, fEMSAs ont été réalisées avec ces protéines et leurs sites cibles potentiels. En premier lieu, une approche de la bio-informatique a été d&#39;identifier les séquences de liaison au sein de la région promotrice de 1 kb utilisée dans le dosage de la luciférase ADN biologiquement pertinent. Depuis plusieurs SOX-2 sites de liaison potentiels étaient présents tout au long du promoteur, nous nous sommes concentréssur SOX-2 sites de liaison prévus adjacents aux sites de liaison putative CEH-36 ou LIM-4 et évolutivement conservées entre les différentes espèces de nématodes. Ces séquences ont été supprimés ou mutés, et ensuite testés in vivo pour leur activité pour exprimer GFP transgènes rapporteurs dans les neurones AWB ou AWC. Grâce à cette approche, nous avons identifié 2-SOX sites cibles potentiels LIM-4 / SOX-2 et CEH-36 / adjacents qui sont spécifiquement nécessaires à l&#39;expression de la GFP dans AWB et AWC neurones, respectivement 5. Nous avons étudié les différences possibles dans la liaison à l&#39; ADN de SOX-2 et SOX-2 G73E utilisant FEMSA avec les CEH-36 / SOX-2 sites cibles adjacents identifiés LIM-4 / SOX-2 et. Notre analyse EMSA a montré que SOX-2 G73E ne se lie pas la sonde d&#39;ADN contenant les LIM-4 / SOX-2 sites cibles adjacents (requis pour l&#39; expression génique dans AWB) aussi efficacement que WT SOX-2 ont fait. Cependant, SOX-2 et SOX-2 G73E avait pas de différence dans la liaison de la sonde d&#39;ADN contenant le CEH-36 / SOX-2 adjacent site cible (requis pour l&#39; expression génique dans AWC) 5,10. Notre analyse FEMSA donner un aperçu mécaniste de la nature de la mutation G73E SOX-2 affecter l&#39; activité spécifique de liaison à l&#39; ADN de l&#39;identité cellulaire phénotype de transformation AWB à AWC. Ici, nous décrivons un protocole optimisé de FEMSA utilisant 6xHis-SOX-2 purifiés ou 6xHis-SOX-2 G73E avec fluorescentes infrarouge sondes d&#39;ADN marquées par un colorant contenant les LIM-4 / SOX-2 sites cibles adjacents comme une étude de cas pour faire face une question biologique importante.

<table><tbody><tr><td>Solution d’acrylamide/bis à 30 %, 37,5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>Acrylamide est nocif et toxique.</td></tr><tr><td>6x-his Epitope Tag Anticorps (HIS. H8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-drapeau M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) grade de biologie moléculaire</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td> Oligos d’ADN marqués <td></td></tr><tr><td>5'IRDye700 Technologies d’ADN</td><td></td><td>intégrées Oligos d’ADN personnalisés</td><td>Ces oligos sont appelés « oligos d’ADN marqués à un colorant 5' ou marqués à un colorant fluorescent infrarouge » dans le manuscrit. La société synthétisera sur mesure des oligonucléotides d’ADN marqués 5' IRDye. Nécessite un minimum de 100 &mu ; Synthèse à l’échelle M et purification HPLC.</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'-->5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp ; Cellule d’électrophorèse verticale</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC&nbsp ;</td><td>C’est ce qu’on appelle un « système de mini gel protéique » dans le manuscrit. N’importe quel système électrophorétique peut être utilisé à condition qu’il s’agisse de plaques de verre transparent de moins de 25 cm x 25 cm.</td></tr><tr><td>Système d’imagerie infrarouge Odyssey CLx</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Système d’imagerie infrarouge Odyssey CLx</td><td>Ce système est appelé « système d’imagerie infrarouge avancé » dans le manuscrit.</td></tr><tr><td>Système d’imagerie Odyssey fc&nbsp ;</td>Système <td>d’imagerie bimode</td> <td>LI-COR Biotechnology</td> Odyssey Fc Ce système est <td>appelé « système d’imagerie fluorescent proche infrarouge principalement pour les transferts Western » dans le manuscrit.</td></tr><tr><td>Logiciel Image Studio (version 4.0)</td><td>Logiciel LI-COR Biotechnology</td><td>Image Studio&nbsp ;</td><td>C’est ce qu’on appelle un « logiciel d’imagerie particulier » dans le manuscrit.</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x Colorant</td><td></td><td></td> de charge orange <td>0,25 % Orange G ; 30 % Glycérol</td></tr><tr><td>0,5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM Tris-Borate ; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl ; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 1 mM</td></tr><tr><td>EDTA 5x tampon</td><td></td><td></td> <td>de liaison50 mM de Tris-HCl, pH 7,5 ; 50 mM de NaCl ; 200 mM KCl ; 5 mM de MgCl2 ; 5 mM d’EDTA, pH de 8,0 ; 5 mM TNT ; 250 et #956 ; g/mL BSA</td></tr></tbody></table>

un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique maj assay utilisant oligonucleotides infrarouge fluorescent dye marqués

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Les analyses électrophorétiques de décalage de mobilité (EMSA) sont un outil instrumental pour caractériser les interactions entre les protéines et leurs séquences d&#39;ADN cibles. Radioactivité a été la principale méthode de marquage d&#39;ADN dans EMSA. Cependant, les progrès récents dans les colorants fluorescents et les méthodes d&#39;analyse ont conduit à l&#39;utilisation d&#39;un marquage fluorescent de l&#39;ADN comme une alternative à la radioactivité pour les avantages de la facilité de manipulation, un gain de temps, ce qui réduit le coût et en améliorant la sécurité. Nous avons récemment utilisé EMSA fluorescent (FEMSA) pour traiter avec succès une question biologique importante. Notre analyse FEMSA fournit une approche mécanistique dans l&#39;effet d&#39;une mutation faux-sens, G73E, dans le HMG facteur de transcription SOX-2 hautement conservée sur la diversification du type de neurone olfactif. Nous avons constaté que mutantes SOX-2 protéines G73E modifie l&#39; activité de liaison spécifique de l&#39; ADN, provoquant ainsi olfactive transformation identitaire des neurones. Ici, nous présentons un optimisé et rentable, étape par étape protocolepour FEMSA en utilisant des oligonucléotides marqués par un colorant fluorescent infrarouge contenant les LIM-4 / SOX-2 sites cibles adjacents et purifiés SOX-2 protéines (WT et mutantes SOX-2 protéines G73E) comme un exemple biologique.

Orange G colorant de chargement (6x: 0,12 g d&#39;orange G dans 100 ml de glycerol à 30%) peut être ajouté à la réaction de liaison avant le chargement de visualiser la progression de l&#39;électrophorèse. D&#39; autres colorants de chargement , y compris le bleu de bromophénol seront détectés lors de la numérisation et donc interférer avec l&#39; analyse d&#39;image (figure 1B). Dans certains cas d&#39;EMSA, ...

Nous décrivons ici un protocole optimisé de électrophorétiques Assays Mobility Shift fluorescentes (FEMSA) en utilisant SOX-2 protéines purifiées avec infrarouges fluorescentes sondes d&#39;ADN marquées par un colorant comme une étude de cas pour aborder une question biologique importante.

Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

L'objectif général de ce test est de détecter les interactions protéine-ADN à l'aide de sondes non radioactives. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie moléculaire et de la biochimie, telles que la détermination de la séquence cible d'ADN des protéines. Le principal avantage de cette technique est qu'elle constitue une alternative simple, sûre et économique en temps à l'utilisation de sondes radioactives.Pour commencer cette procédure, préparez un gel natif de polyacrylamide à cinq pour cent contenant 0,5x tris borate EDTA ou TBE, et 2,5 % de glycérol à l’aide d’un système de gel protéique mini. Pour préparer 30 millilitres de solution de gel destinée à quatre gels, mélangez de l’eau distillée, du TBE, du persulfate d’ammonium, du TEMED, de l’acrylamide bis et du glycérol. Faites passer immédiatement la solution de gel.Après polymérisation, envelopper les gels dans un film plastique transparent préalablement humidifié avec du TBE 0,5x et les conserver à quatre degrés Celsius. Ensuite, concevoir un oligonucléotide long d'environ 51 nucléotides. Concevoir des oligonucléotides courts complémentaires d'environ 14 nucléotides, modifiés par un marqueur fluorescent infrarouge à l'extrémité cinq prime.Une fois les oligonucléotides préparés, remettez-les en suspension dans du tampon Tris-EDTA 1x pour obtenir une concentration finale de 100 micromolaire. Pour le recuit, mélangez 0,6 microlitre d'oligonucléotide court marqué avec un fluorophore en extrémité 5', 1,2 microlitre d'oligonucléotide long et 28,2 microlitres de tampon Tris-EDTA au chlorure de sodium dans un tube de 1,5 millilitre. Placez le tube dans de l'eau bouillante pendant cinq minutes, puis éteignez la source de chaleur et laissez refroidir l'eau contenant les oligonucléotides recuits pendant toute la nuit à l'abri de la lumière.Pour préparer des sondes d'ADN double brin, mélanger 30 microlitres des oligonucléotides appariés avec des DNTP, du tampon Klenow, du marqueur coloré Klenow à l'extrémité 5', et de l'eau doublement distillée dans un tube PCR de 0,2 millilitre. Incuber le mélange pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius dans un appareil PCR. Ensuite, ajouter 3,4 microlitres d'EDTA 0,5 molaire pour arrêter la réaction, puis inactiver par chauffage à 75 degrés Celsius pendant 20 minutes dans l'appareil PCR.Après cela, diluez les sondes remplies avec du tampon chlorure de sodium Tris-EDTA jusqu'à une concentration finale de 0,1 micromolaire. Conservez les oligonucléotides à moins 20 degrés Celsius à l'abri de la lumière jusqu'à leur utilisation. Pour préparer les sondes non marquées, mélangez 20 microlitres d'oligonucléotide long, 20 microlitres d'oligonucléotide Long R et 60 microlitres de tampon chlorure de sodium Tris-EDTA dans un tube de 1,5 millilitre.Placer le tube dans de l'eau bouillante pendant cinq minutes, puis éteindre la source de chaleur et laisser refroidir l'eau contenant les oligonucléotides appariés toute la nuit. Préparer un millilitre de tampon de liaison 5x en mélangeant Tris HCl, chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlorure de magnésium, EDTA, DTT, BSA et de l'eau doublement distillée. Avant de préparer les réactions de liaison, faire une pré-électrophorèse du gel de polyacrylamide natif 5 % dans du TBE 0,5x et 2,5 % de glycérol afin d'éliminer toutes les traces de persulfate d'ammonium, à 80 volts pendant 30 minutes à une heure, ou jusqu'à ce que le courant ne varie plus dans le temps.Ensuite, mélanger quatre microlitres de tampon de liaison 5x, 80 à 200 nanogrammes de la protéine A purifiée, un microlitre de sonde marquée avec un colorant à 0,1 micromolaire et de l'eau doublement distillée. Incuber le mélange à température ambiante à l'abri de la lumière pendant 15 minutes. Après l'incubation, charger l'ensemble de la réaction de liaison sur le gel et faire migrer le gel à 10 volts par centimètre sur la distance souhaitée.Couvrez l'appareil à gel avec de l'aluminium pour maintenir le gel à l'abri de la lumière autant que possible. Nettoyez le plateau du scanner d'un système d'imagerie infrarouge avec de l'eau distillée. Essuyez soigneusement les plaques de verre contenant le gel et placez-les sur le plateau du scanner.Ouvrez le logiciel d'imagerie infrarouge et cliquez sur l'onglet Acquérir. Pour les plaques plus épaisses, utilisez les paramètres suivants : 700 pour le canal, auto pour l'intensité, 84 micromètres pour la résolution, qualité moyenne et un décalage de mise au point de 3,5 millimètres. Sélectionnez la zone occupée par le gel sur le numériseur.Enfin, cliquez sur Démarrer pour commencer le balayage. L'avancement de l'électrophorèse peut être visualisé à l'aide du colorant de charge Orange G, tandis que le bleu de bromophénol est détecté lors du balayage et interfère donc avec l'analyse d'image. L'ajout de dI-dC à la réaction de liaison a supprimé la liaison du SOX-2 purifié 6xHis avec les sondes d'ADN marquées en extrémité 5′.Le mutant LIM-4 et la sonde froide SOX-2, dont le site de fixation de LIM-4 est muté, sont aussi efficaces que la sonde froide de type sauvage pour concurrencer la sonde marquée au colorant fluorescent infrarouge en vue de sa liaison à 6xHis-SOX-2. Toutefois, l'efficacité de compétition de la sonde froide doublement mutée (dans le site de fixation de SOX-2) pour LIM-4 et SOX-2 est nettement inférieure à celle de la sonde froide de type sauvage pour la liaison à 6xHis-SOX-2. Des essais de supersélectivité du complexe ADN-SOX-2, utilisant des épitopes 6xHis et Flag, ont conduit à l'apparition d'une bande ADN-SOX-2 décalée vers le haut.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir les sondes infrarouges à l'abri de la lumière. Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'édition du génome par CRISPR cas9 peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'importance d'une séquence particulière de liaison à l'ADN.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biochimie pour explorer les interactions protéine-ADN chez divers organismes modèles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment déterminer les interactions protéine-ADN à l'aide de marqueurs d'ADN non radioactifs. N'oubliez pas que le travail avec l'acrylamide peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

an-optimized-protocol-for-electrophoretic-mobility-shift-assay-using

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Cette vidéo décrit la méthode d’analyse de l’interaction protéine-ligand par électrophorèse capillaire d’affinité de déplacement de mobilité. Cette méthode peut être utilisée pour caractériser le comportement de liaison d’une protéine avec divers ligands chargés.

Électrophorèse capillaire d’affinité de décalage de mobilité : une méthode pour analyser les interactions échantillon-ligand en fonction de la migration différentielle de complexes protéine-ligand

Dans cette vidéo, nous démontrons le test de décalage de mobilité électrophorétique pour détecter les interactions protéine-ADN à l’aide de sondes d’ADN marquées par fluorescence infrarouge. Lorsque la protéine se lie à la sonde d’ADN, elle forme un grand complexe qui migre lentement et apparaît comme une bande décalée sur le gel.

Essai de décalage de mobilité électrophorétique pour la détection de complexes facteur de transcription-ADN

Les études de biomolécules in vivo sont cruciales pour comprendre la fonction moléculaire dans un contexte biologique. Nous décrivons ici une nouvelle méthode permettant l’internalisation de biomolécules fluorescentes, telles que l’ADN ou les protéines, dans des micro-organismes vivants. L’analyse des données in vivo enregistrées par microscopie à fluorescence est également présentée et discutée.

Internalisation et l&#39;Observation des Biomolécules Fluorescent In Living micro-organismes par électroporation

Nous présentons ici un protocole d'analyser les interactions ARN / protéines. L'essai de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) est basé sur la migration différentielle des complexes ARN / ARN et de protéine libre pendant l'électrophorèse sur gel natif. En utilisant une sonde d'ARN radiomarqué, complexes / protéine ARN peuvent être visualisés par autoradiographie.

Maj de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) pour l&#39;étude des interactions ARN-protéine: L&#39;IRE / IRP Exemple

Nous présentons un plan stratégique et un protocole pour identifier les variants génétiques non codants affectant la liaison à l’ADN du facteur de transcription (TF). Un protocole expérimental détaillé est fourni pour l’analyse du test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) et du test de précipitation d’affinité de l’ADN (DAPA) de la liaison de l’ADN TF dépendant du génotype.

Le dépistage de la fonctionnelle non-codant des variants génétiques utilisant mobilité électrophorétique Maj Assay (EMSA) et l&#39;ADN-affinité Précipitations Assay (DAPA)

L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental pour analyser les interactions ARN-protéines. Traditionnellement, la plupart des expériences ont utilisé des gels verticaux. Cependant, les gels horizontaux offrent plusieurs avantages, tels que la possibilité de surveiller les complexes lors de l'électrophorèse. Nous fournissons un protocole détaillé pour la génération et l'utilisation d'électrophorèse sur gel horizontal horizontal.

Électrophorèse de gel horizontal pour une détection améliorée des complexes protéine-ARN

Ce protocole décrit la caractérisation de la synthèse de l’ADN polymérase d’ADN modifié grâce à l’observation des changements à l’ADN fluorescent étiqueté proche infrarouge à l’aide de l’électrophorèse sur gel et gel de l’imagerie. Gels d’acrylamide sont utilisés pour l’imagerie haute résolution de la séparation des acides nucléiques courts, qui migrent à des vitesses différentes selon la taille.

Analyse d’activité de l’ADN polymérase utilisant l’ADN marqué Fluorescent proche infrarouge visualisée par électrophorèse sur Gel d’Acrylamide

Nous présentons ici un protocole pour utiliser thiazole orange pour la détection de l’ADN dans les expériences d’électrophorèse de gel. L’utilisation d’orange thiazole permet d’éliminer le bromure d’éthidium, et la détection par fluorescence peut être réalisée avec UV ou lumière bleue.

Électrophorèse d’ADN à l’aide de Thiazole Orange au lieu de bromure d’éthidium ou autres colorants

Présentés ici sont des protocoles pour les essais biochimiques in vitro utilisant des étiquettes de biotine qui peuvent être largement applicables pour étudier les interactions protéines-acides nucléiques.

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions In Vitro Biochemical As

Ici, un protocole pour doser les enzymes métabolisant les acides nucléiques est présenté, à l’aide d’exemples d’enzymes ligase, nucléase et polymérase. Le test utilise des oligonucléotides marqués par fluorescence et non marqués qui peuvent être combinés pour former des duplex imitant les dommages à l’ARN et/ou à l’ADN ou les intermédiaires de voie, permettant la caractérisation du comportement enzymatique.

Utilisation d’oligonucléotides synthétiques modifiés pour doser des enzymes métabolisant des acides nucléiques

Apprenez un protocole fEMSA optimisé pour détecter les interactions protéine-ADN avec des sondes fluorescentes infrarouges. Cette méthode non radioactive offre une alternative sûre et efficace utilisant des protéines SOX-2 purifiées.

Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués (Vidéo) | JoVE Journal

Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués

Explorer plus de vidéos