Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués

L'objectif général de ce test est de détecter les interactions protéine-ADN à l'aide de sondes non radioactives. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie moléculaire et de la biochimie, telles que la détermination de la séquence cible d'ADN des protéines. Le principal avantage de cette technique est qu'elle constitue une alternative simple, sûre et économique en temps à l'utilisation de sondes radioactives.

Pour commencer cette procédure, préparez un gel natif de polyacrylamide à cinq pour cent contenant 0,5x tris borate EDTA ou TBE, et 2,5 % de glycérol à l’aide d’un système de gel protéique mini. Pour préparer 30 millilitres de solution de gel destinée à quatre gels, mélangez de l’eau distillée, du TBE, du persulfate d’ammonium, du TEMED, de l’acrylamide bis et du glycérol. Faites passer immédiatement la solution de gel.

Après polymérisation, envelopper les gels dans un film plastique transparent préalablement humidifié avec du TBE 0,5x et les conserver à quatre degrés Celsius. Ensuite, concevoir un oligonucléotide long d'environ 51 nucléotides. Concevoir des oligonucléotides courts complémentaires d'environ 14 nucléotides, modifiés par un marqueur fluorescent infrarouge à l'extrémité cinq prime.

Une fois les oligonucléotides préparés, remettez-les en suspension dans du tampon Tris-EDTA 1x pour obtenir une concentration finale de 100 micromolaire. Pour le recuit, mélangez 0,6 microlitre d'oligonucléotide court marqué avec un fluorophore en extrémité 5', 1,2 microlitre d'oligonucléotide long et 28,2 microlitres de tampon Tris-EDTA au chlorure de sodium dans un tube de 1,5 millilitre. Placez le tube dans de l'eau bouillante pendant cinq minutes, puis éteignez la source de chaleur et laissez refroidir l'eau contenant les oligonucléotides recuits pendant toute la nuit à l'abri de la lumière.

Pour préparer des sondes d'ADN double brin, mélanger 30 microlitres des oligonucléotides appariés avec des DNTP, du tampon Klenow, du marqueur coloré Klenow à l'extrémité 5', et de l'eau doublement distillée dans un tube PCR de 0,2 millilitre. Incuber le mélange pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius dans un appareil PCR. Ensuite, ajouter 3,4 microlitres d'EDTA 0,5 molaire pour arrêter la réaction, puis inactiver par chauffage à 75 degrés Celsius pendant 20 minutes dans l'appareil PCR.

Après cela, diluez les sondes remplies avec du tampon chlorure de sodium Tris-EDTA jusqu'à une concentration finale de 0,1 micromolaire. Conservez les oligonucléotides à moins 20 degrés Celsius à l'abri de la lumière jusqu'à leur utilisation. Pour préparer les sondes non marquées, mélangez 20 microlitres d'oligonucléotide long, 20 microlitres d'oligonucléotide Long R et 60 microlitres de tampon chlorure de sodium Tris-EDTA dans un tube de 1,5 millilitre.

Placer le tube dans de l'eau bouillante pendant cinq minutes, puis éteindre la source de chaleur et laisser refroidir l'eau contenant les oligonucléotides appariés toute la nuit. Préparer un millilitre de tampon de liaison 5x en mélangeant Tris HCl, chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlorure de magnésium, EDTA, DTT, BSA et de l'eau doublement distillée. Avant de préparer les réactions de liaison, faire une pré-électrophorèse du gel de polyacrylamide natif 5 % dans du TBE 0,5x et 2,5 % de glycérol afin d'éliminer toutes les traces de persulfate d'ammonium, à 80 volts pendant 30 minutes à une heure, ou jusqu'à ce que le courant ne varie plus dans le temps.

Ensuite, mélanger quatre microlitres de tampon de liaison 5x, 80 à 200 nanogrammes de la protéine A purifiée, un microlitre de sonde marquée avec un colorant à 0,1 micromolaire et de l'eau doublement distillée. Incuber le mélange à température ambiante à l'abri de la lumière pendant 15 minutes. Après l'incubation, charger l'ensemble de la réaction de liaison sur le gel et faire migrer le gel à 10 volts par centimètre sur la distance souhaitée.

Couvrez l'appareil à gel avec de l'aluminium pour maintenir le gel à l'abri de la lumière autant que possible. Nettoyez le plateau du scanner d'un système d'imagerie infrarouge avec de l'eau distillée. Essuyez soigneusement les plaques de verre contenant le gel et placez-les sur le plateau du scanner.

Ouvrez le logiciel d'imagerie infrarouge et cliquez sur l'onglet Acquérir. Pour les plaques plus épaisses, utilisez les paramètres suivants : 700 pour le canal, auto pour l'intensité, 84 micromètres pour la résolution, qualité moyenne et un décalage de mise au point de 3,5 millimètres. Sélectionnez la zone occupée par le gel sur le numériseur.

Enfin, cliquez sur Démarrer pour commencer le balayage. L'avancement de l'électrophorèse peut être visualisé à l'aide du colorant de charge Orange G, tandis que le bleu de bromophénol est détecté lors du balayage et interfère donc avec l'analyse d'image. L'ajout de dI-dC à la réaction de liaison a supprimé la liaison du SOX-2 purifié 6xHis avec les sondes d'ADN marquées en extrémité 5′.

Le mutant LIM-4 et la sonde froide SOX-2, dont le site de fixation de LIM-4 est muté, sont aussi efficaces que la sonde froide de type sauvage pour concurrencer la sonde marquée au colorant fluorescent infrarouge en vue de sa liaison à 6xHis-SOX-2. Toutefois, l'efficacité de compétition de la sonde froide doublement mutée (dans le site de fixation de SOX-2) pour LIM-4 et SOX-2 est nettement inférieure à celle de la sonde froide de type sauvage pour la liaison à 6xHis-SOX-2. Des essais de supersélectivité du complexe ADN-SOX-2, utilisant des épitopes 6xHis et Flag, ont conduit à l'apparition d'une bande ADN-SOX-2 décalée vers le haut.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir les sondes infrarouges à l'abri de la lumière. Après cette procédure, d'autres méthodes comme l'édition du génome par CRISPR cas9 peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'importance d'une séquence particulière de liaison à l'ADN.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs du domaine de la biochimie pour explorer les interactions protéine-ADN chez divers organismes modèles. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment déterminer les interactions protéine-ADN à l'aide de marqueurs d'ADN non radioactifs. N'oubliez pas que le travail avec l'acrylamide peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle, doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.