Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca²⁺ codés génétiquement (GECI)

Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones.

L’étudiant diplômé Zhe Zhang, le spécialiste de la recherche Nannan Zhang, les professeurs Illker Ozden et Shinghua Ding feront la démonstration de la procédure. L’objectif global de cette procédure est de développer des astrocytes de paires spécifiques au type cellulaire et les neurones et la méthode de ciblage mitochondrial pour les comptes mitochondriaux in vitro et in vivo de l’imagerie en utilisant l’indicateur de calcium génétiquement codé, GCaMP5G et 6s. Pour l’imagerie in vitro ou in vivo, nous allons construire des plasmides d’ADN contenant des promoteurs spécifiques d’astrocytes ou de neurones gfaABC1D ou CaMKII et des indicateurs de calcium génétiquement codés, GCaMP5G/6s avec des séquences de ciblage mitochondrial.

Pour l’imagerie calcique mitochondriale in vitro, nous avons transfecté des neurones astrocytes cultivés sur des feuillets de couverture en verre avec les plasmides d’ADN susmentionnés en utilisant la méthode Lipofectamine. L’imagerie peut être commencée un à deux jours après la transfection en transférant les feuillets de couverture en verre dans la chambre de profusion sous un microscope à épifluorescence ou à deux photons. Voici des exemples de signaux fluorescents provenant de mitochondries et d’un astrocyte exprimant GCaMP6s à gauche, et pour les mitochondries dans un neurone, exprimant GCaMP5G à droite.

Pour l’imagerie in vivo, nous avons préparé l’adénovirus associé au sérotype 5 pour l’expression du mito-GCaMP5G dans les astrocytes et l’adénovirus associé au sérotype 9 pour l’expression du mito-GCaMP6s dans les neurones. Pour les chirurgies d’injection de virus stéréotaxiques, nous avons d’abord anesthésié la souris avec 3% d’isoflurane. Plus tard au cours de la chirurgie, les niveaux d’isoflurane sont réduits à 2% Une fois le niveau d’anesthésie approprié atteint, les cheveux sur le cuir chevelu sont rasés et la souris est positionnée sur un instrument chirurgical stéréotaxe.

Une pommade ophtalmique est appliquée sur les yeux pour les protéger pendant la chirurgie. Les chirurgies d’injection sont effectuées en utilisant des procédures aseptiques, y compris des instruments stériles et des techniques aseptiques. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés soit par autoclavage, soit par un stérilisateur de perles chaudes.

Une fois la souris montée sur la stéréotaxe, le cuir chevelu est nettoyé trois fois avec de la bétadine et de l’éthanol à 70%. Ensuite, la peau est ouverte le long de l’axe Bregma Lambda et la verticale est faite par une perceuse à grande vitesse sur l’emplacement cible. Dans ce travail, nous avons ciblé soit le cortex moteur, soit le paracortex.

Une seringue Hamilton de calibre 33 transportant un vecteur adénovirus associé est insérée à travers le trou dans le cerveau et des vecteurs sont injectés dans la zone cible. Pour l’administration corticale, nous injectons la solution virale à deux profondeurs en plusieurs étapes. Tout d’abord, nous insérons l’aiguille d’un millimètre de profondeur dans le cortex.

Après avoir laissé cinq minutes au cerveau pour récupérer, nous déplaçons l’aiguille jusqu’à 700 micromètres de profondeur, injectons 500 nano litres de solution virale. Une fois l’injection terminée, nous attendons cinq minutes pour permettre au virus de se diffuser dans le cerveau. Et puis nous déplaçons l’aiguille jusqu’au deuxième lieu d’injection à 300 micromètres de profondeur.

Ici, nous injectons 500 nano litres supplémentaires de solution virale. Une fois l’injection terminée, nous attendons 10 minutes pour permettre au virus de se diffuser, puis nous retirons l’aiguille du cerveau et fermons le trou de bavure avec de la cire osseuse ou du Kwik-Sil. Enfin, la peau est suturée avec Du Vetbond et la souris est récupérée sur un coussin chauffant avant d’être renvoyée à l’animalerie.

La souris sera prête à être utilisée pour l’imagerie in vivo dans un minimum de trois semaines, ce qui correspond à la période de maturation de l’expression de GCaMP. Les chirurgies d’implantation de fenêtre crânienne sont également effectuées en utilisant des conditions aseptiques telles que décrites pour les chirurgies d’injection. Les procédures chirurgicales de la fenêtre crânienne sont identiques aux procédures chirurgicales d’injection jusqu’au point d’exposition du crâne.

Une fois le crâne exposé, les quartiers d’une craniotomie de 2 à 3 mm de diamètre sur la zone injectée par le virus sont marqués par quatre trous peu profonds effectués par une perceuse à grande vitesse attachée à un manipulateur. Ensuite, la section du crâne, aux gorges de la craniotomie, est éclaircie en perçant soigneusement et lentement l’os en cercle, reliant ces quatre trous. Une fois que le crâne aux bordures est assez mince, l’os est soulevé avec une pince à épiler pointue et enlevé.

La dure-mère exposée peut être retirée ou conservée intacte pour l’implantation de la fenêtre crânienne. Notre fenêtre crânienne se compose d’un couvercle en verre de 3 à 5 millimètres de diamètre, créant un disque en silicone d’environ 300 microns d’épaisseur au centre. Le montage de la fenêtre crânienne est accompli en la plaçant sur la craniotomie.

Un morceau de cure-dent attaché à un manipulateur est utilisé pour pousser doucement la fenêtre crânienne sur la surface du cerveau. Ensuite, le bord de la fenêtre crânienne est scellé avec une petite quantité d’adhésif en silicone Kwik-Sil. Enfin, la fenêtre crânienne est fixée dans les bords du crâne avec de l’acrylique dentaire.

Il faut prendre soin d’appliquer l’acrylique dentaire légèrement sur les bords de la fenêtre crânienne pour un collage fort. Comme de nombreux autres groupes de recherche l’ont mis en œuvre dans le passé, un gel d’agarose à 1,2% peut être utilisé entre le verre de couverture et le cerveau comme alternative au disque en silicone. Une fois la fenêtre crânienne solidement installée, une plaque métallique est fixée au crâne.

Cette plaque de tête sera utilisée pour fixer la tête de la souris sur la scène d’un microscope à deux photons lors de séances d’imagerie. L’absorption mitochondriale du calcium dans les astrocytes peut être provoquée par l’application d’ATD tandis que l’absorption mitochondriale de calcium dans les neurones peut être provoquée par l’application de glutamate glycine dans le liquide céphalorachidien artificiel, avec gravité à travers un système de perfusion. L’absorption de calcium dans les mitochondries individuelles dans les astrocytes et les neurones peut alors être observée.

Les films suivants montrent l’absorption mitochondriale du calcium dans un astrocyte provoqué par l’ATP à gauche et dans un neurone provoqué par le glutamate et la glycine à droite. L’imagerie est réalisée en collectant des images in vivo à deux photons accélérées de signaux fluorescents mitochondriaux dans les astrocytes et les neurones avec un système de microscopie à deux photons Ultima de Prairie Technologies, équipé d’un million de laser Ti Sapphire Ultra one de Coherent. Nous utilisons les longueurs d’onde d’excitation de 880 à 910 nanomètres, qui sont optimales pour l’imagerie in vivo avec GCaMP5G et 6s.

Astrocytes et expression spécifique aux neurones de mito-GCaMP5G et 6s et reconfirmé par co-localisation du marquage spécifique des astrocytes de SR101 ou du marqueur spécifique des neurones NeuN. L’absorption spontanée de calcium mitochondrial dans les astrocytes et les neurones in vivo peut être observée par imagerie time-lapse à l’aide de la microscopie à deux photons. Les images montrent des augmentations spontanées du calcium dans les mitochondries individuelles dans un astrocyte à gauche et un neurone à droite.

Nos approches sont utiles pour l’imagerie calcique mitochondriale spécifique au type cellulaire in vitro et in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’imager l’absorption mitochondriale du calcium dans les astrocytes et dans les neurones.