Name: Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Découvrez l'imagerie du calcium mitochondrial dans les astrocytes et les neurones utilisant les indicateurs GCaMP5G et GCaMP6s. Cette méthode permet d'étudier la dynamique calcique in vitro et in vivo.

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Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) subventions R01NS069726 et R01NS094539 à SD. Nous remercions Erica DeMers pour l’enregistrement audio.

Les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Missouri-Columbia.
1. Construction de plasmides d’ADN
REMARQUE: Pour l’imagerie in vitro et in vivo, des plasmides d’ADN codant GCaMP5G / 6s avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones et des séquences de ciblage mitochondrial sont construits.
<ol><li>Insérer la matrice mitochondriale (MM)-séquence de ciblage (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGCGGGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 dans les sites de clonage EcoRI et BamHI dans l’épine dorsale du plasmide du virus adéno-associé (AAV) pZac2.1 pour obtenir des plasmides contenant un promoteur astrocytaire gfaABC1D ou un promoteur neuronal CaMKII18,19,20.</li>
	<li>Subclone GCaMP5G/6s dans les sites de clonage BamH I et Not 1 dans les plasmides ci-dessus pour obtenir de nouveaux plasmides pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s et pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s qui ciblent l’expression transgénique dans les mitochondries dans les astrocytes et les neurones20,21 ( Figure1A).</li>
	<li>Préparer les plasmides d’ADN pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G et pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s pour la transfection en vue d’une étude in vitro (section 2). Produire des vecteurs AAV avec le sérotype 5 pour les astrocytes et le sérotype 9 pour les neurones pour l’étude in vivo 18 (Section 3).</li>
</ol>2. Imagerie mitochondriale in vitro ca2+ dans les astrocytes et les neurones
<ol><li>Préparer les astrocytes primaires du cortex de souris néonatales P1 et les neurones primaires du cortex des embryons E15-1618,22 ,23,24, et les cultiver sur des couvertures de verre de 12 mm de diamètre dans des plaques de 24 puits en utilisant le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et le milieu neuronal basal (NBM) contenant 2% de B27, respectivement.</li>
	<li>Transfecter les astrocytes et les neurones matures avec des plasmides pZac-gfaABC1D-GCaMP6s et pZac-CaMKII-GCaMP5G en utilisant un réactif de transfection à base de lipides pour exprimer GCaMP6s dans les mitochondries des astrocytes et GCaMP5G dans les mitochondries des neurones18,20,21. Transfecter les cellules dans chaque puits avec 0,5 μg d’ADN, et changer le milieu 6 h plus tard. REMARQUE: Les astrocytes et les neurones sont prêts pour l’imagerie 1-2 jours après la transfection.</li>
	<li>Effectuer une imagerie mitochondriale in vitro ca2+ 1-2 jours après la transfection.<ol>
<li>Transférer les couvercles de verre cultivés avec des astrocytes ou des neurones dans la chambre de perfusion PH-1 sous un microscope à épifluorescence ou à deux photons.</li>
		<li>Stimuler l’absorption astrocytaire mitochondriale de Ca2+ avec 100 μM d’ATP dans le LCF, ou stimuler les mitochondries neuronales avec 100 μM de glutamate/10 μM de glycine20,25 (Figure 2 et Figure 3). REMARQUE: Les changements de solution de ACSF à ACSF contenant de l’ATP et du glutamate / glycine sont contrôlés par un système de perfusion ALA-VM821. La vitesse du changement de solution est contrôlée à 1-2 mL/min en ajustant une vanne.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Imagerie mitochondriale in vivo Ca2+ dans les astrocytes et les neurones
<ol><li>Préparations AAV.<ol>
<li>Préparer les vecteurs du virus adéno-associé recombinant (rAAV) suivants à l’aide des plasmides d’ADN préparés à la rubrique 1 : vecteurs rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G et rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s. REMARQUE: Dans cette expérience, les vecteurs rAAV du sérotype 5 ont été préparés pour exprimer GCaMP5G dans les mitochondries dans les astrocytes et les vecteurs rAAV du sérotype 9 ont été préparés pour exprimer GCaMP6s dans les mitochondries dans les neurones.</li>
	</ol></li>
	<li>Injection stéréotaxique d’AAV.<ol>
<li>Anesthésiez la souris avec 3% d’isoflurane. REMARQUE: Plus tard pendant la chirurgie, les niveaux d’isoflurane sont réduits à 2%.</li>
		<li>Une fois que la souris a atteint un niveau chirurgical d’anesthésie, déterminé par le pincement de la queue et des orteils, rasez les cheveux sur le site de la chirurgie, le cortex moteur ou somatosensoriel, avec une tondeuse à cheveux.</li>
		<li>Positionnez la souris sur le dispositif stéréotaxique de la souris et fixez la tête avec des barres d’oreille. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour les protéger pendant la chirurgie. Utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris à 37 °C tout au long de la chirurgie. REMARQUE: Effectuer une intervention chirurgicale en utilisant des procédures aseptiques. Tous les outils chirurgicaux doivent être stérilisés soit par autoclavage, soit par un stérilisateur de perles chaudes.</li>
		<li>Une fois la souris montée sur le dispositif stéréotaxique, stérilisez le cuir chevelu avec un gommage à base d’iode alterné et 70% d’éthanol trois fois. Faites une incision dans la ligne médiane du cuir chevelu pour exposer le site d’injection.</li>
		<li>Coupez la peau dans l’axe bregma-lamda et créez un trou de bavure d’environ 1 mm de diamètre avec une perceuse à grande vitesse à l’emplacement d’injection prévu du moteur ou du cortex somatosensoriel.</li>
		<li>Utilisez une seringue Hamilton de 33 G contenant le virus adéno-associé (vecteurs rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x 1011 GC] ou vecteurs rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 1011 GC]) pour injecter jusqu’à 1 μL de virus dans la zone cible. REMARQUE: Par exemple, pour l’administration virale corticale, injecter la solution virale à deux profondeurs en plusieurs étapes. Tout d’abord, insérez l’aiguille à une profondeur de 1 mm de la dure-mère et laissez 5 min au cerveau pour récupérer. Ensuite, déplacez l’aiguille jusqu’à ~700 μm de profondeur et injectez 500 nL de la solution virale à une vitesse d’injection de 10 nL/s à l’aide d’une seringue hamilton contrôlée par un contrôleur de pompe à microsyringe. Une fois l’injection terminée, attendez 5 minutes pour permettre au virus de se diffuser dans le cerveau. Ensuite, déplacez l’aiguille jusqu’au deuxième emplacement d’injection à une profondeur de 300 μm. Ici, injectez 500 nL supplémentaires de la solution virale. Attendez 10 minutes pour permettre au virus de se diffuser dans le cerveau.</li>
		<li>Fermez le cuir chevelu et la peau à l’aide d’un adhésif tissulaire. Laissez les souris récupérer sur le coussin chauffant. Renvoyer les souris à l’animalerie après leur rétablissement.</li>
	</ol></li>
	<li>Intstallation de la fenêtre crânienne et imagerie in vivo à deux photons (2-P) des signaux mitochondriaux Ca2+. REMARQUE: L’implantation de la fenêtre crânienne se fait 3 semaines après l’injection d’AAV sur le cortex moteur ou somatosensoriel26,27,28,29. Le carprofène (10 mg/kg) est injecté par voie sous-cutanée pour soulager la douleur potentielle avant la chirurgie. Les procédures chirurgicales de la fenêtre crânienne sont identiques aux procédures chirurgicales d’injection AAV et sont effectuées dans des conditions aseptiques.<ol>
<li>Anesthésiez la souris avec 3% d’isoflurane. REMARQUE: Il s’agit de la dose initiale et réduisez à 2% pour la chirurgie plus tard. Au cours de l’imagerie, une injection intrapéritonéale (IP) de 130 mg de kétamine/10 mg de xylazine/kg de poids corporel dissous dans le LCF est utilisée pour l’anesthésie.</li>
		<li>Positionnez la souris sur le dispositif stéréotaxique de la souris et fixez la tête avec des barres d’oreille. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux. Utilisez un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle de la souris à 37 °C tout au long de la chirurgie. REMARQUE: Tous les outils chirurgicaux doivent être stérilisés.</li>
		<li>Faites une incision de 5 à 8 mm de long dans la ligne médiane du cuir chevelu et retirez un lambeau de peau à l’aide d’une paire de ciseaux.</li>
		<li>Une fois le crâne exposé, effectuer une craniotomie de 2,0 à 3,0 mm de diamètre à l’aide d’une perceuse à grande vitesse sur la zone injectée par le virus (c.-à-d. cortex moteur ou cortex somatosensoriel, figure 1B). Tout d’abord, faites quatre petits trous, puis percez dans un cercle reliant les trous. Ensuite, soulevez et retirez l’os avec des ciseaux tranchants et retirez-le. La dure-mère exposée peut être enlevée ou conservée intacte pour l’empantation de la fenêtre crânienne.</li>
		<li>Placez un couvercle en verre de 3 à 5 mm de diamètre portant un silicone transparent sur la craniotomie. Utilisez un cure-dent pour pousser doucement la fenêtre crânienne sur la surface du cerveau. Ensuite, scellez le bord avec une petite quantité d’adhésif en silicone. NOTES: Alternativement, au lieu d’un disque de silicone, 1,2% de gel d’agarose à faible point de fusion peut être utilisé entre le verre de couverture et le tissu cérébral.</li>
		<li>Enfin, scellez les bords du couvercle avec du ciment dentaire. Prenez soin d’appliquer légèrement le ciment au bord de la fenêtre crânienne pour un collage fort. Fixez une plaque de tête en métal sur mesure au crâne avec du ciment dentaire. REMARQUE: La plaque métallique est utilisée pour fixer la tête de la souris à l’étape du microscope 2-P pendant la séance d’imagerie (Figure 1C).</li>
		<li>Ajouter 0,5 mL de solution ACSF sur le couvercle de la fenêtre crânienne pour une immersion dans l’eau pendant l’imagerie.</li>
		<li>Effectuer une imagerie time-lapse in vivo 2-P de mito-GCaMP5G dans les astrocytes et mito-GCaMP6s dans les neurones d’une longueur d’onde de 910 nm à travers la fenêtre crânienne (Figure 1C)18,20,27. REMARQUE: Pendant l’imagerie, les souris sont sur le coussin chauffant pour maintenir la température physiologique. Les souris seront sacrifiées immédiatement après la fin de la séance d’imagerie.</li>
		<li>Marquer les astrocytes in vivo avec la sulforhodamine 101 (SR101) lorsqu’il est nécessaire de déterminer la colocalisation.<ol>
<li>À la fin de l’étape 3.3.4, appliquer 100 μL de 100 μM SR101 dans ACSF sur la surface corticale pendant 1 à 5 min.</li>
			<li>Rincez la surface avec ACSF pour laver le SR101 non lié. En utilisant l’imagerie 2-P, le co-marquage de mito-GCaMP5G et SR101 dans les astrocytes peut être observé 45-60 min plus tard(Figure 4A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cet article, nous fournissons une méthode et un protocole pour l’imagerie des signaux mitochondriaux Ca2+ dans les astrocytes et les neurones. Nous avons mis en œuvre des stratégies de ciblage des mitochondries et de type cellulaire spécifiques pour exprimer GECI GCaMP5G/6s. Pour cibler GCaMP5G/6s dans les mitochondries, nous avons inclus une séquence de ciblage des mitochondries dans les plasmides. Pour exprimer GCaMP5G/6s dans les astrocytes et les neurones in vivo,nous avons inséré un promoteu...

Les mitochondries sont des organites subcellulaires dynamiques et sont considérées comme les centrales cellulaires pour la production d’énergie. D’autre part, les mitochondries peuvent absorber le Ca2+ dans la matrice en réponse à des augmentations locales ou cytosoliques de Ca2+. L’absorption mitochondriale de Ca2+ affecte la fonction mitochondriale, y compris les processus métaboliques tels que les réactions dans le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative, et régule les protéines sensibles au Ca2+dans des conditions physiologiques1,2,3,4. La surcharge mitochondriale de Ca2+ est également un déterminant de la mort cellulaire, y compris la nécrose et l’apoptose dans divers troubles cérébraux5,6,7. Il provoque l’ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale (PTMP) et la libération de cofacteur caspase, qui déclenchent la mort cellulaire apoptotique. Par conséquent, il est important d’étudier la dynamique et la manipulation du Ca2+ mitochondrial dans les cellules vivantes pour mieux comprendre la physiologie et la pathologie cellulaires.
Les mitochondries maintiennent l’homéostasie de la matrice Ca2+ grâce à un équilibre entre l’absorption et l’efflux de Ca2+. L’absorption mitochondriale de Ca2+ est principalement médiée par les uniporteurs mitochondriaux de Ca2+ (MCU), tandis que l’efflux mitochondrial de Ca2+ est médié par les échangeurs Na+-Ca2+-Li+ (NCLX) et les échangeurs H+/ Ca2 + (mHCX)8. L’équilibre peut être perturbé par la stimulation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG)9. L’homéostasie mitochondriale Ca2+ est également affectée par la mise en mémoire tampon mitochondriale par la formation de complexes xCa2+-xPO4x-xOH insolubles8.
Les changements intracellulaires et mitochondriaux de la concentration de Ca2+ ([Ca2+]) peuvent être évalués par des indicateurs de Ca2+ fluorescents ou luminescents. La liaison du Ca2+ aux indicateurs provoque des modifications spectrales, permettant l’enregistrement de cellules libres [Ca2+]en temps réel dans des cellules vivantes. Deux types de sondes sont actuellement disponibles pour surveiller les changements de Ca2+ dans les cellules : les indicateurs chimiques organiques et les indicateurs ca2+ (GECI) codés génétiquement. Généralement, différentes variantes avec différentes affinités Ca2+ (basées sur Kd),des propriétés spectrales (longueurs d’onde d’excitation et d’émission), des plages dynamiques et des sensibilités différentes sont disponibles pour les questions biologiques étudiées. Bien que de nombreux indicateurs de Ca2+ organiques synthétiques aient été utilisés pour l’imagerie cytosolique du Ca2+, seuls quelques-uns peuvent être chargés sélectivement dans la matrice mitochondriale pour l’imagerie mitochondriale ca2+, Rhod-2 étant le plus largement utilisé (pour les revues, voir10,11). Cependant, Rhod-2 présente un inconvénient majeur de fuite lors d’expériences à long terme; en outre, il est divisé entre les mitochondries, d’autres organites et le cytosol, ce qui rend difficiles les mesures absolues dans différents sous-compartiments. En revanche, en utilisant des promoteurs spécifiques au type cellulaire et des séquences de ciblage des compartiments subcellulaires, les GECI peuvent être exprimés dans différents types de cellules et compartiments subcellulaires pour l’imagerie Ca2+ spécifique aux cellules et aux compartiments in vitro ou in vivo. Les indicateurs GCaMP Ca2+ basés sur l’intensité de fluorescence à longueur d’onde unique sont récemment apparus comme des GECI majeurs12,13, 14,15,16. Dans cet article, nous fournissons un protocole pour le ciblage des mitochondries et l’expression spécifique du type cellulaire de GCaMP5G et GCaMP6s (GCaMP5G/6s) dans les astrocytes et les neurones, et l’imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans ces types de cellules. En utilisant ce protocole, l’expression de GCaMP6G/6s dans les mitochondries individuelles peut être révélée, et l’absorption de Ca2+ en résolution mitochondriale unique peut être obtenue dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo.

<table><tbody><tr><td>Pommade pour larmes artificielles</td><td>Rugby</td><td>NDC-0536-6550-91</td><td>83 % de vaseline blanche</td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>3M Vetbond Adhesive</td></tr><tr><td>Dissection stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 2B</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Pince Dumont à pointe fine</td><td>Outils de science fine</td><td>11255-20</td><td>pour l’enlèvement de dura Lames de</td></tr><tr><td>protection en verre, 0,13-0,17 mm d’épaisseur</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>pour couvercle de fenêtre crânienne</td></tr><tr><td>Micro-foret à grande vitesse</td><td>Outils de sciences fines</td><td>18000-17</td><td>avec foret de polissage des os</td></tr><tr><td>Seringue d’injection</td><td>Hamilton</td><td>2,5 ml</td><td>pour injection virale</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-996-06</td><td>100 mg/kg poids corporel</td></tr><tr><td>Agarose à faible point de fusion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>réduction des artefacts de mouvement Cadre</td></tr><tr><td>en métal</td><td>Sur mesure</td><td>voir Fig 1</td><td>pour la fixation du cerveau à la platine du microscope</td></tr><tr><td>Contrôleur de pompe à microseringue</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Contrôleur de vitesse d’injection</td></tr><tr><td>Dispositif stéréotaxique de souris Stoelting</td><td></td><td>51725</td><td>pour tenir les souris</td></tr><tr><td>Chambre de perfusion</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0284</td><td></td></tr><tr><td>Système de perfusion</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA-VM8</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant autorégulant</td><td>Outils de science fine</td><td>21061</td><td>pour prévenir l’hypothermie des souris</td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td>colorant fluorescent rouge pour marquer les astrocytes</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux, 12 cm</td><td>Outils de science fine</td><td>14002-12</td><td>pour la dissection</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Fine Science Tools</td><td>18004-23</td><td>pour le nettoyage du matériau</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-234-11</td><td>10 mg/kg de poids corporel</td></tr></tbody></table>

imagerie de l’absorption mitochondriale de ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (geci)

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Le Ca2+ mitochondrial joue un rôle essentiel dans le contrôle de la mise en mémoire tampon cytosolique du Ca2+, du métabolisme énergétique et de la transduction du signal cellulaire. La surcharge de Ca2+ mitochondrial contribue à diverses conditions pathologiques, y compris la neurodégénérescence et la mort cellulaire apoptotique dans les maladies neurologiques. Nous présentons ici une approche moléculaire spécifique au type cellulaire et ciblant les mitochondries pour l’imagerie mitochondriale Ca2+ dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Nous avons construit des plasmides d’ADN codant pour des indicateurs Ca2+ (GECI) génétiquement codés ciblant les mitochondries GCaMP5G ou GCaMP6s (GCaMP5G/6s) avec des promoteurs spécifiques aux astrocytes et aux neurones gfaABC1D et CaMKII et une séquence de ciblage des mitochondries (mito-). Pour l’imagerie mitochondriale in vitro Ca2+, les plasmides ont été transfectés dans des astrocytes et des neurones en culture pour exprimer GCaMP5G/6s. Pour l’imagerie mitochondriale in vivo Ca2+, des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ont été préparés et injectés dans le cerveau des souris pour exprimer GCaMP5G/6s dans les mitochondries dans les astrocytes et les neurones. Notre approche fournit un moyen utile d’imager la dynamique mitochondriale du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones afin d’étudier la relation entre la signalisation cytosolique et mitochondriale du Ca2+, ainsi que les interactions astrocyte-neurone.

L’objectif de cette étude était de fournir une méthodologie pour imager les signaux mitochondriaux Ca2+ en utilisant des GECI dans les astrocytes et les neurones in vitro et in vivo. Les résultats de l’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ sont présentés ici.
Signalisation mitochondrialein vitro du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones</str...

Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones.

Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

L’étudiant diplômé Zhe Zhang, le spécialiste de la recherche Nannan Zhang, les professeurs Illker Ozden et Shinghua Ding feront la démonstration de la procédure. L’objectif global de cette procédure est de développer des astrocytes de paires spécifiques au type cellulaire et les neurones et la méthode de ciblage mitochondrial pour les comptes mitochondriaux in vitro et in vivo de l’imagerie en utilisant l’indicateur de calcium génétiquement codé, GCaMP5G et 6s. Pour l’imagerie in vitro ou in vivo, nous allons construire des plasmides d’ADN contenant des promoteurs spécifiques d’astrocytes ou de neurones gfaABC1D ou CaMKII et des indicateurs de calcium génétiquement codés, GCaMP5G/6s avec des séquences de ciblage mitochondrial.Pour l’imagerie calcique mitochondriale in vitro, nous avons transfecté des neurones astrocytes cultivés sur des feuillets de couverture en verre avec les plasmides d’ADN susmentionnés en utilisant la méthode Lipofectamine. L’imagerie peut être commencée un à deux jours après la transfection en transférant les feuillets de couverture en verre dans la chambre de profusion sous un microscope à épifluorescence ou à deux photons. Voici des exemples de signaux fluorescents provenant de mitochondries et d’un astrocyte exprimant GCaMP6s à gauche, et pour les mitochondries dans un neurone, exprimant GCaMP5G à droite.Pour l’imagerie in vivo, nous avons préparé l’adénovirus associé au sérotype 5 pour l’expression du mito-GCaMP5G dans les astrocytes et l’adénovirus associé au sérotype 9 pour l’expression du mito-GCaMP6s dans les neurones. Pour les chirurgies d’injection de virus stéréotaxiques, nous avons d’abord anesthésié la souris avec 3% d’isoflurane. Plus tard au cours de la chirurgie, les niveaux d’isoflurane sont réduits à 2% Une fois le niveau d’anesthésie approprié atteint, les cheveux sur le cuir chevelu sont rasés et la souris est positionnée sur un instrument chirurgical stéréotaxe.Une pommade ophtalmique est appliquée sur les yeux pour les protéger pendant la chirurgie. Les chirurgies d’injection sont effectuées en utilisant des procédures aseptiques, y compris des instruments stériles et des techniques aseptiques. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés soit par autoclavage, soit par un stérilisateur de perles chaudes.Une fois la souris montée sur la stéréotaxe, le cuir chevelu est nettoyé trois fois avec de la bétadine et de l’éthanol à 70%. Ensuite, la peau est ouverte le long de l’axe Bregma Lambda et la verticale est faite par une perceuse à grande vitesse sur l’emplacement cible. Dans ce travail, nous avons ciblé soit le cortex moteur, soit le paracortex.Une seringue Hamilton de calibre 33 transportant un vecteur adénovirus associé est insérée à travers le trou dans le cerveau et des vecteurs sont injectés dans la zone cible. Pour l’administration corticale, nous injectons la solution virale à deux profondeurs en plusieurs étapes. Tout d’abord, nous insérons l’aiguille d’un millimètre de profondeur dans le cortex.Après avoir laissé cinq minutes au cerveau pour récupérer, nous déplaçons l’aiguille jusqu’à 700 micromètres de profondeur, injectons 500 nano litres de solution virale. Une fois l’injection terminée, nous attendons cinq minutes pour permettre au virus de se diffuser dans le cerveau. Et puis nous déplaçons l’aiguille jusqu’au deuxième lieu d’injection à 300 micromètres de profondeur.Ici, nous injectons 500 nano litres supplémentaires de solution virale. Une fois l’injection terminée, nous attendons 10 minutes pour permettre au virus de se diffuser, puis nous retirons l’aiguille du cerveau et fermons le trou de bavure avec de la cire osseuse ou du Kwik-Sil. Enfin, la peau est suturée avec Du Vetbond et la souris est récupérée sur un coussin chauffant avant d’être renvoyée à l’animalerie.La souris sera prête à être utilisée pour l’imagerie in vivo dans un minimum de trois semaines, ce qui correspond à la période de maturation de l’expression de GCaMP. Les chirurgies d’implantation de fenêtre crânienne sont également effectuées en utilisant des conditions aseptiques telles que décrites pour les chirurgies d’injection. Les procédures chirurgicales de la fenêtre crânienne sont identiques aux procédures chirurgicales d’injection jusqu’au point d’exposition du crâne.Une fois le crâne exposé, les quartiers d’une craniotomie de 2 à 3 mm de diamètre sur la zone injectée par le virus sont marqués par quatre trous peu profonds effectués par une perceuse à grande vitesse attachée à un manipulateur. Ensuite, la section du crâne, aux gorges de la craniotomie, est éclaircie en perçant soigneusement et lentement l’os en cercle, reliant ces quatre trous. Une fois que le crâne aux bordures est assez mince, l’os est soulevé avec une pince à épiler pointue et enlevé.La dure-mère exposée peut être retirée ou conservée intacte pour l’implantation de la fenêtre crânienne. Notre fenêtre crânienne se compose d’un couvercle en verre de 3 à 5 millimètres de diamètre, créant un disque en silicone d’environ 300 microns d’épaisseur au centre. Le montage de la fenêtre crânienne est accompli en la plaçant sur la craniotomie.Un morceau de cure-dent attaché à un manipulateur est utilisé pour pousser doucement la fenêtre crânienne sur la surface du cerveau. Ensuite, le bord de la fenêtre crânienne est scellé avec une petite quantité d’adhésif en silicone Kwik-Sil. Enfin, la fenêtre crânienne est fixée dans les bords du crâne avec de l’acrylique dentaire.Il faut prendre soin d’appliquer l’acrylique dentaire légèrement sur les bords de la fenêtre crânienne pour un collage fort. Comme de nombreux autres groupes de recherche l’ont mis en œuvre dans le passé, un gel d’agarose à 1,2% peut être utilisé entre le verre de couverture et le cerveau comme alternative au disque en silicone. Une fois la fenêtre crânienne solidement installée, une plaque métallique est fixée au crâne.Cette plaque de tête sera utilisée pour fixer la tête de la souris sur la scène d’un microscope à deux photons lors de séances d’imagerie. L’absorption mitochondriale du calcium dans les astrocytes peut être provoquée par l’application d’ATD tandis que l’absorption mitochondriale de calcium dans les neurones peut être provoquée par l’application de glutamate glycine dans le liquide céphalorachidien artificiel, avec gravité à travers un système de perfusion. L’absorption de calcium dans les mitochondries individuelles dans les astrocytes et les neurones peut alors être observée.Les films suivants montrent l’absorption mitochondriale du calcium dans un astrocyte provoqué par l’ATP à gauche et dans un neurone provoqué par le glutamate et la glycine à droite. L’imagerie est réalisée en collectant des images in vivo à deux photons accélérées de signaux fluorescents mitochondriaux dans les astrocytes et les neurones avec un système de microscopie à deux photons Ultima de Prairie Technologies, équipé d’un million de laser Ti Sapphire Ultra one de Coherent. Nous utilisons les longueurs d’onde d’excitation de 880 à 910 nanomètres, qui sont optimales pour l’imagerie in vivo avec GCaMP5G et 6s.Astrocytes et expression spécifique aux neurones de mito-GCaMP5G et 6s et reconfirmé par co-localisation du marquage spécifique des astrocytes de SR101 ou du marqueur spécifique des neurones NeuN. L’absorption spontanée de calcium mitochondrial dans les astrocytes et les neurones in vivo peut être observée par imagerie time-lapse à l’aide de la microscopie à deux photons. Les images montrent des augmentations spontanées du calcium dans les mitochondries individuelles dans un astrocyte à gauche et un neurone à droite.Nos approches sont utiles pour l’imagerie calcique mitochondriale spécifique au type cellulaire in vitro et in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’imager l’absorption mitochondriale du calcium dans les astrocytes et dans les neurones.

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Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI) (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca²⁺ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca²⁺ codés génétiquement (GECI)

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