Name: Stratégies d’inoculation pour infecter les racines des plantes avec des micro-organismes transmis par le sol (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Découvrez trois stratégies d'inoculation racinaire pour étudier les interactions plantes-microbes telluriques avec Verticillium et Arabidopsis. Ces méthodes permettent des analyses moléculaires, cytologiques et histologiques.

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Les auteurs remercient Tim Iven et Jaqueline Komorek pour leurs travaux antérieurs sur ces méthodes, le groupe de Wolfgang Dröge-Laser (Département de biologie pharmaceutique, Université de Würzburg, Allemagne) pour avoir fourni l’équipement et les ressources nécessaires à ce travail, et Wolfgang Dröge-Laser ainsi que Philipp Kreisz (tous deux de l’Université de Würzburg) pour la relecture critique du manuscrit. Cette étude a été soutenue par la « Deutsche Forschungsgemeinschaft » (DFG, DR273/15-1,2).

<ol><li>Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhizosphere+microbiome%3A+significance+of+plant+beneficial%2C+plant+pathogenic%2C+and+human+pathogenic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Review%22%5BJournal%5D)">The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms.</a> FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).</li>
<li>Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xylem+as+battleground+for+plant+hosts+and+vascular+wilt+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 97(2013).</li>
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<li>Leonard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verticillium+longisporum+elicits+media-dependent+secretome+responses+with+capacity+to+distinguish+between+plant-related+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 1876(2020).</li>
<li>Depotter, J. R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verticillium+longisporum%2C+the+invisible+threat+to+oilseed+rape+and+other+brassicaceous+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).</li>
<li>Fröschel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-function+screen+reveals+redundant+ERF+transcription+factors+providing+opportunities+for+resistance+breeding+toward+the+vascular+fungal+pathogen+Verticillium+longisporum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).</li>
<li>Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verticillium+longisporum+and+V.+dahliae%3A+infection+and+disease+in+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus.</a> Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).</li>
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<li>Reusche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+cytokinin+levels+enhances+Arabidopsis+resistance+against+Verticillium+longisporum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).</li>
<li>Iven, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+and+production+of+tryptophan-derived+secondary+metabolites+in+Arabidopsis+roots+contributes+to+the+defense+against+the+fungal+vascular+pathogen+Verticillium+longisporum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum.</a> Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).</li>
<li>Reusche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+with+the+vascular+pathogens+Verticillium+longisporum+and+Verticillium+dahliae+induce+distinct+disease+symptoms+and+differentially+affect+drought+stress+tolerance+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana.</a> Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).</li>
<li>Fröschel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+evaluation+of+root+infection+systems+using+the+vascular+fungus+Verticillium+longisporum+as+soil-borne+model+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen.</a> Plant Methods. 17 (1), 57(2021).</li>
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<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Fradin, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Verticillium+wilt+resistance+mediated+by+tomato+Ve1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1.</a> Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).</li>
<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+host+Brassica+napus+induces+in+the+pathogen+Verticillium+longisporum+the+expression+of+functional+catalase+peroxidase+which+is+required+for+the+late+phase+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).</li>
<li>Zeise, K., von Tiedemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+RAPD-PCR+for+virulence+type+analysis+within+Verticillium+dahliae+and+Verticillium+longisporum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum.</a> Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).</li>
<li>Fröschel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+roots+employ+cell-layer-specific+programs+to+respond+to+pathogenic+and+beneficial+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes.</a> Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).</li>
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<li>Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+complexes+involving+plant+parasitic+nematodes+and+soilborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens.</a> Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).</li>
<li>Behrens, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+abscisic+acid+biosynthesis+at+the+early+infection+stage+of+Verticillium+longisporum+in+oilseed+rape+%28Brassica+napus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus).</a> Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).</li>
<li>Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+causality%3A+opportunities+of+synthetic+communities+for+plant+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research.</a> Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En raison des énormes pertes de rendement causées par les phytopathogènes transmis par le sol1, une amélioration des stratégies agricoles ou des variétés de cultures est nécessaire. La compréhension limitée de la pathogenèse des maladies transmises par le sol entrave le développement de plantes plus résistantes. Les mécanismes pathologiques sous-jacents doivent être explorés, pour lesquels une plate-forme méthodologique robuste est nécessaire. Les procédures d’inoculation rapportées ont montré que...

Les sols naturels sont habités par un nombre étonnant de microbes qui peuvent être neutres, nocifs ou bénéfiques pour les plantes1. De nombreux agents pathogènes des plantes sont transmis par le sol, entourent les racines et attaquent l’organe souterrain. Ces micro-organismes appartiennent à une grande variété de clades : champignons, oomycètes, bactéries, nématodes, insectes et certains virus 1,2. Une fois que les conditions environnementales favorisent l’infection, les plantes sensibles deviennent malades et les rendements des cultures diminuent. Les effets du changement climatique, tels que le réchauffement de la planète et les conditions météorologiques extrêmes, augmenteront la proportion d’agents pathogènes des plantes transmis par le sol3. Par conséquent, il deviendra de plus en plus important d’étudier ces microbes destructeurs et leur impact sur la production de denrées alimentaires et d’aliments pour animaux, mais aussi sur les écosystèmes naturels. De plus, il y a des mutualistes microbiens dans le sol qui interagissent étroitement avec les racines et favorisent la croissance, le développement et l’immunité des plantes. Lorsqu’elles sont confrontées à des agents pathogènes, les plantes peuvent recruter activement des adversaires spécifiques dans la rhizosphère qui peuvent soutenir la survie de l’hôte en supprimant les agents pathogènes 4,5,6,7. Cependant, les détails mécanistes et les voies impliquées dans les interactions bénéfiques racine-microbe sont souvent encore inconnus6.
Il est donc essentiel d’élargir la compréhension générale des interactions racine-microbe. Des méthodes fiables d’inoculation des racines avec des micro-organismes transmis par le sol sont nécessaires pour effectuer des études de modèles et transférer les résultats à des applications agricoles. Les interactions bénéfiques dans le sol sont étudiées, par exemple, avec Serendipita indica (anciennement connu sous le nom de Piriformospora indica), Rhizobium spp. fixateur d’azote ou champignons mycorhiziens, tandis que les agents pathogènes des plantes connus dans le sol comprennent Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. et Verticillium spp.1. Ces deux derniers sont des genres fongiques qui sont répartis dans le monde entier et causent des maladies vasculaires2. Verticillium spp. (Ascomycota) peut infecter des centaines d’espèces végétales - principalement des dicotylédones, y compris des annuelles herbacées, des plantes vivaces ligneuses et de nombreuses plantes cultivées 2,8. Les hyphes de Verticillium pénètrent dans la racine et se développent à la fois intercellulairement et intracellulairement vers le cylindre central pour coloniser les vaisseaux du xylème 2,9. Dans ces vaisseaux, le champignon reste pendant la majeure partie de son cycle de vie. Comme la sève du xylème est pauvre en nutriments et transporte des composés de défense des plantes, le champignon doit s’adapter à cet environnement unique. Ceci est accompli par la sécrétion de protéines liées à la colonisation qui permettent à l’agent pathogène de survivre dans son hôte10,11. Après avoir atteint le système vasculaire racinaire, le champignon peut se propager dans les vaisseaux du xylème par voie acropétale jusqu’au feuillage, ce qui conduit à une colonisation systémique de l’hôte 9,12. À ce stade, la plante est affectée négativement dans la croissance 9,10,13. Par exemple, un retard de croissance et des feuilles jaunes se produisent ainsi qu’une sénescence prématurée 13,14,15,16.
Un membre de ce genre est Verticillium longisporum, qui est très adapté aux hôtes brassicacés, tels que le colza agronomiquement important, le chou-fleur et la plante modèle Arabidopsis thaliana12. Plusieurs études ont combiné V. longisporum et A. thaliana pour obtenir des connaissances approfondies sur les maladies vasculaires transmises par le sol et les réponses de défense racinaire qui en résultent 13,15,16,17. Des tests de susceptibilité simples peuvent être réalisés en utilisant le système modèle V. longisporum / A. thaliana et des ressources génétiques bien établies sont disponibles pour les deux organismes. Étroitement lié à V. longisporum est l’agent pathogène Verticillium dahliae. Bien que les deux espèces fongiques effectuent un style de vie vasculaire et un processus d’invasion similaires, leur efficacité de propagation des racines aux feuilles et les symptômes de la maladie provoquée chez A. thaliana sont différents: alors que V. longisporum induit généralement une sénescence précoce, l’infection à V. dahliae entraîne un flétrissement18. Récemment, un résumé méthodologique a présenté différentes stratégies d’inoculation racinaire pour infecter A. thaliana avec V. longisporum ou V. dahliae, aidant à planifier des configurations expérimentales19. Sur le terrain, V. longisporum cause parfois des dommages importants dans la production de colza12, tandis que V. dahliae a une très large gamme d’hôtes comprenant plusieurs espèces cultivées, telles que la vigne, la pomme de terre et la tomate8. Cela rend les deux agents pathogènes économiquement intéressants à étudier.
Ainsi, les protocoles suivants utilisent à la fois V. longisporum et V. dahliae comme agents pathogènes racines modèles pour illustrer les approches possibles pour les inoculations racinaires. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), colza (Brassica napus) et tomate (Solanum lycopersicum) ont été choisis comme hôtes modèles. Des descriptions détaillées des méthodologies peuvent être trouvées dans le texte ci-dessous et la vidéo qui l’accompagne. Les avantages et les inconvénients de chaque système d’inoculation sont discutés. Dans l’ensemble, cette collection de protocoles peut aider à identifier une méthode appropriée pour des questions de recherche spécifiques dans le contexte des interactions racine-microbe.

<table><tbody><tr><td>Agar (Gelrite)</td><td>Carl Roth</td><td>Nr. 0039</td><td>tous les systèmes décrits nécessitent Gelrite</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana</td><td>stock NASC</td> de type sauvage <td>Col-0 (N1092)</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Systec</td><td>VE-100</td><td></td></tr><tr><td>BlattFlaeche</td><td>Datinf GmbH</td><td>BlattFlaeche</td><td>software pour déterminer les surfaces foliaires</td></tr><tr><td> Brassica napus de type sauvage</td><td>voir Floerl et al., 2008</td> génome <td>de colza à cycle rapide</td><td>ACaacc</td></tr><tr><td>Cefotaxime sodium</td><td>Duchefa</td><td>C0111</td><td></td></tr><tr><td>Fiole chicane 500 mL</td><td>Duran Group / neoLab</td><td>E-1090</td><td>Fiole Erlenmeyer à quatre chicanes</td></tr><tr><td>Tubes de collecte 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>114 x 28 mm</td></tr><tr><td>Czapek Bouillon de dextrose moyen</td><td>Duchefa</td><td>C1714</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>Nikon</td><td>D3100 18-55 VR</td><td></td></tr><tr><td>Exsiccator (Dessiccateur )</td><td>Duran Group</td><td>200 DN, 5.8 L</td><td>Joint avec couvercle pour maintenir le chlore gazeux</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Leica</td><td>Leica Leica TCS SP5 II</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth</td><td>P074.3</td><td></td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Carl Roth</td><td>P021.1</td><td>&ge ; 99 %</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Carl Roth</td><td>6751</td><td></td></tr><tr><td>Leukopor</td><td>BSN medical GmbH</td><td>2454-00 AP</td><td>ruban non tissé 2,5 cm x 9,2 m</td></tr><tr><td>MES (2-(N-morpholino)acide éthanesulfonique)</td><td>Carl Roth</td><td>4256.2</td><td>Pufferan &ge ; 99 %</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Carl Roth</td><td>T888.1</td><td>Sulfate de magnésium-Heptahydrate</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog medium (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0222</td><td>MS avec vitamines</td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Carl Roth</td><td>9062.1</td><td></td></tr><tr><td>Chambres de croissance percivales</td><td>CLF Plant Climatics GmbH</td><td>AR-66L2</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td>taille & Oslash ; xH : 92 & fois ; Gobelets en plastique 16 mm</td></tr><tr><td>(500 mL, transparent)</td><td>Pro-pac, boîte à saladex</td><td>5070</td><td>taille : 108 & fois ; 81 & fois ; 102 mm</td></tr><tr><td>Filtre plissé en cellulose</td><td>Hartenstein</td><td>FF12</td><td>niveau de rétention des particules 8&ndash ; 12 &mu ; m</td></tr><tr><td>poly klima chambre de croissance</td><td>poly klima GmbH</td><td>PK 520 WLED</td><td></td></tr><tr><td>Pomme de terre Dextrose Bouillon moyen</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>P6685</td><td>pour microbiologie</td></tr><tr><td>Pots</td><td>P&ouml ; ppelmann GmbH</td><td>TO 7 D ou TO 9,5 D</td><td>&Oslash ; 7 cm resp. &Oslash ; 9,5 cm</td></tr><tr><td>PromMYB51 ::YFPvoir</td> <td>Poncini et al., 2017</td><td>MYB51 ligne de rapporteur</td><td>YFP (c’est-à-dire 3xmVenus avec NLS)</td></tr><tr><td>Tubes de réaction 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.400</td><td>PCR Performance testée</td></tr><tr><td>Agitateur rotatif (orbital)</td><td>Edmund B&uuml ; hler</td><td>SM 30 C control</td><td></td></tr><tr><td>Sable (sable pour oiseaux)</td><td>Pet Bistro, M&uuml ; ller Holding</td><td>786157</td><td></td></tr><tr><td>Sol</td><td>Einheitserde spezial</td><td>SP Pikier (SP ED 63 P)</td><td></td></tr><tr><td>Solanum lycopersicum de type sauvage</td><td>voir Chavarro-Carrero et al., 2021</td><td>Type : Moneymaker</td><td></td></tr><tr><td>Thoma chambre de comptage cellulaire</td><td>Marienfeld</td><td>642710</td><td>profondeur 0,020 mm ; 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>Eau ultrapure (Milli-Q eau purifiée)</td><td>MERK</td><td>IQ 7003/7005</td><td>eau obtenue après purification</td></tr><tr><td>Verticillium dahliae</td><td>voir Reusche et al., 2014</td><td>isolat JR2</td><td></td></tr><tr><td>Verticillium longisporum</td><td>Zeise et von Tiedemann, 2002</td><td>souche Vl43</td><td></td></tr></tbody></table>

stratégies d’inoculation pour infecter les racines des plantes avec des micro-organismes transmis par le sol

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

La rhizosphère abrite une communauté microbienne très complexe dans laquelle les racines des plantes sont constamment remises en question. Les racines sont en contact étroit avec une grande variété de micro-organismes, mais les études sur les interactions dans le sol sont encore en retard sur celles effectuées sur les organes en surface. Bien que certaines stratégies d’inoculation pour infecter les plantes modèles avec des agents pathogènes racinaires modèles soient décrites dans la littérature, il reste difficile d’obtenir un aperçu méthodologique complet. Pour résoudre ce problème, trois systèmes d’inoculation racinaire différents sont décrits avec précision qui peuvent être appliqués pour mieux comprendre la biologie des interactions racine-microbe. À titre d’illustration, les espèces de Verticillium (à savoir , V. longisporum et V. dahliae) ont été utilisées comme agents pathogènes modèles envahissant les racines. Cependant, les méthodes peuvent être facilement adaptées à d’autres microbes colonisateurs de racines - à la fois pathogènes et bénéfiques. En colonisant le xylème végétal, les champignons vasculaires transmis par le sol tels que Verticillium spp. présentent un mode de vie unique. Après l’invasion racinaire, ils se propagent par les vaisseaux du xylème par voie acropétale, atteignent la pousse et provoquent des symptômes de la maladie. Trois espèces végétales représentatives ont été choisies comme hôtes modèles : Arabidopsis thaliana, colza économiquement important (Brassica napus) et tomate (Solanum lycopersicum). Des protocoles étape par étape sont donnés. Des résultats représentatifs des tests de pathogénicité, des analyses transcriptionnelles des gènes marqueurs et des confirmations indépendantes par des constructions de rapporteurs sont présentés. En outre, les avantages et les inconvénients de chaque système d’inoculation sont discutés en profondeur. Ces protocoles éprouvés peuvent aider à fournir des approches pour les questions de recherche sur les interactions racine-microbe. Savoir comment les plantes font face aux microbes dans le sol est crucial pour développer de nouvelles stratégies visant à améliorer l’agriculture.

Conformément au protocole, les plantes ont été cultivées et inoculées avec V. longisporum (souche Vl4325) ou V. dahliae (isolat JR218). Divers scénarios ont été conçus pour prouver l’efficacité et mettre en évidence certaines capacités des protocoles donnés. Des résultats représentatifs sont présentés.
L’induction expressionnelle des gènes impliqués dans la biosynthèse antimicrobienne indol-glucosinolate (IG) est un ind...

Ce protocole présente un résumé détaillé des stratégies pour inoculer les racines des plantes avec des microbes transmis par le sol. Exemple pour les champignons Verticillium longisporum et Verticillium dahliae, trois systèmes d’infection racinaire différents sont décrits. Les applications potentielles et les analyses en aval possibles sont mises en évidence, et les avantages ou les inconvénients sont discutés pour chaque système.

Stratégies d’inoculation pour infecter les racines des plantes avec des micro-organismes transmis par le sol

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide ...

Bien que d’innombrables microbes colonisent les racines des plantes, ces interactions sont difficiles à analyser car elles se produisent sous terre. Pour faciliter cela, cette collection de protocoles donne un aperçu des stratégies pour inoculer les racines des plantes avec des microbes transmis par le sol. L’inoculation racinaire est la base de l’étude des interactions des microbes racinaires, et en utilisant les techniques suivantes, les interactions peuvent être étudiées au niveau moléculaire, cytologique ou histologique.Nous expliquons trois systèmes d’inoculation utilisant le verticillium comme microbe envahissant les racines, et la plante modèle, arabidopsis. Cependant, le transfert des méthodes à d’autres plantes telles que la tomate ou le colza, et à d’autres microbes racinaires, par exemple la serendipita bénéfique, est possible. Préparer l’inoculum de verticillium à l’avance en cultivant le mycélium dans du PDB et en induisant la sporulation et le bouillon de dextrose Czapek.Commencez ensuite par verser le milieu autoclavé dans des boîtes de Pétri. Après durcissement du milieu, remballez les boîtes de Petri dans un sac en plastique stérile et conservez-les à l’envers pendant la nuit au réfrigérateur à quatre à 10 degrés Celsius. Coupez et retirez un canal d’infection dans le tiers supérieur du milieu solidifié avec un scalpel.Évitez d’obtenir du liquide ou de l’air sous le milieu de la gélose pendant la coupe. Ensuite, utilisez une pointe de pipette stérile pour distribuer 50 à 100 graines d’arabidopsis stérilisées en surface sur la surface supérieure coupée. Placez les graines dans l’angle où la surface de la gélose coupée entre en contact avec la paroi de la boîte de Pétri afin que les racines puissent pousser entre elles.Fermez les boîtes de Petri et scellez-les avec un ruban adhésif respirant pour permettre l’échange de gaz. Gardez les boîtes de Petri dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant deux jours pour la stratification afin d’assurer une germination synchronisée et efficace. Ensuite, placez les plaques verticalement dans une grille et faites pousser les plantes dans une chambre de croissance dans des conditions de longue journée.Après neuf à 11 jours, lorsque les racines atteignent le canal d’infection, posez les plaques horizontalement et ouvrez-les. Ajoutez ensuite 500 microlitres de verticillium conidia fraîchement récoltés directement dans le canal d’infection. Préparez les plaques de contrôle en ajoutant 500 microlitres d’une solution fictive au lieu de spores.Incuber horizontalement les plaques de contrôle et les plaques inoculées de spores jusqu’à ce que le liquide ait trempé. Fermez ensuite le couvercle et scellez les plaques avec du ruban adhésif respirant. Couvrez les parties racinaires avec des boîtes en papier noir pour assombrir les racines et les champignons du sol.Incuber les plaques verticalement dans la chambre de croissance. Effectuer les analyses aux points temporels préférés après l’inoculation. Tout d’abord, stérilisez les gobelets en plastique transparents de 500 millilitres dans un bain d’éthanol de 70 à 75% pendant 20 minutes.Séchez les tasses dans la hotte à flux de lame. Versez le milieu autoclavé dans les gobelets en plastique. Préparez une couche de plastique avec cinq trous préfabriqués, un grand au centre et quatre plus petits dans chaque coin.Placez la couche de plastique sur le milieu avant qu’il ne se solidifie. Coupez la gélose avec un scalpel à travers le trou central préfabriqué à une profondeur d’environ 1,5 centimètre. Retirez la gélose coupée pour créer un canal d’infection afin d’ajouter les spores fongiques plus tard.Grattez légèrement le milieu de la gélose avec une pointe de pipette dans les quatre trous plus petits pour interrompre la peau solidifiée. Placez les graines à l’aide d’une pointe de pipette dans les trous plus petits. Fermez le gobelet en plastique avec un deuxième gobelet en plastique inversé et scellez-le avec du ruban adhésif respirant.Gardez les plantes à quatre degrés Celsius pendant trois jours dans l’obscurité pour la stratification. Ensuite, incubez les systèmes de gobelets dans la chambre de croissance. Pour inoculer les plantules avec du verticillium, ajoutez un millilitre de solution de conidies dans le canal infectieux.Pour les témoins, ajoutez un millilitre de milieu MS sans germes comme solution simulée. Effectuer les analyses aux points temporels préférés après l’inoculation. Tout d’abord, mélangez soigneusement le sol et le sable dans un rapport volumétrique de trois à un, ce qui facilite le lavage du substrat des racines plus tard.Versez le mélange dans un sac d’autoclave et vaporisez à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes dans un autoclave. Remplissez les pots avec le mélange terre-sable et transférez-les dans des plateaux. Ajouter de l’eau dans les plateaux à environ un tiers de la hauteur d’un pot pour un trempage uniforme du mélange sol-sable.Vaporisez le mélange à l’eau pour assurer des conditions de départ humides. Semez trois à quatre graines dans chaque pot à une distance suffisante les unes des autres. Conservez-les pour la stratification à quatre degrés Celsius pendant trois jours dans l’obscurité.Laissez les semis pousser dans des conditions de longue journée avec un arrosage régulier, puis cueillez des plantes de taille et d’âge similaires pour effectuer l’inoculation par immersion racinaire. Retirez la terre des pots et excusez les racines. Lavez doucement les racines dans un récipient d’eau et gardez les rosettes hors de l’eau.Incuber les racines pendant 60 minutes dans une boîte de Petri contenant la solution de spore de verticillium ou la solution simulée. Préparez de nouveaux pots avec un sol stérilisé à la vapeur humide sans sable. Utilisez une pointe de pipette pour faire un trou au centre du sol dans chaque pot.Placez les racines directement dans le trou et remplissez les trous doucement avec de la terre pour éviter un stress supplémentaire pour les plantes. Cultivez les plantes dans des conditions de longue journée avec un arrosage régulier. Effectuer les analyses aux points temporels préférés après l’inoculation.Dans le système à base de boîte de Petri, une infection réussie du verticillium a été visualisée dans les racines de l’arabidopsis. Deux jours après l’inoculation, le gène marqueur MYB51 a été fortement induit dans les racines infectées par rapport au témoin, ce qui a été confirmé par l’analyse QRTPCR. Dans le système à base de coupes, une grande quantité d’ADN fongique a été trouvée dans les feuilles des plantes infectées, comme le montre le graphique, par rapport au contrôle simulé après 12 jours d’inoculation.L’analyse QRTPCR a montré une abondance enrichie de transcriptions du gène marqueur MYB51 dans les racines d’arabidopsis. En utilisant ce système, le verticillium a été inoculé à d’autres espèces de plantes modèles. Dans le colza, l’ADN fongique était détectable dans les segments de tige coupés à la base des semis 12 jours après l’inoculation aux racines.De l’ADN fongique a également été détecté dans les tiges de tomates indiquant la propagation de l’agent pathogène dans la plante. 21 jours après l’inoculation à l’aide du système à base de sol, les rosettes des plantes d’arabidopsis traitées simulées semblaient saines et vertes, tandis que les plantes infectées présentaient des feuilles jaunâtres ou nécrotiques et avaient une surface foliaire verte inférieure à celle de la simulation indiquant une infection réussie. Faites attention lorsque vous coupez le canal d’infection dans le système de boîte de Petri pour empêcher la gélose de glisser.En appliquant le système basé sur le sol, ne comprimez pas le sol autour des racines pendant le rempotage pour éviter un stress supplémentaire pour les plantes. Après l’inoculation des racines, par exemple, des tests pathogènes, des analyses de l’expression des gènes, des tests de génomique fonctionnelle ou agrochimiques peuvent être effectués, fournissant de nouvelles informations sur les interactions des microbes racinaires et des outils pour améliorer l’agriculture.

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