Stratégies d’inoculation pour infecter les racines des plantes avec des micro-organismes transmis par le sol

Ce protocole présente un résumé détaillé des stratégies pour inoculer les racines des plantes avec des microbes transmis par le sol. Exemple pour les champignons Verticillium longisporum et Verticillium dahliae, trois systèmes d’infection racinaire différents sont décrits. Les applications potentielles et les analyses en aval possibles sont mises en évidence, et les avantages ou les inconvénients sont discutés pour chaque système.

Bien que d’innombrables microbes colonisent les racines des plantes, ces interactions sont difficiles à analyser car elles se produisent sous terre. Pour faciliter cela, cette collection de protocoles donne un aperçu des stratégies pour inoculer les racines des plantes avec des microbes transmis par le sol. L’inoculation racinaire est la base de l’étude des interactions des microbes racinaires, et en utilisant les techniques suivantes, les interactions peuvent être étudiées au niveau moléculaire, cytologique ou histologique.

Nous expliquons trois systèmes d’inoculation utilisant le verticillium comme microbe envahissant les racines, et la plante modèle, arabidopsis. Cependant, le transfert des méthodes à d’autres plantes telles que la tomate ou le colza, et à d’autres microbes racinaires, par exemple la serendipita bénéfique, est possible. Préparer l’inoculum de verticillium à l’avance en cultivant le mycélium dans du PDB et en induisant la sporulation et le bouillon de dextrose Czapek.

Commencez ensuite par verser le milieu autoclavé dans des boîtes de Pétri. Après durcissement du milieu, remballez les boîtes de Petri dans un sac en plastique stérile et conservez-les à l’envers pendant la nuit au réfrigérateur à quatre à 10 degrés Celsius. Coupez et retirez un canal d’infection dans le tiers supérieur du milieu solidifié avec un scalpel.

Évitez d’obtenir du liquide ou de l’air sous le milieu de la gélose pendant la coupe. Ensuite, utilisez une pointe de pipette stérile pour distribuer 50 à 100 graines d’arabidopsis stérilisées en surface sur la surface supérieure coupée. Placez les graines dans l’angle où la surface de la gélose coupée entre en contact avec la paroi de la boîte de Pétri afin que les racines puissent pousser entre elles.

Fermez les boîtes de Petri et scellez-les avec un ruban adhésif respirant pour permettre l’échange de gaz. Gardez les boîtes de Petri dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant deux jours pour la stratification afin d’assurer une germination synchronisée et efficace. Ensuite, placez les plaques verticalement dans une grille et faites pousser les plantes dans une chambre de croissance dans des conditions de longue journée.

Après neuf à 11 jours, lorsque les racines atteignent le canal d’infection, posez les plaques horizontalement et ouvrez-les. Ajoutez ensuite 500 microlitres de verticillium conidia fraîchement récoltés directement dans le canal d’infection. Préparez les plaques de contrôle en ajoutant 500 microlitres d’une solution fictive au lieu de spores.

Incuber horizontalement les plaques de contrôle et les plaques inoculées de spores jusqu’à ce que le liquide ait trempé. Fermez ensuite le couvercle et scellez les plaques avec du ruban adhésif respirant. Couvrez les parties racinaires avec des boîtes en papier noir pour assombrir les racines et les champignons du sol.

Incuber les plaques verticalement dans la chambre de croissance. Effectuer les analyses aux points temporels préférés après l’inoculation. Tout d’abord, stérilisez les gobelets en plastique transparents de 500 millilitres dans un bain d’éthanol de 70 à 75% pendant 20 minutes.

Séchez les tasses dans la hotte à flux de lame. Versez le milieu autoclavé dans les gobelets en plastique. Préparez une couche de plastique avec cinq trous préfabriqués, un grand au centre et quatre plus petits dans chaque coin.

Placez la couche de plastique sur le milieu avant qu’il ne se solidifie. Coupez la gélose avec un scalpel à travers le trou central préfabriqué à une profondeur d’environ 1,5 centimètre. Retirez la gélose coupée pour créer un canal d’infection afin d’ajouter les spores fongiques plus tard.

Grattez légèrement le milieu de la gélose avec une pointe de pipette dans les quatre trous plus petits pour interrompre la peau solidifiée. Placez les graines à l’aide d’une pointe de pipette dans les trous plus petits. Fermez le gobelet en plastique avec un deuxième gobelet en plastique inversé et scellez-le avec du ruban adhésif respirant.

Gardez les plantes à quatre degrés Celsius pendant trois jours dans l’obscurité pour la stratification. Ensuite, incubez les systèmes de gobelets dans la chambre de croissance. Pour inoculer les plantules avec du verticillium, ajoutez un millilitre de solution de conidies dans le canal infectieux.

Pour les témoins, ajoutez un millilitre de milieu MS sans germes comme solution simulée. Effectuer les analyses aux points temporels préférés après l’inoculation. Tout d’abord, mélangez soigneusement le sol et le sable dans un rapport volumétrique de trois à un, ce qui facilite le lavage du substrat des racines plus tard.

Versez le mélange dans un sac d’autoclave et vaporisez à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes dans un autoclave. Remplissez les pots avec le mélange terre-sable et transférez-les dans des plateaux. Ajouter de l’eau dans les plateaux à environ un tiers de la hauteur d’un pot pour un trempage uniforme du mélange sol-sable.

Vaporisez le mélange à l’eau pour assurer des conditions de départ humides. Semez trois à quatre graines dans chaque pot à une distance suffisante les unes des autres. Conservez-les pour la stratification à quatre degrés Celsius pendant trois jours dans l’obscurité.

Laissez les semis pousser dans des conditions de longue journée avec un arrosage régulier, puis cueillez des plantes de taille et d’âge similaires pour effectuer l’inoculation par immersion racinaire. Retirez la terre des pots et excusez les racines. Lavez doucement les racines dans un récipient d’eau et gardez les rosettes hors de l’eau.

Incuber les racines pendant 60 minutes dans une boîte de Petri contenant la solution de spore de verticillium ou la solution simulée. Préparez de nouveaux pots avec un sol stérilisé à la vapeur humide sans sable. Utilisez une pointe de pipette pour faire un trou au centre du sol dans chaque pot.

Placez les racines directement dans le trou et remplissez les trous doucement avec de la terre pour éviter un stress supplémentaire pour les plantes. Cultivez les plantes dans des conditions de longue journée avec un arrosage régulier. Effectuer les analyses aux points temporels préférés après l’inoculation.

Dans le système à base de boîte de Petri, une infection réussie du verticillium a été visualisée dans les racines de l’arabidopsis. Deux jours après l’inoculation, le gène marqueur MYB51 a été fortement induit dans les racines infectées par rapport au témoin, ce qui a été confirmé par l’analyse QRTPCR. Dans le système à base de coupes, une grande quantité d’ADN fongique a été trouvée dans les feuilles des plantes infectées, comme le montre le graphique, par rapport au contrôle simulé après 12 jours d’inoculation.

L’analyse QRTPCR a montré une abondance enrichie de transcriptions du gène marqueur MYB51 dans les racines d’arabidopsis. En utilisant ce système, le verticillium a été inoculé à d’autres espèces de plantes modèles. Dans le colza, l’ADN fongique était détectable dans les segments de tige coupés à la base des semis 12 jours après l’inoculation aux racines.

De l’ADN fongique a également été détecté dans les tiges de tomates indiquant la propagation de l’agent pathogène dans la plante. 21 jours après l’inoculation à l’aide du système à base de sol, les rosettes des plantes d’arabidopsis traitées simulées semblaient saines et vertes, tandis que les plantes infectées présentaient des feuilles jaunâtres ou nécrotiques et avaient une surface foliaire verte inférieure à celle de la simulation indiquant une infection réussie. Faites attention lorsque vous coupez le canal d’infection dans le système de boîte de Petri pour empêcher la gélose de glisser.

En appliquant le système basé sur le sol, ne comprimez pas le sol autour des racines pendant le rempotage pour éviter un stress supplémentaire pour les plantes. Après l’inoculation des racines, par exemple, des tests pathogènes, des analyses de l’expression des gènes, des tests de génomique fonctionnelle ou agrochimiques peuvent être effectués, fournissant de nouvelles informations sur les interactions des microbes racinaires et des outils pour améliorer l’agriculture.