Une seule usine, microcosmes stériles pour la nodulation et la croissance de la plante des légumineuses Medicago truncatula Avec le Rhizobiennes Symbiont Sinorhizobium meliloti

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les phénotypes symbiotiques des plantes de Tula cargo médicinales inoculées avec différentes variantes mutantes de la bactérie fixatrice d’azote sino oum me latte, en utilisant des microcosmes stériles de plantes uniques fabriqués à partir de plaques de laboratoire standard. Ceci est accompli en scarifiant d’abord Mula, un 17 graines avec de l’acide et en faisant germer les graines sur des plaques de gélose. La deuxième étape consiste à préparer des microcosmes stériles à plante unique à l’aide d’une spatule chaude courbée, en encochant chaque plaque solidifiée et son couvercle fermant la plaque.

Plus tard, nous laisserons un trou ovale sur le côté. Ensuite, disposez des semis individuels de Mula sur les microcosmes avec l’extrémité de la racine, en contactant la gélose et le coleadin et 0,5 centimètre de la goulotte dépassant de l’encoche en U dans la plaque. La dernière étape est l’inoculation avec du latte SME et l’incubation des plaques sous forme de piles enveloppées de papier d’aluminium dans une chambre de croissance éclairée.

En fin de compte, la quantification de la longueur et du poids des pousses végétales et du type de nodule est utilisée pour montrer le succès symbiotique relatif de chaque souche élevée S milliot ou mutant ULA. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes qui permettent un examen visuel continu de la croissance des racines, comme les poches de croissance et les casons, est qu’il y a très peu de risque de contamination croisée des plantes inoculées avec différentes souches de Cy Melo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la symbiose de Zoia legum, telles que le calendrier de développement des nodules racinaires chez les plantes de mégo trica inoculées avec une collection de souches de Melodi rosa rosa qui envahissent les racines à différentes efficacités.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la construction des microcosmes et le transfert des semis sont difficiles à décrire dans le texte. Haji Mendez, un étudiant diplômé, et Clotilde Caru, postdoctorante dans mon laboratoire, m’aideront à faire la démonstration de cette procédure. Cette procédure commence par la stérilisation de l’aula du tronc M.

A 17 graines par scarification acide pèsent d’abord suffisamment de graines pour le nombre souhaité de semis. Mula A 17 graines d’environ quatre milligrammes chacune, transfère les graines dans des flacons stériles de 125 millilitres avec des couvercles en aluminium stériles et une pipette. 20 millilitres d’acide sulfurique concentré le long du côté du ballon Le pipetage de l’acide le long du côté du ballon soulèvera, stérilisera l’intérieur du ballon qui entre en contact avec des graines non stérilisées.

Cassez les touffes de graines à l’aide d’une pipette en verre stérile. Agitez fréquemment chaque flacon pendant 10 à 12 minutes. De petites fosses brunes deviendront visibles sur les graines.

Il s’agit de minuscules trous dans le tégument de la graine lorsqu’au moins 10 % des graines ont de petites fosses brunes ou que 12 minutes se sont écoulées, selon la première éventualité, retirez tout l’acide du ballon à l’aide d’une pipette en verre stérile. Inclinez le ballon pour recueillir l’acide restant dans la courbe du ballon et utilisez une petite pipette en verre pour retirer toutes les graines de rinçage acide restantes en versant rapidement 100 millilitres d’eau stérile ultrapure dans chaque ballon. L’excès de volume d’eau diluera l’acide et empêchera la surchauffe et les dommages aux graines lors de la réaction de l’acide avec l’eau, videz l’eau et stérilisez à la flamme le rebord du flacon.

Ajoutez 50 millilitres d’eau stérile ultrapure dans chaque flacon et agitez. Videz l’eau, allumez la lèvre de la fiole. Ajoutez encore 50 millilitres d’eau ultrapure stérile et remuez de cette manière.

Rincez les graines huit à 10 fois après le dernier rinçage. Versez 50 millilitres d’eau stérile ultrapure dans chaque flacon et replacez le couvercle en aluminium stérile et placez-le à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant la nuit pendant la nuit. Pour laisser les graines s’imprégner le lendemain, placez les deux flacons dans une hotte stérile à flux laminaire.

Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire stérile, car les spores de moisissure en suspension dans l’air sont les contaminants les plus problématiques. Videz l’eau de chaque flacon et rincez deux fois avec environ 25 millilitres d’eau ultra-pure. Après le deuxième rinçage, ajoutez 20 millilitres d’eau ultrapure stérile dans chaque flacon pour remettre les graines en suspension et versez les graines dans une plaque de germination de gélose à 1,1 à 1,2 % en faisant tourner la plaque pour répartir les graines.

Les graines doivent être réparties uniformément dans une bande de quatre à cinq centimètres. À une extrémité de l’assiette, ce sera le haut de l’assiette. Les cinq à six centimètres inférieurs doivent être exempts de graines.

Prélevez l’eau à l’aide d’une pipette stérile. Inclinez la plaque à un angle de 45 degrés pendant 10 à 20 minutes pour laisser l’eau restante s’écouler vers le bas de la plaque. Ensuite, retirez toute l’eau qui s’est accumulée au bas de la plaque inclinée à l’aide d’une pipette stérile.

Remettez le couvercle en place et scellez la plaque avec param. Empilez les plaques de germination, puis retournez-les toutes. À un angle de 90 degrés, les graines reposeront sur la surface verticale de la gélose.

Les graines entièrement imbibées doivent facilement adhérer à l’agar. Les racines pousseront vers le bas. Enveloppez la pile de plaques de germination dans du papier d’aluminium pour bloquer la lumière et maintenez-la à 25 degrés Celsius pendant trois jours.

Pour commencer cette procédure, préparez le support de jenssen en suivant la recette et les instructions du manuscrit d’accompagnement. Une fois que le milieu a refroidi, que des suppléments ont été ajoutés et que le pH a été vérifié, commencez à verser le milieu dans un diamètre rond de 100 millimètres. Plaques de 15 millimètres de profondeur.

Les assiettes doivent être coulées à environ 0,9 à un centimètre de profondeur. En utilisant environ 70 millilitres de fluide par assiette. Empilez les plaques pendant le coulage pour éviter la formation de condensation sur les couvercles des plaques.

Les composants du milieu de jenssen peuvent former un précipité trouble, il est donc important de remettre périodiquement le pichet dans la plaque d’agitation magnétique pour éviter que les composants ne se déposent. Une fois que les plaques du jenssen se sont solidifiées, les plaques et les couvercles doivent être entaillés avec une spatule de pesée qui a été pliée en forme de U. Chauffez le coude de la spatule avec un brûleur jusqu’à ce qu’il soit rouge chaud, cinq à six assiettes, puis chauffez et entaillez à nouveau, entaillez également les couvercles des plaques.

Lorsque le couvercle cranté est placé sur la plaque crantée, un portail ovale sera créé à travers lequel la goulotte du semis se développera. Trois jours après que les graines de Mula aient été préparées pour la germination, comme indiqué précédemment, ouvrez une plaque de germination et inondez-la immédiatement d’eau stérile ultra pure. Trempez la pince dans l’éthanol et allumez brièvement la flamme pour stériliser.

Utilisez la pince stérile pour pousser doucement les extrémités des racines de tous les plants sous l’eau afin d’éviter le dessèchement, sélectionnez des semis avec des racines droites et sans défauts évidents. Vérifiez que les couvercles des microcosmes moyens de jenssen ne contiennent pas de condensation. Agissez le couvercle pour éliminer la condensation à l’aide d’une pince.

Cueillez délicatement un semis de la plaque de germination près des edins et déposez la racine sur un jenssen. Microcosme moyen. Assurez-vous que l’extrémité de la racine est en contact avec la gélose.

Retirez délicatement le tégument s’il est encore présent. Taquinez doucement le tégument avec la pince jusqu’à ce qu’il cède et jetez le co-plombine et environ 0,5 centimètre de goulotte. Doit dépasser de l’encoche en U de la plaque, remplacer soigneusement le couvercle de la plaque par l’encoche en U du couvercle sur le plantule, créant ainsi un portail pour le semis avant l’inoculation des microcosmes Les suspensions d’inoculum esil latte sont préparées à partir de cultures de S mil latte comme décrit dans le texte d’accompagnement.

Chaque suspension est diluée dans de l’eau ultrapure stérile à une OD 600 de 0,05 et la turbidité de la suspension doit être à peine perceptible à l’œil nu. Ouvrez chaque microcosme et inoculez 100 microlitres de la suspension salvati appropriée sur la racine du plantule. Remettez le couvercle en place et réservez-le en piles horizontales de six à 10 microcosmes pour chaque souche de SEL à comparer.

Inoculez au moins 15 plantes pour les souches qui présentent des différences subtiles de productivité symbiotique. Inoculer 30 à 35 plantes Laisser au moins 10 plantes non inoculées en tant que témoin négatif inoculer 30 à 35 plantes avec Esme Lata 1 0 2 1 ou une autre souche sauvage appropriée pour servir de témoin positif après au moins 20 minutes pour permettre à la suspension d’Esme Lata d’être absorbée à la surface des racines et au liquide de suspension de s’imprégner dans la gélose, envelopper chaque plaque individuellement avec un film de paraffine être enveloppé jusqu’au bord de l’encoche, mais le film de paraffine ne doit pas bloquer la croissance du plantule. Alignez les portails de semis de chaque pile de six à 10 assiettes.

Posez la pile à un angle de 90 degrés avec les semis pointant vers le haut. L’adhérence du film de paraffine maintiendra les plaques en place assez longtemps pour envelopper toute la pile dans du papier d’aluminium, laissant une bande d’un à deux centimètres déballée où les semis émergent. Placez les piles enveloppées de papier d’aluminium dans une chambre de croissance éclairée ou une salle de culture réglée dans des conditions appropriées.

Les plantes peuvent être maintenues en microcosmes jusqu’à neuf semaines. Le nombre de nodules peut être quantifié à une série de points temporels en déballant la feuille de chaque pile et en comptant les nodules. Les nodules en développement sur les plantes inoculées avec le type sauvage SME 1 0 2 1 sont apparents 10 à 14 jours après l’inoculation.

La productivité symbiotique peut également être mesurée à chaque point temporel en mesurant la longueur de la goulotte émergente. La quantification finale de la productivité symbiotique est généralement effectuée sept semaines après l’inoculation en détachant la goulotte et en mesurant le poids frais des jeunes plants de mula. Des microcosmes de croissance dans un incubateur sont montrés sur cette photo.

S’ils sont bien emballés, plus de 220 microcosmes tiendront sur une étagère d’incubateur de 73,8 centimètres sur 67,5 centimètres. Les quatre images suivantes montrent plusieurs vues différentes de microcosmes contenant Mula. A 17 plantes inoculées avec le type sauvage S, Malte 1 0 2 1 Les panneaux B et C montrent des microcosmes dans une pile enveloppée de papier d’aluminium avec des plantes émergeant des portails dans les microcosmes.

La longueur des pousses peut être mesurée à partir du point d’émergence du microcosme sans perturber la plante. Le panneau D montre un seul microcosme avec la feuille enlevée et la racine et les nodules visibles à travers l’avant de la plaque. Le panneau E montre le même microcosme couché à plat avec la plante émergeant du portail dans la plaque.

La croissance dans les microcosmes est idéale pour recueillir une série de points temporels du développement des nodules et de la longueur des pousses. Ce graphique montre les données sur la longueur des pousses pour emran atula. A 17 plantes inoculées avec le type sauvage Es Malta 1 0 2 1 par rapport aux plantes non inoculées sept semaines et neuf semaines après l’inoculation.

Neuf semaines après l’inoculation, les pousses sont coupées pour mesurer le poids frais des pousses. Les plantes non inoculées cesseront de croître et jauniront et leurs pousses n’atteindront qu’un poids d’environ 0,01 gramme. Les plantes inoculées avec des souches ssta qui envahissent Mula plus efficacement pousseront plus rapidement et atteindront un poids de 0,10 à 0,12 gramme neuf semaines après l’inoculation.

Cette figure montre des exemples de trois phénotypes symbiotiques sept semaines après l’inoculation. La productivité symbiotique relative de MTR aula. Un 17 plants inoculés avec différents flux de smeta est quantifié par la longueur des pousses en centimètres, en mètres et le poids frais des pousses en grammes.

Les astérisques sur les barres de greffe indiquent une différence statistiquement significative par rapport à la souche de référence de type sauvage 1 0 2 1 dans un test T non apparié. Le nombre de nodules racinaires sur les plantes inoculées avec ces souches est indiqué dans le panneau C.Une couleur rose indique que les nodules sont fonctionnels et capables de fixer l’azote, tandis que les petits nodules blancs sont généralement non fonctionnels et que les nodules bruns sont sénescents et nécrotiques. Les comparaisons de cette figure ont montré que la productivité symbiotique des plantes du tronc M aula A 17 inoculées avec SML Lavati 1 0 2 1 portant le plasmide P-S-T-B-L-A FFR five XOY, qui surexprime le phosphate parental XOY ecop galactose phospho transférase, est supérieure à celle des souches sauvages de type S me 1 0 2 1 et des souches portant le plasmide témoin négatif P-S-T-B-L-A-F-R cinq.

Ces souches ex-oy surexprimant produisent plus de l’exopolysaccharide symbiotique SAG glycane que les souches témoins. La capacité de quantifier les différences dans les phénotypes symbiotiques qui mettent plusieurs semaines à se manifester est un avantage majeur de cette méthode pour toutes les mesures de la productivité symbiotique. Sur MTR Aula A 17, les souches Sano Zoia Medicaid WSM 4 1 9 et ABS sept donnent de meilleurs résultats que les plantes Smeta 1 0 2 1 inoculées avec un mutant nul XO YN cinq qui ne produit pas de suc et O glycane avaient des longueurs de pousses et un poids frais similaires à ceux des plantes non inoculées et ne produisaient que des nodules inefficaces au moment où le microcosme est démonté et que les poids frais des pousses sont mesurés également être supprimé.

Pour l’imagerie de vues représentatives de l’atule du tronc M. A 17 racines après l’élimination des microcosmes sont montrées dans ceci. Figure. Les panneaux A et B sont des images à 10 jours après l’inoculation et le panneau C est une image à 14 jours après l’inoculation, la barre dans chaque image correspond à 100 microns.

Les racines montrées ici ont été inoculées avec smeta 1 0 2 1 de type sauvage, une souche smeta portant un œuf, C Gus Fusion et une souche smeta portant un SMC 0 0 9 1 1. La coloration des cellules IST porteuses du SMC 0 0 9 1 1 La fusion de Gus est visible sur les poils racinaires et la surface de la racine. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de garder la racine du semis en contact avec la gélose à tout moment après cette procédure.

D’autres méthodes telles que la césarienne et la coloration des nodules sont la préparation de l’ARN total à partir de racines et les nodules peuvent être effectués afin d’analyser les différences d’anatomie, de physiologie et d’expression génique associées à chaque phénotype symbiotique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place des microcosmes stériles à plante unique pour l’observation de la symbiose Mego Tula Sino Rosa Melo, y compris la germination des graines, la préparation du microcosme et l’inoculation des plantules.