Name: Utilisation de la tranche pulmonaire coupée avec précision pour étudier la régulation contractile des voies respiratoires et du muscle lisse artériel intrapulmonaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez la préparation de tranches pulmonaires de précision chez la souris pour étudier la contractilité du muscle lisse dans un environnement proche du vivant. Cette méthode ex vivo permet d'analyser les mécanismes cellulaires des voies respiratoires.

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Ce travail est soutenu par des subventions des NIH, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A).

Tous les soins aux animaux étaient conformes aux directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee du Massachusetts General Hospital. Des souris mâles de type sauvage C57/B6, âgées de 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude.
1. Préparation expérimentale
<ol><li>Préparez la solution de travail.<ol>
<li>Préparez 1x solution saline équilibrée de Hank (HBSS, avec Ca2+ et Mg2+, et pH équilibré avec 20 mM HEPES, voir Tableau des matériaux). Utilisez la solution HBSS pour préparer et traiter le PCLS. Gardez la solution HBSS froide sur la glace lors de la préparation des PCLS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le milieu de culture du PCLS en complétant le milieu Eagle modifié de Dulbecco et le F-12 (DMEM-F12) avec un agent antibiotique-antimycotique (rapport volumique 1:100, voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Préparer une solution d’agarose à 1,5 % et une solution de gélatine à 6 %.<ol>
<li>Mélanger séparément l’agarose ou la poudre de gélatine à faible point de fusion (LMP) avec la solution HBSS séparément dans des tubes centrifuges stériles de 15 mL (ou des tubes de 50 mL si le volume de la solution >10 mL) jusqu’aux concentrations finales. REMARQUE: Volume total de la solution d’agarose = 5 mL/souris x nombre de souris; solution de gélatine = 2 mL/souris x nombre de souris.</li>
		<li>Chauffer les tubes de solution dans de l’eau bouillante jusqu’à ce que la poudre se dissout complètement. Conservez les solutions d’agarose et de gélatine dans un bain-marie à 42 °C. REMARQUE: Une lampe chauffante à la table de dissection peut être utile pour garder l’environnement d’exploitation au chaud et empêcher la solution d’agarose de se solidifier avant d’être injectée dans le poumon de la souris.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immergez tous les outils de dissection, y compris une paire de ciseaux à dissection, deux paires de pinces à micro-dissection incurvées et une paire de pinces hémostatiques dans une solution d’éthanol à 70% pendant au moins 20 min pour la stérilisation.</li>
	<li>Gardez un vibratome prêt (voir tableau des matériaux) pour sectionner le tissu pulmonaire en fines tranches.</li>
	<li>Conservez un microscope à contraste de phase inversé avec une caméra CCD pour évaluer les réponses contractiles des voies respiratoires ou vasculaires et un microscope confocal à balayage laser construit sur mesure (voir tableau des matériaux) pour évaluer la signalisation Ca2+ dans les SMC pulmonaires18.</li>
</ol>2. Gonflage des poumons de souris avec une solution d’agarose et de gélatine
<ol><li>Euthanasier la souris.<ol>
<li>Placez la souris dans une chambre en plastique (environ 750 cm3) avec 5% d’isoflurane. Gardez la souris dans la chambre jusqu’à ce qu’elle cesse de respirer pendant au moins 1 min. REMARQUE: D’autres méthodes d’euthanasie primaires, telles que l’injection intrapéritonéale de kétamine (240 mg / Kg) et de xylazine (32 mg / Kg) 19 ou de pentobarbital (0,3 mL) 20, peuvent être appliquées comme alternatives à l’isoflurane inhalé.</li>
		<li>Placez le corps de la souris sur une planche de dissection en position couchée. Fixez le corps en position en épinglant la queue, les pattes avant et la tête avec des aiguilles de seringue de 25 G, et désinfectez le corps avec un spray à éthanol à 70%.</li>
		<li>Coupez l’abdomen de la souris avec des ciseaux chirurgicaux (incision, ~ 2 cm de long x 2 cm de large). Ensuite, coupez l’aorte abdominale pour épuiser le volume sanguin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gonflez les lobes pulmonaires en suivant les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Ouvrez soigneusement la cavité thoracique le long du sternum et de la cage thoracique inférieure bilatérale au-dessus du diaphragme, et observez les lobes pulmonaires s’effondrer lorsque la cavité thoracique s’ouvre.</li>
		<li>Retirez une partie des cages thoraciques ventrales bilatérales pour exposer le cœur. Évitez les lésions pulmonaires en pointant la pointe de ciseaux pointue loin du tissu pulmonaire.</li>
		<li>Utilisez une pince pour séparer le thymus et les tissus mous dans le cou de la souris afin d’exposer la trachée.</li>
		<li>Couper un petit trou (1,2 mm de diamètre) dans l’extrémité supérieure de la trachée permettant le passage de l’extrémité d’un cathéter IV en forme de Y de 20 G (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Connectez un orifice adaptateur du cathéter en forme de Y avec une seringue de 3 mL préremplie avec 0,5 mL d’air, et l’autre orifice avec une seringue de 3 mL préremplie avec 2 mL de solution chaude d’agarose à 1,5 % (42 °C).</li>
		<li>Injecter une solution d’agarose pour remplir le cathéter, puis pousser le cathéter à travers l’ouverture prédécoupée dans la trachée sur une longueur de 5 à 8 mm.</li>
		<li>Injecter lentement la solution d’agarose à environ 1 mL/5 s. Le poumon se dilatera le long de l’axe proximal-distal. Arrêter l’injection lorsque le bord de chaque lobe pulmonaire est gonflé. REMARQUE: Ne gonflez pas trop le poumon, car cela pourrait le rompre. Le volume de la solution d’agarose pour gonfler tout le poumon d’une souris jeune adulte est d’environ 1,3 ± 0,1 mL.</li>
		<li>Injecter 0,2 à 0,3 mL d’air de l’autre seringue pour pousser l’agarose résiduelle dans le cathéter et les voies respiratoires conductrices vers l’espace des alvéoles distales.</li>
		<li>Coupez la trachée avec une paire de pinces hémostatiques incurvées (voir Tableau des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remplissez le système vasculaire pulmonaire.<ol>
<li>Remplissez une seringue de 1 mL avec de la gélatine chaude de 6 %. Connectez-vous à un cathéter veineux du cuir chevelu à aiguille, remplissez le cathéter avec une solution de gélatine, puis perforez le ventricule droit près de la paroi inférieure avec l’aiguille.</li>
		<li>Poussez l’aiguille dans le ventricule droit sur une longueur de 2 à 3 mm et pointez la pointe de l’aiguille vers l’artère pulmonaire principale.</li>
		<li>Injecter lentement 0,2 mL de solution de gélatine dans le ventricule droit et les vaisseaux artériels pulmonaires. REMARQUE: Les lobes pulmonaires apparaissent légèrement plus pâles avec un gonflage approprié de la gélatine.</li>
		<li>Gardez l’aiguille en place pendant 5 minutes après l’injection, refroidissez les lobes pulmonaires en versant une solution HBSS glacée sur le cœur et les poumons, puis placez le corps avec la dissection dans un réfrigérateur à 4 °C ou sur de la glace pendant un total de 10 min.</li>
		<li>Retirez le poumon et le cœur de la souris des tissus conjonctifs environnants avec des ciseaux. Ensuite, séparez chaque lobe pulmonaire et conservez-les dans une solution HBSS sur de la glace.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sectionnement des lobes pulmonaires en fines tranches
<ol><li>Couper et fixer le lobe pulmonaire sur le dessus de la colonne d’échantillon avec de la supercolle et orienter le lobe (Figure 1A, B) pour permettre à la direction de coupe d’être perpendiculaire à la plupart des voies respiratoires de la hile à la surface du poumon.</li>
	<li>Utilisez un vibratome avec une lame de rasoir mince et fraîche pour couper le lobe pulmonaire en tranches de 150 μm. Recueillir les tranches dans des boîtes de Petri stériles de 100 mm préremplies de solution HBSS froide. REMARQUE: Réglez la vitesse de déplacement et la fréquence d’oscillation appropriées de la lame avant de commencer le tranchage. Un réglage typique pour un Compresstom est le niveau de vitesse 4 et le niveau d’oscillation 4.</li>
	<li>Transférer les tranches dans des boîtes de Petri remplies de milieu de culture DMEM/F-12 (20 tranches/15 mL de milieu/plat) et les conserver dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit avant les expériences. REMARQUE: Les PCLS de souris peuvent être maintenus en culture pendant environ 7 jours sans perdre les réponses contractiles des voies respiratoires17. La longévité des artères pulmonaires n’a pas été évaluée de manière approfondie. Dans notre observation, ils conservent une structure intacte et une vasoréaction pendant au moins 3 jours en milieu DMEM/F12. Pour un stockage à long terme, les PCLS de souris peuvent être placés dans des cryoviales remplies de milieu DMEM/F12 contenant 10% de DMSO (5 tranches dans un milieu de 1 mL par flacon), congelées dans un récipient rempli d’alcool isopropylique à -80 ° C pendant la nuit et cryoconservées dans de l’azote liquide pendant des semaines àdes mois 21.</li>
</ol>4. Analyse des réponses contractiles des voies respiratoires et des artères intrapulmonaires
<ol><li>Placez les PCLS dans une plaque de culture de 24 puits remplie de HBSS, une dans chaque puits. Localisez le PCLS au milieu du puits, puis retirez la solution HBSS à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Trouvez les voies respiratoires et le récipient cibles dans la tranche au microscope, puis couvrez la tranche à l’aide d’un maillage en nylon avec un trou central prédécoupé (2-3 mm de diamètre) pour exposer la zone cible.</li>
	<li>Posez une rondelle métallique creuse sur le dessus du maillage pour maintenir les tranches en place (Figure 2A).</li>
	<li>Ajouter 600 μL de solution HBSS pour immerger le PCLS. Reposez la tranche pendant 10 minutes, puis enregistrez les images de base des voies respiratoires ou des navires.</li>
	<li>Induire la contraction des voies respiratoires ou vasculaires en aspirant prudemment la solution HBSS vierge avec une pipette et en ajoutant 600 μL de HBSS avec un agoniste, comme 1 μM de méthacholine (MCh) ou 10 nM d’endothéline (voir tableau des matériaux). REMARQUE: La stimulation KCl en tant que norme d’ensemble d’outils n’est pas nécessaire avant l’exposition à la méthcholine ou à l’endothéline. 100 mM de stimulation KCl dans les voies respiratoires de la souris n’induit qu’une contraction petite et irrégulière des voies respiratoires (10%-15%)20. De même, une stimulation amorçante de la méthacholine n’est pas obligatoire car nous avons confirmé que le même agoniste, par exemple la méthacholine ou la sérotonine, déclenche une contraction similaire des voies respiratoires lors de la première exposition répétitive20,22.</li>
	<li>Observez la réaction au microscope jusqu’à ce que le changement de la zone luminale atteigne un état équilibrant, puis enregistrez les images des voies respiratoires ou vasculaires pour analyse.</li>
	<li>Retirer la solution de MCh ou d’endothéline à l’aide d’une pipette et ajouter une nouvelle solution HBSS de 600 μL avec la même concentration d’agonistes et un relaxant; observer et enregistrer les voies respiratoires ou la relaxation vasculaire.</li>
	<li>Quantifiez les voies respiratoires ou la réaction vasculaire en suivant les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Chargez les images sur le logiciel gratuit FIJI sponsorisé par les NIH.</li>
		<li>Sélectionnez la sélection de polygones dans la barre d’outils pour dessiner le contour des voies respiratoires ou de la lumière vasculaire sur chaque image.</li>
		<li>Choisissez Analyser > Définir les mesures > la zone.</li>
		<li>Choisissez Analyser > Mesure pour quantifier le domaine d’intérêt. Les résultats sont affichés dans une fenêtre distincte pour l’analyse statistique.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analyse de la signalisation Ca2+ des SMC des voies respiratoires ou vasculaires
<ol><li>Préparez le tampon de chargement du colorant Ca2+ .<ol>
<li>Dissoudre le colorant Ca2+ , Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (voir tableau des matériaux), 50 μg (un flacon) avec 10 μL de DMSO.</li>
		<li>Dissoudre 0,2 g de poudre de Pluronic F-12 (voir Tableau des matériaux) dans 1 mL de DMSO pour générer une solution pluronique à 20 %.</li>
		<li>Mélanger 10 μL de solution pluronique à 20 % avec 10 μL de solution de colorant-DMSO Ca2 +.</li>
		<li>Fabriquer un tampon de charge de colorant Ca2+ en ajoutant 20 μL du mélange à 2 mL de solution HBSS avec 200 μM de sulfobromophtaléine (voir Tableau des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer 15 PCLS souris dans 2 mL de tampon de chargement Ca2+ et incuber à 30 °C pendant 1 h. Déplacer ensuite les tranches à 2 mL de solution HBSS avec 100 μM de sulfobromophtaléine pendant 30 minutes supplémentaires pour la désestérification des colorants fluorescents à température ambiante.</li>
	<li>Détecter la signalisation Ca2+ des SMC.<ol>
<li>Placez les tranches chargées de colorant Ca2+ sur un grand verre de couverture.</li>
		<li>Remplissez une seringue de 3 mL avec de la graisse de silicone sous vide poussé. Pressez la graisse à travers une aiguille émoussée de 18 G pour tracer deux lignes parallèles sur le verre de couverture au-dessus et au-dessous de la tranche.</li>
		<li>Couvrir la tranche à l’aide d’une maille en nylon entre deux lignes de graisse. Placez le deuxième verre de couverture sur le dessus de la maille pour générer une chambre scellée par de la graisse sur les côtés (Figure 3A). REMARQUE: La maille en nylon est essentielle pour maintenir la tranche attachée au couvercle inférieur et ainsi rester à la distance de travail d’un objectif inversé de grande magnitude, tel que l’huile 40x.</li>
		<li>Ajouter HBSS ou solution agoniste dans la chambre à partir d’une extrémité en pipetant manuellement ou via un système de perfusion. Retirez le fluide de la chambre en aspirant de l’autre extrémité avec du papier de soie ou du vide dans le cas d’une perfusion continue de liquide.</li>
		<li>Placez la chambre PCLS sur la scène du microscope. Détectez la signalisation Ca2+ de SMC23 avec un microscope confocal à balayage résonant sur mesure avec un taux de balayage laser de 15 ou 30 images / s. REMARQUE: Alternativement, un microscope confocal à balayage laser commercial à grande vitesse, largement disponible à l’heure actuelle, peut être appliqué dans le test de signalisation Ca2+ des SMC pulmonaires dans pcLS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifier la fluorescence du Ca2+ dans les SMC.<ol>
<li>Chargez la séquence d’images enregistrée sur FIJI et choisissez le Type d’image > > niveaux de gris 8 bits.</li>
		<li>Sélectionnez la sélection de rectangle dans la barre d’outils et définissez une région d’intérêt (ROI) de 5 pixels x 5 pixels dans une cellule musculaire lisse.</li>
		<li>Choisissez Analyser > Définir les mesures > valeur grise moyenne, représentant l’intensité de fluorescence Ca2 +.</li>
		<li>Si la position d’un retour sur investissement change avec la contraction SMC, choisissez Analyser > Mesurer l’intensité fluorescente Ca2+ image par image.</li>
		<li>Si le retour sur investissement de SMC reste dans une position similaire dans une pile d’images, choisissez Pile d’images > > Pile de mesure de l’intensité fluorescente Ca2 +. REMARQUE: Une macro écrite sur mesure peut être branchée pour suivre le retour sur investissement dans le SMC lorsqu’il se déplace avec contraction dans une pile d’images et mesure automatiquement l’intensité Ca2+ (valeur grise) du retour sur investissement image par image.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li>
<li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La préparation du PCLS implique plusieurs étapes critiques. Tout d’abord, il est essentiel de gonfler le lobe pulmonaire de manière homogène pour éviter la variation de la rigidité tissulaire due à une distribution inégale de l’agarose. Comme l’agarose liquide se gélifie rapidement dans de minces cathéters ou des voies respiratoires à une température inférieure à 37 ° C, le défaut de remplissage résultant dans le champ pulmonaire distal pourrait augmenter la disparité de la rigidité du tissu pulmonaire et provoquer une d...

La cellule musculaire lisse (SMC) est un type de cellule structurelle majeur dans le poumon, résidant principalement dans la paroi médiale des voies respiratoires et des vaisseaux pulmonaires. Les SMC se contractent pour modifier le calibre luminal, régulant ainsi le flux d’air et de sang 1,2. Par conséquent, la régulation contractile des SMC est essentielle pour maintenir l’homéostasie de la ventilation de l’air et de la circulation pulmonaire. En revanche, la contractilité aberrante du SMC provoque des maladies vasculaires obstructives ou pulmonaires comme l’asthme et l’hypertension artérielle pulmonaire. Cependant, l’évaluation fonctionnelle des SMC pulmonaires a été remise en question par un accès limité au tissu pulmonaire, en particulier aux petites voies respiratoires et aux microvaisseaux dans la partie distale du poumon 2,3. Les solutions actuelles ont recours à des tests indirects, tels que la mesure de la résistance au flux d’air par Flexivent pour refléter la constriction des voies respiratoires et la vérification de la pression artérielle pulmonaire par cathétérisme cardiaque droit pour évaluer la vasocontraction pulmonaire 4,5. Cependant, ces essais indirects présentent de multiples inconvénients, tels que le fait d’être confondus par des facteurs structurels, de ne pas capturer la diversité spatiale des réponses vasculaires ou vasculaires dans l’ensemble de l’échelle pulmonaire 6,7 et de ne pas convenir à l’étude mécaniste de la régulation contractile au niveau cellulaire. Par conséquent, des approches alternatives utilisant des cellules primaires isolées,des bandes musculaires trachées/ bronchiques 8,9 ou de grands segments vasculaires10 ont été appliquées pour l’étude SMC in vitro. Néanmoins, ces méthodes ont également des limites. Par exemple, une adaptation phénotypique rapide des SMC primaires dans la condition de culture11,12 rend problématique l’extrapolation des résultats de la culture cellulaire aux contextes in vivo. De plus, le phénotype contractile des SMC dans les voies respiratoires proximales isolées ou les segments vasculaires peut ne pas représenter les SMC dans le poumon distal 6,7. De plus, la mesure de la force musculaire au niveau tissulaire reste dissociée des événements moléculaires et cellulaires qui sont essentiels pour la compréhension mécaniste de la régulation contractile.
La tranche pulmonaire coupée avec précision (PCLS), une section de tissu pulmonaire vivant, fournit un outil ex vivo idéal pour caractériser les SMC pulmonaires dans un microenvironnement quasi in vivo (c.-à-d. architecture et interaction multicellulaires préservées)13. Depuis que les Drs Placke et Fisher ont introduit pour la première fois la préparation de tranches pulmonaires à partir de poumons de rat et de hamster gonflés à l’agarose dans les années 1980 14,15, cette technique a été continuellement avancée pour fournir aux PCLS une qualité supérieure et une plus grande polyvalence pour la recherche biomédicale. Une amélioration significative est l’amélioration de la préservation artérielle pulmonaire par perfusion de gélatine en plus de l’inflation pulmonaire avec l’agarose via la trachée. En conséquence, les artères respiratoires et pulmonaires sont maintenues intactes dans le PCLS pour l’évaluation ex vivo 16. De plus, le PCLS est viable pendant une période prolongée en culture. Par exemple, les PCLS de souris n’ont eu aucun changement significatif dans la viabilité cellulaire et le métabolisme pendant au moins 12 jours en culture, ainsi que, ils ont conservé la contractilité des voies respiratoires jusqu’à 7 jours17. En outre, PCLS conserve des voies respiratoires ou des vaisseaux de différentes tailles pour les tests de contraction et de relaxation. De plus, la signalisation intracellulaire Ca2+ des SMC, le facteur déterminant de la contractilité cellulaire, peut être dosée avec des colorants rapporteurs Ca2+ imagés par un microscope confocal ou à 2 photons13.
Compte tenu de l’application étendue du modèle murin dans la recherche pulmonaire, un protocole détaillé est décrit ici pour préparer le PCLS de souris avec des voies respiratoires et des artères intrapulmonaires intactes pour la recherche pulmonaire ex vivo . À l’aide des LPC préparés, nous avons ensuite démontré comment évaluer les réponses artérielles et pulmonaires aux stimuli constrictifs ou relaxants. En outre, la méthode de chargement du PCLS avec un colorant rapporteur Ca2+ , puis l’imagerie de la signalisation Ca2+ des SMC associés à des réponses contractiles ou relaxantes sont également décrites.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger stériles de 15 mL</td><td>Seringue Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>de 3 mL</td><td>Tubes</td><td></td> à centrifuger stériles de 309585 <td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Celltreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>Acétyl-bêta-méthacholine</td><td>Millipore Sigma</td><td>62-51-1</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-anitmycotique</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo CCD</td><td>Nikon</td><td>Nikon Ds-Ri2 Lunettes</td><td></td></tr><tr><td>de protection</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5CP ; 12-548-5PP</td><td></td></tr><tr><td>Flacons cryogéniques</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td> confocal à balayage laser sur mesure <td>Détails dans la référence 18</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-092-CM</td><td></td></tr><tr><td>Endothéline 1</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à dissection fine</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9702861</td><td></td></tr><tr><td>Récipient de congélation</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de peau de porc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>14025092</tr><tr><td>Pince hémostatique</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-117</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Graisse silicone sous vide élevé</td><td>Fisher Scientific</td><td>146355d</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Rondelles métalliques</td><td>Home Depot Product Authority</td><td>800442</td><td>Everbilt Rondelles plates #10</td></tr><tr><td>Pince à micro-dissection</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille pour les veines du cuir chevelu (25 G)</td><td>EXELINT</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>NOC-5</td><td>Cayman Chemical</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Maille de nylon</td><td>Approvisionnement en composants</td><td>U-CMN-300</td><td></td></tr><tr><td>Vert Oregon 488 BAPTA-1 AM</td><td>Life Technologies</td><td>o-6807</td><td></td></tr><tr><td>Contraste de phase microscope</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TS 100</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Thermo Fisher</td><td>P-6867</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Personna</td><td></td><td>Personna Double Edge Lames de rasoir en emballage blanc 100 fils</td></tr><tr><td>Sulfobromophtalein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0252</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Krazy Glue</td><td>Krazy Glue</td><td></td>, Tout usage</tr><tr><td>Ultrapure faible agarose au point de fusion</td><td>Thermo Fisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Precisionary</td><td>VF 310-0Z</td><td></td></tr><tr><td>Bloc de refroidissement Vibratome</td><td>Precisionary</td><td>SKU-VM-CB12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’échantillon Vibratome</td><td>Precisionary</td><td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>Cathéter IV en forme de Y</td><td>BD</td><td>383336</td><td>BD Saf-T-Intima cathéter IV fermé</td></tr></tbody></table>

utilisation de la tranche pulmonaire coupée avec précision pour étudier la régulation contractile des voies respiratoires et du muscle lisse artériel intrapulmonaire

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Les cellules musculaires lisses (SMC) médient la contraction des voies respiratoires et de l’artère intrapulmonaire pour modifier la résistance au flux d’air et la circulation pulmonaire, respectivement, jouant ainsi un rôle essentiel dans l’homéostasie du système pulmonaire. La dérégulation de la contractilité SMC contribue à plusieurs maladies pulmonaires, y compris l’asthme et l’hypertension pulmonaire. Cependant, en raison de l’accès limité aux tissus et d’un manque de systèmes de culture pour maintenir les phénotypes SMC in vivo , les mécanismes moléculaires sous-jacents à la contractilité DÉRÉGULée du SMC dans ces maladies restent pleinement identifiés. La tranche de poumon découpée avec précision (PCLS) offre un modèle ex vivo qui contourne ces difficultés techniques. En tant que section de tissu pulmonaire mince et vivant, le PCLS retient le SMC dans un environnement naturel et permet un suivi in situ de la contraction du SMC et de la signalisation intracellulaire Ca2+ qui régule la contractilité du SMC. Ici, un protocole détaillé de préparation PCLS de souris est fourni, qui préserve les voies respiratoires intactes et les artères intrapulmonaires. Ce protocole implique deux étapes essentielles avant de soumettre le lobe pulmonaire au tranchage: gonfler les voies respiratoires avec de l’agarose à faible point de fusion à travers la trachée et remplir les vaisseaux pulmonaires de gélatine à travers le ventricule droit. Le PCLS préparé à l’aide de ce protocole peut être utilisé pour des essais biologiques afin d’évaluer la régulation contractile médiée par ca2+ de la SMC dans les voies respiratoires et les compartiments artériels intrapulmonaires. Lorsqu’il est appliqué à des modèles murins de maladies respiratoires, ce protocole permet l’étude fonctionnelle de la SMC, fournissant ainsi un aperçu du mécanisme sous-jacent de la dérégulation de la contractilité SMC dans les maladies.

Préparation pcLS de souris préservant les voies respiratoires et les artères intrapulmonaires intactes Un PCLS de 150 μm d’épaisseur a été observé au microscope à contraste de phase inversé. Dans les poumons de souris, les voies respiratoires conductrices sont accompagnées d’artères intrapulmonaires, allant du hile au poumon périphérique. Un faisceau sinusoïdal-artère pulmonaire représentatif dans un PCLS de souris est illustré à la figure 2B. Les voies respiratoires peuv...

Le présent protocole décrit la préparation et l’utilisation de tranches pulmonaires coupées avec précision par des souris pour évaluer la contractilité des voies respiratoires et des muscles lisses artériels intrapulmonaires dans un milieu presque in vivo .

Utilisation de la tranche pulmonaire coupée avec précision pour étudier la régulation contractile des voies respiratoires et du muscle lisse artériel intrapulmonaire

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

Le PCLS soutient l’évaluation de l’activité des voies respiratoires et des cellules musculaires lisses vasculaires dans un environnement tissulaire presque intact, fournissant ainsi un modèle ex vivo inestimable pour la recherche pulmonaire. En termes de recherche sur les muscles lisses, les tranches pulmonaires coupées avec précision préservent le phénotype in vivo des cellules musculaires lisses et leur interaction avec les structures environnantes tout en permettant l’accès aux cellules musculaires lisses, ce qui est important pour une étude mécaniste au niveau cellulaire. Pour commencer, placez le corps de la souris sur une planche de dissection en position couchée.Épinglez la queue, les pattes avant et la tête avec des aiguilles de seringue 25G et désinfectez le corps avec de l’éthanol à 70%. Ouvrez soigneusement la cavité thoracique le long du sternum et de la cage thoracique inférieure bilatérale au-dessus du diaphragme. Ensuite, pointez la pointe de ciseaux pointue loin du tissu pulmonaire et retirez une partie des cages thoraciques ventrales bilatérales pour exposer le cœur.Observez que les lobes pulmonaires s’effondrent lorsque la cavité thoracique s’ouvre. Utilisez des ciseaux pour enlever les tissus mous dans le cou de la souris afin d’exposer la trachée. À l’extrémité supérieure de la trachée, faites un petit trou de diamètre de 1,2 millimètre qui devrait permettre le passage d’une pointe de cathéter IV en forme de Y de 20 G.Connectez un port adaptateur du cathéter en forme de Y avec une seringue de 3 millilitres préremplie de 0,5 millilitre d’air et l’autre port avec une seringue de 3 millilitres préremplie de 2 millilitres de solution d’agarose à 1,5% chauffée à 42 degrés Celsius. Injecter une solution d’agarose pour remplir le cathéter, puis pousser le cathéter à travers l’ouverture dans la trachée à 5 à 8 millimètres. Injecter lentement la solution d’agarose à raison de 1 millilitre toutes les 5 secondes.Observez que le poumon se dilate le long de l’axe proximal à distal. Arrêtez l’injection lorsque le bord de chaque lobe pulmonaire est gonflé. Ensuite, injectez 0,2 à 0,3 millilitre d’air de l’autre seringue pour pousser l’agarose résiduelle dans les voies respiratoires conductrices vers l’espace des alvéoles distales.Clip a fermé la trachée avec une paire de pinces hémostatiques incurvées. Pour remplir le système vasculaire pulmonaire, remplissez une seringue de 1 millilitre avec de la gélatine chaude de 6% et connectez-la à un cathéter veineux du cuir chevelu à aiguille. Remplissez le cathéter avec une solution de gélatine, puis perforez le ventricule droit près de la paroi inférieure avec l’aiguille.Poussez l’aiguille de 2 à 3 millimètres dans le ventricule droit et pointez la pointe de l’aiguille vers l’artère pulmonaire principale. Injecter environ 0,2 millilitre de solution de gélatine lentement dans le ventricule droit et les vaisseaux artériels pulmonaires. Gardez l’aiguille en place pendant cinq minutes après l’injection et refroidissez les lobes pulmonaires en versant une solution HBSS glacée sur le cœur et les poumons et placez le corps dans un réfrigérateur.Après cette étape, retirez le poumon et le cœur de la souris des tissus conjonctifs environnants avec des ciseaux. Ensuite, séparez chaque lobe pulmonaire et conservez-les dans une solution HBSS sur de la glace. Coupez le lobe pulmonaire et orientez-le de manière à ce que la direction de coupe soit perpendiculaire à la plupart des voies respiratoires, de la hile à la surface du poumon.Fixez-le sur le dessus de la colonne de l’échantillon avec de la super colle. Utilisez un vibratome avec une lame de rasoir mince et fraîche pour couper le lobe pulmonaire en tranches de 150 micromètres. Recueillir les tranches dans des boîtes de Petri stériles préremplies avec une solution HBSS froide.Transférer les tranches dans des boîtes de Petri remplies de milieu de culture DMEM/F-12. Placez les plats dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit avant les expériences. Placez une seule tranche de poumon coupée avec précision dans chaque puits d’une plaque de culture de 24 puits remplie de HBSS.Placez la tranche au milieu du puits, puis retirez la solution HBSS à l’aide d’une pipette. Au microscope, trouvez les voies respiratoires et le récipient cibles dans la tranche, puis recouvrez-les à l’aide d’un maillage en nylon avec un trou central prédécoupé pour exposer la zone des vaisseaux des voies respiratoires ciblée. Placez une rondelle métallique creuse sur le dessus de la maille pour maintenir les tranches en place.Ensuite, ajoutez 600 microlitres de solution HBSS pour immerger les tranches. Après 10 minutes, enregistrez les images de référence. Pour induire la contraction des voies respiratoires ou vasculaires, retirez prudemment la solution HBSS avec une pipette et ajoutez 600 microlitres de HBSS avec un agoniste.Pour préparer le tampon de chargement du colorant calcique, dissolvez d’abord 50 microgrammes de colorant avec 10 microlitres de DMSO et 0,2 gramme de poudre pluronique F-12 dans 1 millilitre de DMSO. Mélanger 10 microlitres de la solution Pluronic avec 10 microlitres de solution de colorant calcique. Ajouter ce mélange à 2 millilitres de solution HBSS contenant 200 micromolaires de sulfobromophtaléine.Ensuite, placez 15 tranches de poumons coupées avec précision dans 2 millilitres de tampon de charge de calcium et incubez à 30 degrés Celsius pendant une heure, puis incubez dans hbSS contenant 100 micromolaires sulfobromophtaléine pendant 30 minutes. Ensuite, placez les tranches chargées de colorant de calcium sur un grand verre de couverture. Remplissez la graisse de silicone sous vide poussé dans une seringue de 3 millilitres attachée à une aiguille émoussée de 18 G ou à une pointe de pipette de 200 microlitres et tracez deux lignes parallèles à travers le verre de couverture, au-dessus et au-dessous de la tranche.Couvrir la tranche à l’aide d’un maillage en nylon entre deux lignes de graisse. Placez le deuxième verre de couverture sur le dessus de la maille pour générer une chambre. Ajouter HBSS ou une solution agoniste dans la chambre à partir d’une extrémité avec une pipette.Retirez le liquide de la chambre en aspirant de l’autre extrémité avec du papier de soie. La chambre de la tranche est maintenant prête pour l’imagerie calcique avec un microscope confocal à balayage laser à grande vitesse. Des faisceaux d’artères des voies respiratoires pulmonaires ont été observés dans des tranches pulmonaires découpées avec précision d’une épaisseur de 150 micromètres sous un microscope à contraste de phase.À l’état de repos, une voie respiratoire a été identifiée par des cellules épithéliales cuboïdes avec une artère pulmonaire voisine. Après l’exposition à la méthachiline, la zone luminale a été réduite tandis que l’artère pulmonaire n’a montré aucune réponse aux stimuli. Les réponses contractiles des voies respiratoires ont été quantifiées par le pourcentage de réduction de la surface luminale et ont montré des réponses dose-dépendantes similaires dans des cultures d’un jour et de cinq jours.En atteignant le champ pulmonaire périphérique, les voies respiratoires conductrices se ramifient dans les canaux respiratoires et les sacs entourant les petites artérioles intra-acineuses. Lorsqu’elles sont exposées à des endothélii, les voies respiratoires et les artères pulmonaires se contractent, suivies d’une relaxation induite par le NOC-5. À l’état de repos, les tranches chargées de colorant de calcium ont montré une faible fluorescence dans les cellules musculaires lisses des voies respiratoires et du système vasculaire sous un microscope fluorescent confocal.Lors de l’exposition aux agonistes, l’intensité de la fluorescence du calcium s’est élevée dans les cellules et s’est propagée à la cellule entière, ce qui était en corrélation avec les signaux oscillatoires. Sur le plan technique, il est essentiel de gonfler le poumon avec de l’agarose de manière homogène et d’éviter une injection rapide ou excessive d’agarose. Poussez toujours l’air à la fin pour rincer l’agarose des voies respiratoires conductrices vers l’espace des alvéoles distales.En résumé, en utilisant la culture de tranches pulmonaires coupées avec précision, on peut fournir une variété spéciale de fonctions musculaires lisses pulmonaires et modéliser la dérégulation des muscles lisses in vitro. Il fournit également une plate-forme idéale pour dépister les médicaments vasodilatateurs ou bronchodilatateurs novos.

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La vasoconstriction pulmonaire hypoxique (HPV) est un phénomène physiologique important par lequel à l’hypoxie alvéolaire la perfusion pulmonaire est assortie à la ventilation. Le segment vasculaire principal contribuant au VPH est l’artère intra-acinnaire. Ici, nous décrivons notre protocole pour l’analyse du VPH des vaisseaux pulmonaires murins d’un diamètre de 20 à 100 μm.

Analyse vidéomorphométrique de la vasoconstriction pulmonaire hypoxique des artères intra-pulmonaires à l’aide de tranches pulmonaires coupées de précision murine

Nous décrivons un procédé pour générer des tranches de poumon couper avec précision (PCLS) et les immunocoloration pour visualiser la localisation de divers types de cellules immunitaires dans le poumon. Notre protocole peut être étendu pour visualiser l'emplacement et la fonction de différents types de cellules dans une variété de conditions.

coupe de précision de la souris Tranches Lung pour visualiser les cellules vivantes pulmonaire dendritiques

Présenté ici est un protocole pour préserver la contractilité vasculaire du tissu pulmonaire murin PCLS, résultant en une image tridimensionnelle sophistiquée du système vasculaire pulmonaire et des voies respiratoires, qui peut être préservée jusqu’à 10 jours et qui est sensible à de nombreuses procédures.

Les tranches pulmonaires coupées avec précision comme outil efficace pour les études ex vivo sur la structure et la contractilité des vaisseaux pulmonaires

Les réponses vasculaires de la circulation pulmonaire artérielle peuvent être explorées à l’aide de l’artère intrapulmonaire (API) et des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). La présente étude décrit en détail l’isolement de l’IPA et les protocoles utilisés pour étudier la vasorelaxation en réponse à des stimuli physiologiques.

Isolement de l’artère intrapulmonaire et des cellules musculaires lisses pour étudier les réponses vasculaires

Test de sensibilité visuelle chez les lézards en utilisant un paradigme de conditionnement opérant, qui emploie la lecture vidéo de points aléatoires kinematograms et générés par ordinateur invertébrés.

Test sensibilité visuelle à la vitesse et la direction du mouvement chez les lézards

Générées par ordinateur en utilisant des stimuli du dragon Jacky comme un modèle.

Computer-Generated Stimuli modèle animal

Détails des méthodes à haute résolution...

Ca focale 2 + Détection de transitoires dans le muscle lisse

Cette vidéo montre et compare deux modèles expérimentaux pour étudier le développement de maladies des voies respiratoires oblitérante (OAD) chez la souris, le modèle orthotopique transplantation hétérotopique et la trachée.

Hétérotopique et orthotopique transplantation trachéale chez des souris utilisées comme modèles pour étudier le développement de maladies des voies respiratoires oblitérante

Le cordon ombilical sont utilisées pour isoler des cellules musculaires lisses de différentes façons. Dans ce travail nous avons utilisé le traitement enzymatique de cellules musculaires lisses isolées.

L&#39;isolement de l&#39;homme de l&#39;artère ombilicale cellules musculaires lisses (HUASMC)

Les efforts déployés pour isoler la sous-unité catalytique de la télomérase, TERT, en quantité suffisante pour des études structurales, ont été atteints avec un succès limité pendant plus d'une décennie. Ici, nous présentons les méthodes pour l'isolement de la protéine recombinante TERT Tribolium castaneum...

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Découvrez la préparation de tranches pulmonaires de précision chez la souris pour étudier la contractilité du muscle lisse dans un environnement proche du vivant. Cette méthode ex vivo permet d'analyser les mécanismes cellulaires des voies respiratoires.

Utilisation de la tranche pulmonaire coupée avec précision pour étudier la régulation contractile des voies respiratoires et du muscle lisse artériel intrapulmonaire (Vidéo) | JoVE Journal

Utilisation de la tranche pulmonaire coupée avec précision pour étudier la régulation contractile des voies respiratoires et du muscle lisse artériel intrapulmonaire

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