Développement de tests RT-qPCR multiplex en temps réel pour la détection du SRAS-CoV-2, de la grippe A/B et du MERS-CoV
10 novembre 2023
Nous présentons deux kits de RT-qPCR en une étape basés sur des sondes pour les virus respiratoires courants. Le premier test concerne le SRAS-CoV-2 (N), la grippe A (H1N1 et H3N2) et la grippe B. Le second concerne le SARS-Cov-2 (N) et le MERS (UpE et ORF1a). Ces tests peuvent être mis en œuvre avec succès dans n’importe quel laboratoire spécialisé.
L’objectif global de ce test est d’administrer une approche multiplex pour la détection simultanée de virus respiratoires couramment en circulation tels que le SRAS-CoV-2, le MERS, la grippe A et la grippe B.Les technologies dominantes à l’origine des progrès dans notre domaine comprennent CRISPR, les dosages aminés à flux latéral, les capteurs biomoléculaires sur papier, les tests Sherlock dans un pot, les aptamères d’ADN et la RT-qPCR multiplex intégrée à l’amplification isotherme médiée par boucle, LAMPE. Cependant, la RT-qPCR multiplex est la plus sensible, la plus courante et la référence pour diagnostiquer divers virus. Le défi expérimental actuel est d’établir un protocole qui puisse être utilisé pour détecter des copies d’ARN aussi faibles que 10 copies.
Nous avons utilisé un kit RT-qPCR interne pour le test, ce qui permet de gagner du temps et de l’argent. Pour commencer, préparez le tampon 2x pour la RT-qPCR dans de l’eau exempte d’ADN/ARN Conservez le tampon à moins 20 degrés Celsius jusqu’à nouvel ordre. Ensuite, mélangez les amorces et les sondes dans un tube de 1,5 millilitre.
Augmentez le volume avec un tampon d’élution, puis stockez le tube à moins 20 degrés Celsius. Préparez un mélange d’enzymes avec de la taq polymérase et du MMLV-RT dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace. Composez le volume avec le tampon de stockage de la taq polymérase.
Maintenant, mettez en suspension les ARN synthétiques viraux dans des tubes séparés avec 100 microlitres de tampon Tris-EDTA pour faire des stocks de 10 à six copies d’ARN par microlitre. Pour mélanger les stocks de virus, ajoutez cinq microlitres de SARS-CoV-2, de grippe A et B à 50 microlitres de tampon Tris-EDTA. De même, mélangez le SARS-CoV-2 et le MERS-CoV pour obtenir un second mélange viral.
Diluez les deux mélanges dix fois pour obtenir une dilution finale de 10 copies d’ARN par microlitre. À chaque puits d’une plaque de 96 puits, pipette 2x tampon, amorce, enzyme, eau exempte d’ADN/ARN et les mélanges d’ARN correspondants. Scellez la plaque avec un joint adhésif pour plaque d’étanchéité.
Ensuite, centrifugez la plaque pendant une minute pour recueillir le liquide au fond du puits. Ensuite, programmez la machine PCR pour qu’elle accepte le type de bloc rapide de 96 puits avec le type expérimental réglé sur la courbe standard. Réglez les réactifs sur les réactifs TaqMan et sélectionnez les propriétés d’exécution standard.
Définissez les cibles génétiques et le colorant rapporteur. Définissez ensuite les noms des échantillons pour chaque réaction à tester et attribuez des cibles et des échantillons à la disposition de la plaque. Entrez maintenant le programme de cycle dans l’instrument.
Transférez la plaque vers la machine QPCR en temps réel dans le bon sens et appuyez sur exécuter pour lancer le cycle. Choisissez l’emplacement du fichier pour enregistrer les données expérimentales. Examinez ensuite les tracés d’amplification fournis par le programme QPCR.
Les deux kits développés ont réussi à amplifier simultanément les trois gènes cibles, avec aussi peu que 10 copies d’ARN par réaction. Les efficacités d’amplification pour tous les titrages viraux étaient supérieures à 99 %
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Aperçu
Cette étude présente le développement de deux kits basés sur des sondes et utilisant une RT-qPCR en une étape, conçus pour la détection simultanée de virus respiratoires courants, notamment le SARS-CoV-2, le MERS et diverses souches de grippe. Ces kits améliorent les capacités diagnostiques des laboratoires spécialisés grâce à une approche économique et rapide.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Détection des virus respiratoires
- Technique de RT-qPCR
- Développement de tests multiplexes
Contexte
- La nécessité d'un diagnostic rapide et sensible des virus respiratoires.
- Les limites des technologies de détection actuelles.
- L'importance d'une approche multiplexe pour la détection simultanée.
Méthodes utilisées
- Kits RT-qPCR développés en interne
- Détection d'ARN viral
- RT-qPCR multiplexe combinée à des sondes spécifiques
Résultats principaux
- Détection réussie du SARS-CoV-2 et du MERS aux côtés de la grippe A et B.
- Amplification obtenue à partir de 10 copies d'ARN par réaction.
- Efficacités d'amplification élevées démontrées, supérieures à 99 %, pour les gènes ciblés.
Conclusions
- Les kits RT-qPCR développés sont efficaces pour la détection multiplexe des virus respiratoires.
- Cette étude contribue à de meilleures stratégies diagnostiques dans la recherche en virologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les tests de RT-qPCR multiplex en temps réel pour le SARS-CoV-2, la grippe A/B et le MERS-CoV répondent au besoin crucial de détection rapide, sensible et spécifique des virus respiratoires circulant simultanément, dans le cadre de recherches fondamentales et translationnelles. Ces tests permettent une différenciation fiable des cibles virales, soutiennent une validation solide des cibles et réduisent les ambiguïtés lors du développement précoce de diagnostics. Leur intégration améliore la confiance prédictive et l'efficacité opérationnelle dans l'ensemble des portefeuilles de recherche et développement axés sur les menaces de maladies infectieuses.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une interrogation précise des cibles virales pour la validation fonctionnelle dans les modèles de maladies respiratoires.
- Facilite la détection biologique des risques en distinguant les agents pathogènes viraux étroitement apparentés dans des échantillons complexes.
- Permet d’acquérir une confiance prédictive dans le choix et le triage des cibles pour les programmes diagnostiques et thérapeutiques.
Développement de tests et criblage
- Prépare des systèmes d'analyse multiplexes validés pour le criblage en aval de composés antiviraux ou de diagnostics.
- Fournit des résultats standardisés, reproductibles et quantitatifs pour l'évaluation comparative et l'optimisation des tests.
- Permet une préparation au criblage à haut débit et évolutif pour une évaluation rapide d'interventions candidates.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les stratégies translationnelles de biomarqueurs en permettant la détection simultanée de multiples virus respiratoires.
- Assure une continuité du stade de découverte à la validation préclinique en fournissant une détection virale robuste et quantitative.
- Réduit les risques lors du développement de candidats en garantissant une identification précise des agents pathogènes dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Les tests RT-qPCR multiplex s'inscrivent dans la continuité découverte-préclinique, soutenant les premiers tests d'hypothèses, le développement d'essais et la recherche translationnelle pour les portefeuilles de maladies infectieuses.
- Découverte en biologie : Fournit une détection à haute sensibilité pour la validation ciblée de virus dans un cadre hypothético-déductif.
- Écrantage : Offre des résultats quantitatifs reproductibles pour la normalisation des tests et l'évaluation de composés.
- Analytique : Fournit des données solides d'amplification et des indicateurs de spécificité destinés à l'analyse comparative.
- Recherche translationnelle : Permet l'alignement des biomarqueurs et assure la continuité entre les différentes phases de recherche.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable et adaptable pour la détection multiplexe de virus dans divers contextes de recherche et développement.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la détection virale.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation, la reproductibilité et l'extensibilité des flux de travail diagnostiques.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » et l'efficacité du capital en permettant une différenciation précoce et précise des agents pathogènes.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement adaptés au risque des programmes de lutte contre les maladies infectieuses.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en virologie moléculaire et en conception d'essais de PCR quantitative.
- Suppose l'accès à un équipement de PCR en temps réel et à une infrastructure logicielle d'analyse.
- Exige une standardisation entre équipes pour la mise en place des essais, l'interprétation des données et le contrôle qualité.
- Pourrait nécessiter des adaptations selon les types d'échantillons ou les variants viraux émergents.
- Les performances dépendent de la spécificité des amorces/sondes et de la qualité de l'ARN, comme indiqué par la source.
