Développement de tests RT-qPCR multiplex en temps réel pour la détection du SRAS-CoV-2, de la grippe A/B et du MERS-CoV

L’objectif global de ce test est d’administrer une approche multiplex pour la détection simultanée de virus respiratoires couramment en circulation tels que le SRAS-CoV-2, le MERS, la grippe A et la grippe B.Les technologies dominantes à l’origine des progrès dans notre domaine comprennent CRISPR, les dosages aminés à flux latéral, les capteurs biomoléculaires sur papier, les tests Sherlock dans un pot, les aptamères d’ADN et la RT-qPCR multiplex intégrée à l’amplification isotherme médiée par boucle, LAMPE. Cependant, la RT-qPCR multiplex est la plus sensible, la plus courante et la référence pour diagnostiquer divers virus. Le défi expérimental actuel est d’établir un protocole qui puisse être utilisé pour détecter des copies d’ARN aussi faibles que 10 copies.

Nous avons utilisé un kit RT-qPCR interne pour le test, ce qui permet de gagner du temps et de l’argent. Pour commencer, préparez le tampon 2x pour la RT-qPCR dans de l’eau exempte d’ADN/ARN Conservez le tampon à moins 20 degrés Celsius jusqu’à nouvel ordre. Ensuite, mélangez les amorces et les sondes dans un tube de 1,5 millilitre.

Augmentez le volume avec un tampon d’élution, puis stockez le tube à moins 20 degrés Celsius. Préparez un mélange d’enzymes avec de la taq polymérase et du MMLV-RT dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace. Composez le volume avec le tampon de stockage de la taq polymérase.

Maintenant, mettez en suspension les ARN synthétiques viraux dans des tubes séparés avec 100 microlitres de tampon Tris-EDTA pour faire des stocks de 10 à six copies d’ARN par microlitre. Pour mélanger les stocks de virus, ajoutez cinq microlitres de SARS-CoV-2, de grippe A et B à 50 microlitres de tampon Tris-EDTA. De même, mélangez le SARS-CoV-2 et le MERS-CoV pour obtenir un second mélange viral.

Diluez les deux mélanges dix fois pour obtenir une dilution finale de 10 copies d’ARN par microlitre. À chaque puits d’une plaque de 96 puits, pipette 2x tampon, amorce, enzyme, eau exempte d’ADN/ARN et les mélanges d’ARN correspondants. Scellez la plaque avec un joint adhésif pour plaque d’étanchéité.

Ensuite, centrifugez la plaque pendant une minute pour recueillir le liquide au fond du puits. Ensuite, programmez la machine PCR pour qu’elle accepte le type de bloc rapide de 96 puits avec le type expérimental réglé sur la courbe standard. Réglez les réactifs sur les réactifs TaqMan et sélectionnez les propriétés d’exécution standard.

Définissez les cibles génétiques et le colorant rapporteur. Définissez ensuite les noms des échantillons pour chaque réaction à tester et attribuez des cibles et des échantillons à la disposition de la plaque. Entrez maintenant le programme de cycle dans l’instrument.

Transférez la plaque vers la machine QPCR en temps réel dans le bon sens et appuyez sur exécuter pour lancer le cycle. Choisissez l’emplacement du fichier pour enregistrer les données expérimentales. Examinez ensuite les tracés d’amplification fournis par le programme QPCR.

Les deux kits développés ont réussi à amplifier simultanément les trois gènes cibles, avec aussi peu que 10 copies d’ARN par réaction. Les efficacités d’amplification pour tous les titrages viraux étaient supérieures à 99 %