Name: Génération efficace de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) murin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Apprenez à produire efficacement des cellules CAR-T murines par transduction rétrovirale de lymphocytes T. Ce protocole standardisé améliore l'efficacité de transduction et permet l'étude des immunothérapies antitumorales dans des modèles syngéniques complets.

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Nous remercions L. Brockmann pour la relecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par NIH 1R01EB030352 et UL1 TR001873.

Toutes les procédures animales ont été effectuées avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (Université Columbia, protocoles AC-AABQ5551 et AC-AAAZ4470) en utilisant des souris femelles BALB/c ou CF57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines pesant entre 20 et 25 g. Les animaux ont été obtenus auprès d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Ce protocole est structuré autour des « jours post-activation » des lymphocytes T murins, et la production virale commence au jour -2. Le rétrovirus peut être stocké à -80 °C après la production initiale, et pour une utilisation future de ce protocole, on peut commencer par l’étape 2, l’isolement et l’activation des lymphocytes T au jour 0.
1. Production de vecteurs rétroviraux
NOTA : Les produits viraux ont été rendus défectueux en raison de la séparation des gènes d’emballage en deux plasmides distincts (voir le tableau des matériaux), ce qui réduit considérablement la probabilité d’événements de recombinaison et de production accidentelle de virus compétents pour la réplication.
<ol><li>Préparez les cellules Phoenix Eco un jour avant la transfection (procédure du jour -2).<ol><li>Plaquer environ 1 x 107 cellules dans une plaque de 15 cm traitée au TC ou dans un flacon de culture T150, en utilisant 30 mL de milieu de culture (milieu de culture Phoenix Eco, tel qu’indiqué dans le tableau 1).</li>
		<li>Incuber toute la nuit à 37 °C. Après 18 à 24 h, les cellules doivent être confluentes à environ 70 % et réparties uniformément pour assurer un rendement viral élevé sans prolifération. REMARQUE : Pour des résultats optimaux, utilisez des cellules à passage bas et faites-les passer la veille du placage pour la production virale. Ne laissez pas les cellules Phoenix Eco proliférer pendant la culture de routine.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer le mélange de transfection contenant les réactifs de lipofection et d’activation, le pCL-Eco (Gag/Pol) et le plasmide d’expression de pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) dans un milieu sérique réduit (voir le tableau des matériaux) (procédure du jour -1). REMARQUE : La co-transfection doit être effectuée dans un rapport de 1 :1 entre pMSCV et pCL-Eco.<ol><li>Préparer le tube A : Diluer 105 μL du réactif de transfection dans 3,75 mL de milieu sérique réduit par plaque de 15 cm et bien mélanger par vortex ou pipetage de haut en bas.</li>
		<li>Préparer le tube B : Diluer le plasmide d’expression du pMSCV (21 μg) et le pCL-Eco (21 μg) avec 90 μL de réactif activateur dans 3,75 mL de milieu sérique réduit par plaque de 15 cm. Bien mélanger en pipetant de haut en bas. REMARQUE : Si vous générez plusieurs produits viraux, mettez en place un mélange maître contenant pCL-Eco et le réactif enhancer.</li>
		<li>Ajouter le tube A au tube B et bien mélanger par pipetage. Incuber pendant 10 à 20 minutes à température ambiante, ce qui donne un volume total d’environ 7,5 ml.</li>
		<li>Retirez délicatement 10 mL de milieux de culture cellulaire de la ou des plaques Phoenix Eco et ajoutez tout le volume du mélange de transfection au milieu restant en inclinant la plaque et en pipetant goutte. Remettre les cellules dans un incubateur à 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Changer le milieu sur les cellules Phoenix Eco transfectées 16 à 20 h après la transfection (procédure du jour 0).<ol><li>Préchauffer le sérum et le milieu de lymphocytes T murins exempts de β-mercaptoéthanol (2-ME, voir le tableau des matériaux) (récolte virale mTCM, comme indiqué dans le tableau 1) à 37 °C à l’aide d’un bain d’eau ou de billes.</li>
		<li>Retirez délicatement le milieu de culture Phoenix Eco en inclinant la plaque et en plaçant l’embout de la pipette dans le coin inférieur, si possible à l’aide d’un aspirateur. Évitez de trop sécher les cellules.</li>
		<li>Ajouter délicatement le milieu de prélèvement mTCM-viral réchauffé sur le côté de la plaque inclinée en pipetant 30 ml au réglage le plus lent. Remettre les cellules dans un incubateur à 37 °C. REMARQUE : Cette étape peut provoquer le détachement des cellules Phoenix Eco de la plaque et réduire les titres viraux. Un milieu préchauffé et un pipetage doux minimiseront les perturbations.</li>
	</ol></li>
	<li>Prélever le surnageant viral 48 h après la transfection (procédure du jour 1).<ol><li>Récoltez le surnageant viral et filtrez-le à travers des filtres PVDF de 0,45 μm (voir le tableau des matériaux) pour éliminer les cellules et les débris. Aliquote et congeler le virus à -80 °C ou passer directement au jour 1 de l’étape 3 si vous utilisez un nouveau virus.</li>
		<li>Déterminer le titre viral (unités transductrices/mL) par cytométrie en flux, comme décrit précédemment9. Cette étape est facultative.<ol><li>Déterminer le titre viral par transduction à petite échelle de 1 x 105 lymphocytes T murins activés dans des plaques à 96 puits non traitées par culture tissulaire (TC), pré-enrobées de rétronectine (voir le tableau des matériaux) et chargées de trois dilutions en série de surnageant rétroviral dans un volume final de 100 μL de milieu de récolte mTCM-viral. REMARQUE : Voir les étapes 2 et 3 ci-dessous pour des instructions détaillées sur l’isolement, l’activation et la transduction des lymphocytes T.</li>
			<li>Déterminer l’expression de surface du CAR 4 à 5 jours après la transduction par cytométrie en flux.</li>
			<li>Calculer le titre viral selon la formule10 : (N x F x D)/V, où N est le nombre de cellules transduites, F est la fréquence des cellules CAR-positives, D est le facteur de dilution et V est le volume de transduction en mL pour obtenir des unités de transduction (TU)/mL. REMARQUE : Le titre viral peut diminuer lors de la congélation ou de la décongélation ; Par conséquent, le titre viral est idéalement déterminé sur le virus congelé puis décongelé.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolement des lymphocytes T murins
<ol><li>Isolez et activez les lymphocytes T murins (procédure du jour 0). REMARQUE : Ces étapes peuvent être effectuées à température ambiante (RT) ou à 4 °C et doivent être effectuées dans un environnement stérile.<ol><li>Prélever la ou les rates de la souche de souris d’intérêt (p. ex., Balb/c, C57BL/6) comme décrit précédemment11 et obtenir une suspension unicellulaire par dissociation mécanique.</li>
		<li>À l’aide de l’arrière d’une seringue stérile, écraser la rate à travers une crépine de 70 à 100 μm dans un tube conique de 50 ml.</li>
		<li>Après avoir mis la seringue de côté, laver la passoire avec 5 mL de tampon d’isolement des lymphocytes T (solution saline tamponnée au phosphate, PBS, complétée par du sérum de veau fœtal à 2 %).</li>
		<li>Répétez l’étape de brassage et lavez la passoire une fois de plus avec 5 mL de tampon d’isolement des lymphocytes T. Porter le volume final à 50 mL avec un tampon d’isolement des lymphocytes T.</li>
		<li>Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre manuel ou d’un compteur automatique de cellules en les diluant dans un rapport de 1 :20, puis en les mélangeant à 1 :1 avec du bleu de trypan.</li>
		<li>Granuler les cellules par centrifugation pendant 10 min à 450 x g, à 4 °C (ou RT), et remettre en suspension les spléenocytes à 1 x 108/mL si vous utilisez le kit d’isolement des lymphocytes T recommandé (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : Les spléenocytes peuvent être refilés à travers une crépine de 40 à 70 μm à ce stade pour éliminer les grumeaux.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolez les lymphocytes T CD3+ par sélection négative en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Après la séparation magnétique, transférez l’isolat dans un tube conique de 15 mL et effectuez une numération finale des cellules vivantes.</li>
	<li>Pelleter les lymphocytes T isolés par centrifugation pendant 10 min à 450 x g, à 4 °C (ou RT), et les remettre en suspension à 1 x 106/mL dans un milieu d’activation mTCM (Tableau 1).</li>
	<li>Activer les lymphocytes T en ajoutant des billes magnétiques monoclonales enrobées d’anticorps murins anti-CD3/anti-CD28 (voir le tableau des matériaux) dans un rapport de 25 μL/1 x 10 cellules T6 et de 100 U/mL d’IL-2.</li>
	<li>Placez les cellules dans un incubateur à 37 °C et laissez-les toute la nuit. REMARQUE : En raison de la petite taille des lymphocytes T, une numération des lymphocytes T vivants plus précise peut être obtenue en diluant dans un rapport de 1 :10-1 :20 et en mélangeant à 1 :1 avec du bleu de trypan pour le comptage manuel à l’aide d’un hémocytomètre. La pureté peut être déterminée par cytométrie en flux en colorant les cellules avec un anticorps αCD3 conjugué par fluorescence. Chaque rate produira entre 7 et 10 x 10 cellules T de6 en fonction de l’âge et de la souche de la souris.</li>
</ol>3. Transduction des lymphocytes T murins
<ol><li>Préparer les plaques pour la transduction (procédure du jour 0).<ol><li>Enduire au préalable des plaques stériles non traitées à 24 puits avec 0,5 mL de réactif activateur de transduction de la fibronectine humaine (voir le tableau des matériaux) à une concentration finale de 20 à 40 μg/mL en les diluant dans du PBS stérile et les conserver à 4 °C pendant la nuit. REMARQUE : Cette étape peut également être effectuée le jour 1 en enduisant les plaques à 24 puits non traitées avec le réactif de transduction et en les incubant à température ambiante pendant 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer la transduction des lymphocytes T (procédure du jour 1).<ol><li>Préparez la plaque pré-enduite pour la transduction. Retirer le réactif de transduction de chaque puits de la plaque pré-enrobée à 24 puits et bloquer avec un volume équivalent de PBS filtré stérile + 2 % d’albumine sérique bovine (BSA) (0,5 ml) pendant 30 min à RT.</li>
		<li>Laver une fois avec 0,5 à 1 ml de PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajouter 0,5 à 1 mL de rétrovirus pur de l’étape 1 ou dilué en fonction du titre viral dans chaque puits pré-enrobé et centrifuger pendant 90 min à 2 000 x g et 32 °C.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de lymphocytes T activés dans chaque puits chargé par le virus et centrifuger pendant 10 min à 450 x g et 32 °C. Remettre les cellules dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit.</li>
	<li>24 h après la transduction, retirer 1 à 1,5 mL de milieu de culture cellulaire et le remplacer par 1 à 1,5 mL de mTCM-complet et 10 ng/mL d’IL-7 et d’IL-15 humaines recombinantes (voir le tableau des matériaux). Remettre les cellules dans un incubateur à 37 °C (procédure du jour 2). REMARQUE : Lors de la culture ex vivo , 10 ng/mL de cytokines doivent être ajoutés à la culture toutes les 48 h, et les lymphocytes T ne doivent pas être dilués au-delà de 1 x 106/mL.</li>
	<li>48 h après la transduction, transférer les cellules de la plaque de transduction dans une nouvelle plaque à 24 ou 6 puits et remettre les cellules dans un incubateur à 37 °C (procédure du jour 3). REMARQUE : La viabilité des lymphocytes T peut s’améliorer en transférant les cellules 24 h à 2 jours après la transduction, en fonction de la viabilité initiale des lymphocytes T et du titre viral.</li>
	<li>Dé-perlez les lymphocytes T et confirmez l’expression du CAR (procédure des jours 5 et 6).<ol><li>Remettre soigneusement les cellules en suspension pour dissocier les lymphocytes T activés des billes enrobées d’αCD3/CD28 (voir le tableau des matériaux) et placer la suspension cellulaire sur un aimant pendant 30 s. Transférez la suspension cellulaire dans le récipient de culture ex vivo souhaité et remettez-la dans un incubateur à 37 °C. REMARQUE : Les lymphocytes T peuvent être cultivés dans des flacons de culture ou des plaques de culture à puits profonds. Il est recommandé de plaquer un minimum de 5 x 10 cellulesT de 6 dans 30 mL de milieu mTCM-complet par puits dans un puits profond d’une plaque de format 6 puits (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Déterminer l’expression de CAR par cytométrie en flux8. NOTE : L’expression de GFP-CAR a été déterminée par incubation avec 100 ng/mL de GFP purifiée. L’incorporation d’un marqueur d’épitope N-terminal facilitera la détection de constructions CAR alternatives.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer une culture ex vivo de cellules CAR-T (procédure des jours 7 à 10).<ol><li>Lors de la culture ex vivo , maintenir les cellules en retirant 50 % du milieu de culture et en le remplaçant par du mTCM-complet frais + 2x 10 ng/mL d’IL-7 et d’IL-15 toutes les 48 h. REMARQUE : Les cellules CAR-T murines sont prêtes à être utilisées dans des applications en aval 7 jours après l’activation et ne doivent pas être cryoconservées en raison d’une mauvaise viabilité après la décongélation.</li>
	</ol></li>
</ol>

Protocole simplifié pour la génération de cellules CAR-T de souris dans des modèles syngéniques

<ol><li>June, C. H., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy.</a> N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).</li>
<li>Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+a+clinical+lens+to+animal+models+of+car-t+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).</li>
<li>Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+CAR-T+cells+through+the+solid-tumour+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).</li>
<li>Campesato, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+ahr+restricts+a+treg-macrophage+suppressive+axis+induced+by+l-kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine.</a> Nat Commun. 11 (1), 4011(2020).</li>
<li>Kaneda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pi3kgamma+is+a+molecular+switch+that+controls+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression.</a> Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).</li>
<li>Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paving+new+roads+for+cars%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paving new roads for cars.</a> Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).</li>
<li>Giavridis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell-induced+cytokine+release+syndrome+is+mediated+by+macrophages+and+abated+by+il-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade.</a> Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).</li>
<li>Lanitis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+gene+engineering+of+murine+CAR-T+cells+reveals+the+beneficial+effects+of+il-15+coexpression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression.</a> J Exp Med. 218 (2), e20192203(2021).</li>
<li>Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry-based+assay+for+titrating+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).</li>
<li>Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+crispr-engineered+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of human crispr-engineered CAR-T cells.</a> J Vis Exp. 169, e62299(2021).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Sterile+Tissue+Harvest%22">Sterile Tissue Harvest</a>. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Giordano-Attianese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computationally+designed+chimeric+antigen+receptor+provides+a+small-molecule+safety+switch+for+t-cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy.</a> Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).</li>
<li>Kuhn, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd40+ligand-modified+chimeric+antigen+receptor+T+cells+enhance+antitumor+function+by+eliciting+an+endogenous+antitumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response.</a> Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).</li>
<li>Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+expressing+a+bacterial+virulence+factor+trigger+potent+bystander+antitumour+responses+in+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers.</a> Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).</li>
<li>Kurachi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+retroviral+transduction+of+mouse+T+cells+for+in+vivo+assessment+of+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function.</a> Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).</li>
<li>Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+persistence+of+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+in+adoptive+cancer+immunotherapy%3A+Challenges+and+ways+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward.</a> Front Immunol. 11, 702(2020).</li>
<li>Elkassar, N., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+IL-7+biology+and+its+use+in+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunotoxicol%22%5BJournal%5D)">An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy.</a> J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).</li>
<li>Osinalde, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+dissection+and+comparison+of+IL-2+and+IL-15+signaling+pathways+by+global+quantitative+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics.</a> Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).</li>
<li>Eremenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+retroviral+transduction+of+mouse+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100719(2021).</li>
<li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+method+for+the+expansion+of+mouse+CD8%2B+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Ce protocole décrit les étapes et les réactifs nécessaires à la transduction rétrovirale des lymphocytes T murins afin de générer des lymphocytes CAR-T pour des études in vivo . L’optimisation des conditions de transduction rétrovirale permet d’obtenir une expression robuste de la CAR sans avoir besoin d’une concentration virale par ultracentrifugation ou réactifs supplémentaires. Cependant, il existe de multiples modifications qui peuvent être appliquées à cette méthodologie.
Bien que ce protocole décrive l’exemple de génération d’un CAR spécifique à la GFP, ces méthodes peuvent être adaptées pour générer des cellules CAR-T de souris ciblant n’importe quel antigène extracellulaire d’intérêt. Le vecteur rétroviral pMSCV_PGK utilisé dans cette étude permet la libération efficace de la séquence de nanocorps spécifique à la GFP par digestion enzymatique avec NotI et BamHI et peut être remplacé par un domaine de reconnaissance de l’antigène défini par l’utilisateur tel qu’un scFv, un nanocorps ou un domaine de liaison au ligand (Fichier supplémentaire 1). Pour faciliter l’évaluation de l’expression alternative de CAR, il est recommandé de concevoir des CAR avec un marqueur d’épitope N-terminal, tel que des marqueurs Myc (EQKLISEEDL) ou Flag (DYKDDDDK), qui peuvent être détectés à l’aide d’anticorps conjugués fluorescents12. De plus, la présente étude démontre la production d’un seul transgène ; cependant, l’incorporation de peptides auto-clivants (séquences 2A) ou de sites d’entrée internes des ribosomes (IRES) permettrait la coproduction de plusieurs transgènes, y compris des technologies supplémentaires pour améliorer la fonction des lymphocytes T in vivo 8,13,14.
Bien que ce protocole ait été élaboré pour éliminer le besoin d’équipement spécialisé en omettant l’ultracentrifugation (24 000 x g, 2 h, 4 °C), il convient de noter que la concentration du surnageant viral peut permettre d’obtenir des titres viraux plus élevés et de réduire le volume de virus nécessaire pour atteindre une expression élevée de CAR8. Ce protocole rationalise en outre la production de vecteurs rétroviraux en obtenant des titres viraux élevés reproductibles (~2 x 107 TU/mL) et une expression stable du CAR sans qu’il soit nécessaire de déterminer le titre viral avant utilisation. Cependant, en plus de faciliter la normalisation, la détermination du titre viral avant la transduction des lymphocytes T peut également augmenter la viabilité des lymphocytes T en réduisant la toxicité potentielle causée par des concentrations virales inutilement élevées10,15.
Une supplémentation en IL-7 et IL-15 est recommandée pour favoriser l’expansion des lymphocytes T et préserver les populations mémoires des lymphocytes T ; cependant, l’IL-2 humaine recombinante peut être utilisée comme alternative pour réduire le nombre de réactifs nécessaires à la culture ex vivo 16,17,18,19. Néanmoins, les méthodes de génération de cellules CAR-T décrites ici restent limitées par l’expansion relativement faible des cellules T murines. Cependant, les mesures visant à améliorer la viabilité des lymphocytes T discutées ci-dessus pourraient être encore améliorées en incluant des suppléments supplémentaires et du 2-ME dans le milieu de culture mTCM tout au long du processus de transduction20. Bien que ces modifications puissent améliorer l’expansion des lymphocytes T de 15 fois à 20 fois20, elles peuvent entraîner une efficacité de transduction plus faible et une expression réduite du CAR.
En fin de compte, la production de cellules CAR-T murines permet le développement de modèles syngéniques pour évaluer la fonction des cellules CAR-T au sein d’un système immunitaire intact, ce qui facilite une évaluation contextuelle de leur puissance, de leur durabilité et de leur sécurité. Alors que les modèles chez les souris immunodéficientes permettent d’importantes études précliniques d’un produit de lymphocyte T humain ciblant un antigène tumoral humain. La combinaison de ces systèmes modèles complémentaires sera indispensable pour comprendre la complexité de la biologie cellulaire CAR-T, optimiser de nouvelles conceptions CAR et, en fin de compte, traduire les résultats précliniques en thérapies cliniques efficaces.

Les thérapies adoptives à base de lymphocytes T exprimant des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) ont révolutionné le domaine de l’immunothérapie du cancer en exploitant la puissance du système immunitaire adaptatif pour cibler et éliminer spécifiquement les cellules cancéreuses antigéniques positives1. Bien que le succès des thérapies cellulaires CAR-T ciblant les tumeurs malignes à cellules B ait été validé cliniquement, les études précliniques réalisées sur des modèles animaux restent vitales pour le développement de nouvelles thérapies CAR-T ciblant les tumeurs solides. Cependant, une efficacité clinique limitée a été démontrée jusqu’à présent dans les indications de tumeurs solides, et il devient de plus en plus évident que les modèles précliniques individuels ne prédisent pas avec précision la pharmacodynamie et l’efficacité clinique d’un médicament vivant 2,3. Par conséquent, les chercheurs ont commencé à élargir l’étude préclinique des produits cellulaires CAR-T pour inclure des évaluations parallèles dans des modèles xénogreffiques et syngéniques de cancers humains et murins, respectivement.
Contrairement aux modèles de xénogreffe, où les tumeurs humaines et les lymphocytes T sont greffés dans des souris immunodéficientes, les modèles syngéniques permettent d’examiner les réponses des cellules CAR-T dans le contexte d’un système immunitaire fonctionnel. Plus précisément, les souris immunocompétentes porteuses de tumeurs syngéniques fournissent un système permettant d’étudier l’interaction entre les lymphocytes T transférés par adoption et les milieux spécifiques au contexte, y compris les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) connus pour supprimer la fonction des lymphocytes T dans le microenvironnement tumoral (ETM4,5,6). De plus, les modèles syngéniques offrent une plate-forme supplémentaire pour évaluer la toxicité sur cible, hors tumeur, et l’interaction des cellules CAR-T avec les facteurs de l’hôte qui peuvent conduire à des toxicités supplémentaires, y compris le syndrome de libération de cytokines7.
Malgré ces avantages, le nombre d’études sur les cellules CAR-T syngéniques reste limité. Notamment, les modèles syngéniques nécessitent l’ingénierie autologue de cellules CAR-T de la même souche de souris et présentent donc un défi supplémentaire en raison de l’absence de méthodologie pour une transduction efficace des cellules T murines et une expansion ex vivo 2,8. Ce protocole décrit les méthodes permettant d’obtenir une expression stable de CAR grâce à la production de vecteurs rétroviraux et à l’optimisation de la transduction des lymphocytes T. Un schéma de l’ensemble du processus est présenté à la figure 1. L’utilisation de cette approche démontre l’efficacité de la transduction rétrovirale des cellules CAR-T murines et l’obtention d’une expression élevée de CAR sans avoir besoin d’une concentration virale par ultracentrifugation. Des stratégies visant à modifier la spécificité antigénique de la construction CAR sont discutées en plus de la co-expression de transgènes supplémentaires.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu ; m filters</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLHVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 1 mL&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>05-408-135</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 mL</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu ; m passoire</td><td>Corning</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Boîtes de culture cellulaire traitées TC</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>130183</tr><tr><td>tubes coniques de 15 mL</td><td>Faucon</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu ; crépine M&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 mL</td><td>Faucon</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; m passoire</td><td>Corning</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Cytomètre en flux&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C, 6-8 semaines&nbsp ;</td><td>Jackson Laboratory</td><td>651</td><td></td></tr><tr><td>B-Mercaptoéthanol&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>GOLDBIO</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Saline tamponnée au phosphate (PBS), sans calcium ni magnésium.</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Aimant&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>12-321-D</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Aimant&nbsp ;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit d’isolement des lymphocytes T de souris</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19851</td><td></td></tr><tr><td>Tampon FACS&nbsp ;</td><td>BD</td><td>BDB554657</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>G-REX6</td><td>Wilson Wolf</td><td>80240M&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon HEPES&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>IL-15 humaine recombinante&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-765</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 recombinante humaine</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-748</td><td></td></tr><tr><td>IL-7 recombinante humaine</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-363</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-CD3 BV421</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-CD3/CD28 Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11-453-D</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-CD4 BV605</td><td>BD</td><td>563151</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-CD44 APC&nbsp ;</td><td>Souris Biolegend</td><td>103011</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD62L PE-Cy7</td><td>Tonbo</td><td>SKU 60-0621-U025</td><td></td></tr><tr><td>Souris Anti-CD8 APC-Cy7</td><td>Tonbo</td><td>SKU 25-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti2 avec appareil photo Prime 95B&nbsp ;</td><td>Plaques Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>non traitées à 24 puits&nbsp ;</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7524</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31-985-062</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>#12371</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine Solution</td><td>Gibco</td><td>15-070-063</td><td></td></tr><tr><td>Phoenix Eco cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>pMDG.2</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV_PGK_GFP28z</td><td>N/A</td><td>Produit par R.LV.</td><td></td></tr><tr><td>SfGFP N</td><td>/A</td><td>purifié Produit par R.LV.</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin ('réactif de transduction')</td><td>Takara Bio</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 10 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 25 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 5 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11-360-070</td><td></td></tr><tr><td>TC 24 plaques de puits</td><td>Corning</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan bleu&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

génération efficace de lymphocytes t à récepteur antigénique chimérique (car) murin

Efficient Generation of Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T Cells

Les thérapies cellulaires modifiées utilisant des cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR)-T ont atteint une efficacité remarquable chez les personnes atteintes d’hémopathies malignes et sont actuellement en cours de développement pour le traitement de diverses tumeurs solides. Jusqu’à présent, l’évaluation préliminaire de nouveaux produits cellulaires CAR-T a principalement eu lieu dans des modèles tumoraux de xénogreffe utilisant des souris immunodéficientes. Cette approche est choisie pour faciliter la prise de greffe réussie de cellules CAR-T humaines dans le cadre expérimental. Cependant, les modèles murins syngéniques, dans lesquels les tumeurs et les cellules CAR-T sont dérivées de la même souche de souris, permettent d’évaluer les nouvelles technologies CAR dans le contexte d’un système immunitaire fonctionnel et d’un microenvironnement tumoral complet (TME). Le protocole décrit ici vise à rationaliser le processus de génération de cellules CAR-T chez la souris en présentant des méthodes standardisées pour la transduction rétrovirale et la culture ex vivo de cellules T. Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres constructions de CAR au-delà de celles utilisées dans cette étude pour permettre l’évaluation de routine de nouvelles technologies de CAR dans les systèmes immunocompétents.

Le protocole décrit ici vise à standardiser le processus de transduction des lymphocytes T murins pour la génération de cellules CAR-T de souris. La figure 1 fournit une description détaillée des étapes à suivre. Le processus commence par la production de vecteurs rétroviraux par co-transfection de composants viraux dans des cellules Phoenix Eco. La figure 2 fournit une image de la densité optimale des cellules Phoenix Eco le jour de la transfection. Les lymphocytes T isolés sont ensuite activés 24 h après la transfection, ou « Jour 0 » de ce protocole, en préparation de la transduction le Jour 1. Après transduction, les cellules CAR-T sont cultivées en présence d’IL-7 et d’IL-15 humaines recombinantes afin d’obtenir une expansion de pli suffisante tout en préservant les populations mémoires de cellules souches.
L’utilisation du kit d’isolement des lymphocytes T murins recommandé (voir le tableau des matériaux) avec ce protocole permet d’obtenir des puretés des lymphocytes T de &lt;98 % avant la transduction, telles que déterminées par cytométrie en flux (Figure 3A). De plus, des taux d’expression reproductibles de CAR de 65 % à 75 % peuvent être obtenus en utilisant ce protocole et le vecteur rétroviral pMSCV modifié pour exprimer la construction CAR à partir d’un promoteur PGK (Figure 3B,C). La détermination du titre rétroviral révèle des titres allant jusqu’à ~2 x 107 TU/mL et une expression de CAR de 74 % avec 1/3du surnageant viral récolté après co-transfection du pMSCV avec le pCL-Eco (Figure supplémentaire 1).
Enfin, la culture ex vivo avec 10 ng/mL d’IL-7 et d’IL-15 conduit à une expansion d’environ 15 fois, ce qui donne ~150 x 10 cellulesT 6 au jour 10 après l’activation à partir d’une seule rate (Figure 3D). La culture avec l’IL-7 et l’IL-15 conduit à des fréquences comparables des lymphocytes T CD8+ et CD4+ (Figure 3E) et à des populations mémoire de cellules souches préservées déterminées par l’expression de CD62L+CD44- après 10 jours de culture ex vivo (Figure 3F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole. Panneau supérieur : une vue d’ensemble schématique de la chronologie du protocole. Panneau inférieur : Instructions étape par étape pour la production de vecteurs rétroviraux et la transduction des lymphocytes T de souris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig02.jpg"> Figure 2 : Densité cellulaire optimale pour la transfection. Image microscopique à fond clair des cellules Phoenix Eco à la densité optimale avant transfection avec pMSCV et pCL-Eco. Capturé à l’aide d’un objectif 10x. Barre d’échelle = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65887/65887fig03.jpg"> Figure 3 : Production de cellules CAR-T murines et culture ex vivo. (A) Diagramme de cytométrie en flux montrant la fréquence des cellules BALB/c CD3+ après l’isolement des lymphocytes T murins. (B) Représentation schématique du vecteur rétroviral pMSCV utilisé pour l’expression de la GFP-CAR dans les lymphocytes T murins. (C) Histogrammes de cytométrie en flux démontrant l’expression de surface de CAR sur les lymphocytes T de souris après incubation avec de la sfGFP purifiée. UT, non transduit. (D) Expansion du pli des cellules CAR-T au jour 10 après l’activation et culture avec de l’IL-17 et de l’IL-15 humaines recombinantes. Environ 8 x 106 lymphocytes T murins ont été activés avant la transduction et ont atteint environ 1,28 x 108 au jour 10 après l’activation. (E) Diagramme de cytométrie en flux montrant la fréquence des cellules CAR-T CD8+ et CD4+ au jour 10 après l’activation. (F) Diagramme de cytométrie en flux démontrant la fréquence des populations mémoires de lymphocytes T CD8+ déterminée par l’expression de surface de CD62L et CD44. La mémoire des cellules souches (TSCM) est caractérisée par CD62L+CD44-, la mémoire centrale (MTC) par CD62L+CD44+ et la mémoire effectrice (MET) par CD62L-CD44+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Formulation des milieux de culture cellulaire. Les détails de la formulation des milieux de culture cellulaire utilisés dans le protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/65887_Table%201.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Figure supplémentaire 1 : Expression de surface du CAR et titres rétroviraux. (A) Histogrammes de cytométrie en flux montrant l’expression de surface de CAR sur les lymphocytes T BALB/c après incubation avec sfGFP purifié. Le rétrovirus a été généré par transfection de cellules Phoenix Eco avec pMSCV_PGK_mGFP28z en combinaison avec pCL-Eco et pMD2.G (I), pCL-Eco (II) ou seul (III). Les lymphocytes T ont été transduits avec un rétrovirus dilué comme indiqué. (B) Titres rétroviraux déterminés par l’expression de surface CAR des lymphocytes T transduits. Les unités de transduction (TU)/mL ont été calculées à l’aide de la formule : (N∙F∙D)/V, où N est le nombre de cellules transduites (1 x 105), F est la fréquence des cellules CAR+ , D est le facteur de dilution et V est le volume de transduction en mL (0,2 mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 1 : séquence vectorielle d’expression pMSCV. La séquence du CAR GFP28z et les séquences flanquantes (en italique) dans le vecteur d’expression pMSCV, avec les sites enzymatiques NotI et BamHI surlignés en bleu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65887/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Ce protocole rationalise la production de vecteurs rétroviraux et la transduction des lymphocytes T murins, facilitant ainsi la génération efficace de cellules CAR-T chez la souris.

Génération efficace de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) murin

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