Coupe automatisée par vibratome de tissu pulmonaire enrobé d’agarose pour l’imagerie par fluorescence multiplex
6 octobre 2023
Nous avons mis au point une technique de traitement tissulaire utilisant un vibratome et du tissu pulmonaire enrobé d’agarose pour générer des coupes pulmonaires, permettant ainsi l’acquisition d’images à haute résolution de l’architecture pulmonaire. Nous avons utilisé la coloration par immunofluorescence pour observer l’expression spatiale des protéines à l’aide de marqueurs structurels pulmonaires spécifiques.
Ce protocole est particulièrement utile dans les grands modèles animaux de transplantation et de régénération pulmonaires, tels que les porcs, où nous pouvons échantillonner de petits morceaux au fil du temps. Cette technique peut nous aider à mieux comprendre la biologie spatiale en jeu dans ces modèles. Cette technique permet d’obtenir des coupes pulmonaires peu traitées adaptées à l’imagerie par immunofluorescence sans qu’il soit nécessaire de prélever l’antigène, et s’est avérée efficace avec tous les anticorps testés à ce jour.
Cette procédure peut être adaptée pour couper des sections légèrement plus épaisses, disons environ un millimètre, qui peuvent ensuite être utilisées en microscopie à fluorescence sur feuille de lumière pour étudier l’expression spatiale des protéines dans un volume plus tridimensionnel. Notre recherche porte sur les facteurs influençant le rejet d’une greffe de poumon et sur le développement de thérapies pour réduire le rejet à l’aide de notre modèle porcin. Cette technique permet de comprendre les changements spatiaux des protéines affectant les résultats de la greffe après la chirurgie.
Nous utilisons actuellement cette technique pour explorer le paysage spatial de l’expression des protéines dans notre modèle de greffe de poumon de porc. Nous espérons qu’il nous aidera à mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent nos thérapies expérimentales. La clé du succès réside dans les observations de vibratomes, les amplitudes de pale élevées et les vitesses de force plus faibles sont des éléments clés à prendre en compte si la section se passe mal.
Aperçu
Cette étude présente une technique innovante de traitement des tissus utilisant un vibratome et un tissu pulmonaire inclus dans de l'agarose afin de produire des sections pulmonaires de haute résolution. La méthode permet la coloration en immunofluorescence pour observer l'expression spatiale des protéines dans l'architecture pulmonaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Transplantation pulmonaire
Contexte
- Comprendre la biologie spatiale dans les modèles pulmonaires est essentiel pour l'étude de la transplantation pulmonaire.
- La technique produit des tranches pulmonaires peu manipulées, adaptées à l'imagerie.
- Elle s'est révélée efficace avec divers anticorps, sans nécessiter de récupération d'antigène.
- Adaptable à des sections plus épaisses pour des techniques d'imagerie avancées.
Objectif de l'étude
- Étudier les facteurs influençant le rejet de la greffe pulmonaire.
- Développer des thérapies visant à réduire le rejet après greffe pulmonaire.
- Explorer l'expression spatiale des protéines dans un modèle porcin de greffe pulmonaire.
Méthodes utilisées
- Inclusion du tissu pulmonaire dans l'agarose pour la sectionnement.
- Utilisation d'un vibratome pour créer des tranches de poumon d'une épaisseur définie.
- Coloration par immunofluorescence pour visualiser l'expression protéique.
- Analyse comparative de la distribution des pneumocytes de type deux dans des échantillons humains.
Résultats principaux
- Génération réussie de coupes pulmonaires de haute résolution.
- Identification de modifications spatiales des protéines affectant les résultats de la greffe.
- Nombre plus élevé de pneumocytes de type II et couverture du support plus importante dans les échantillons infantiles par rapport aux adultes.
- Utilisation efficace de la technique sur différents échantillons de tissu pulmonaire.
Conclusions
- La technique du vibratome améliore la compréhension de l'architecture pulmonaire.
- Elle fournit des informations sur l'expression spatiale des protéines, pertinente pour la biologie de la transplantation.
- Cette méthode pourrait faciliter les recherches futures en transplantation et régénération pulmonaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La sectionnement automatisé au vibratome de tissu pulmonaire inclus dans de l'agarose permet d'obtenir des coupes pulmonaires reproductibles et peu modifiées, adaptées à l'imagerie de fluorescence multiplexe chez différentes espèces. Ce protocole répond au défi de la préservation de l'architecture pulmonaire native et de l'antigénicité, et soutient une analyse spatiale protéique riche en contenu, essentielle pour la recherche translationnelle sur le poumon. Cette approche améliore la fiabilité prédictive des modèles pulmonaires précliniques et éclaire les études mécanistiques des lésions, de la régénération et des résultats de transplantation.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'analyse de l'expression spatiale des protéines dans le tissu pulmonaire natif pour une détection mécanistique des risques.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en préservant l'antigénicité sans récupération d'antigène.
- Facilite les études comparatives entre échantillons de souris, de porc et d'humain afin d'obtenir une confiance inter-espèces dans les cibles.
Développement de tests et criblage
- Fournit des tranches pulmonaires standardisées et reproductibles, adaptées à des dosages d'immunofluorescence multiplex.
- Permet d'obtenir des données quantitatives spatiales sur la localisation et l'abondance des protéines.
- Permet une évolutivité des dosages et une réutilisation de la plateforme pour la validation et le criblage d'anticorps.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour la maladie, notamment la transplantation pulmonaire et les lésions chez les grands animaux.
- Permet la découverte de biomarqueurs translationnels en permettant une cartographie spatiale à haute résolution des modifications des protéines.
- Facilite le développement ciblé de thérapies expérimentales grâce à une compréhension mécanistique du remodelage tissulaire et du rejet.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'intègre dès la phase de découverte précoce jusqu'à la validation préclinique, en soutenant les flux de travail dans la recherche sur les lésions pulmonaires, la régénération et la transplantation.
- Biologie de la découverte : Permet d'approfondir la vérification d'hypothèses sur la dynamique spatiale des protéines dans l'architecture pulmonaire intacte.
- Évaluation : Fournit des résultats d'imagerie reproductibles et quantitatifs pour l'analyse d'anticorps et de biomarqueurs.
- Analytique : Autorise la comparaison statistique de la distribution des protéines et de l'abondance des types cellulaires selon différentes conditions et stades de développement.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes précliniques obtenues sur des modèles animaux à l'analyse de tissus humains afin d'harmoniser les biomarqueurs.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme de traitement des tissus et d'imagerie réutilisable, adaptable à plusieurs programmes de recherche pulmonaire.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études sur les tissus pulmonaires.
- Valeur opérationnelle : Standardise le traitement et l'imagerie des tissus pour assurer la reproductibilité et la reproductibilité à grande échelle entre les projets.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en permettant une analyse spatiale robuste des protéines dans les modèles translationnels.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des thérapies ciblant le poumon et des programmes de biomarqueurs.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en utilisation du vibratome et en imagerie d'immunofluorescence.
- Exige un accès à un vibratome et à une microscopie à fluorescence multiplexe.
- Implique une standardisation inter-équipes des protocoles de coupe et de marquage pour assurer la reproductibilité.
- Adaptable à divers modèles pulmonaires, mais peut nécessiter une optimisation en fonction de l'épaisseur du tissu et de la compatibilité des anticorps.
- Les paramètres de coupe et la manipulation du tissu doivent être rigoureusement contrôlés afin de préserver la structure native et l'antigénicité.
