Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires

L’objectif global de ce test de métastases pulmonaires est de visualiser et d’étudier directement la croissance des cellules d’ostéosarcome métastatique dans le tissu pulmonaire viable. Cette méthode peut aider à répondre à des questions vraiment clés dans le domaine des métastases de l’ostéosarcome. Par exemple, comment les cellules métastatiques de l’ostéosarcome s’adaptent, survivent et prolifèrent dans le microenvironnement pulmonaire.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une visualisation directe de la croissance cellulaire d’un ostéosarcome métastatique dans un micro-environnement tridimensionnel pertinent. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, en raison des étapes techniquement difficiles de la canulation de la trachée et de l’insufflation du poumon. L’injection de cellules tumorales dans la veine caudale et l’euthanasie chez la souris sont effectuées conformément aux directives institutionnelles standard.

Après cinq minutes, placez la souris euthanasiée en décubitus dorsal sur un coussinet stérile dans une hotte à flux laminaire, et utilisez de petits ciseaux stériles pour disséquer soigneusement le sternum, au-delà de l’entrée thoracique des deux côtés de la trachée, sans perforer les poumons. La dissection de tout le muscle et du tissu conjonctif entourant la trachée est essentielle pour une canulation réussie. Ensuite, utilisez un cathéter IV de calibre 20 pour canuler soigneusement la trachée et utilisez une suture stérile pour fixer lâchement le cathéter et la trachée.

Fixez un ensemble d’extension IV du cathéter à la seringue de 10 millilitres d’un appareil de profusion par gravité et versez de l’agarose liquide à 37 degrés Celsius mélangée à une solution moyenne dans la seringue. Remplissez les poumons avec la solution d’agarose jusqu’à ce qu’ils soient complètement insufflés. Retirez ensuite la canule et attachez fermement la suture pour éviter les fuites de la solution d’agarose.

Il est important de garder le poumon intact pendant l’insufflation. Une bonne insufflation d’agarose et un refroidissement ultérieur de la plume maintiendront le poumon dans un état d’expansion. Récoltez l’épilation, la trachée, le cœur et le poumon, en prenant soin de ne pas perforer ou endommager la surface du poumon.

Placez les tissus dans 30 millilitres de PBS pré-refroidi complété par des antibiotiques, et laissez l’agarose se solidifier. Placez le plumage sur de la glace pendant 20 minutes. Après 20 minutes, utilisez des ciseaux fins et une pince à épiler pour couper le poumon en morceaux de 3 x 1,5 millimètre, et placez les tranches dans des puits individuels d’une plaque à 6 puits contenant 2 éponges de gélatine de 2 x 2 centimètres pré-trempées dans B medium.

Le jour de l’imagerie, transférez soigneusement les tranches pulmonaires de la plaque à 6 puits dans une boîte ronde stérile à fond de verre de 35 millimètres en colonnes selon leur groupe expérimental. Ensuite, sur un microscope à fluorescence à grand champ, sélectionnez l’objectif 2,5x et réglez les paramètres d’imagerie pour fournir le meilleur contraste entre les cellules tumorales fluorescentes et le tissu de fond non fluorescent dans le groupe d’échantillons de tissu témoin. Imagez l’ensemble des échantillons en utilisant les mêmes paramètres que pour les tissus témoins.

Si le logiciel n’est pas calibré à l’échelle, imagez un micromètre en utilisant le même objectif que le tissu pulmonaire afin d’obtenir une référence d’échelle, et enregistrez toutes les images sous forme de fichiers tif. Lorsque toutes les images ont été obtenues, pour analyser les images dans ImageJ, ouvrez le premier fichier. Utilisez l’outil de sélection de polygones pour délimiter la tranche entière du poumon afin de déterminer l’aire de la tranche totale du poumon.

Sélectionnez le processus et soustrayez l’arrière-plan. Réglez le rayon de la balle roulante sur une valeur de départ de 50 pixels. Cette valeur dépendra du degré de fluorescence de fond et doit être optimisée pour chaque ensemble de données.

Assurez-vous de décocher l’arrière-plan clair. Sélectionnez l’image et le type, 8 bits, puis l’image et les propriétés, entrez pixels. Sous l’unité de longueur, entrez 1 pour la largeur en pixels, la hauteur en pixels et la profondeur du voxel.

Ensuite, cochez global pour appliquer ces paramètres à toutes les images suivantes. Ensuite, sélectionnez l’image, puis ajustez, puis seuil. Mettez en surbrillance par défaut et en noir et blanc, et utilisez le curseur pour seuiller l’image afin que la majorité des cellules tumorales soient mises en évidence avec précision.

Cliquez une fois sur appliquer pour rendre le poumon noir et les lésions fluorescentes blanches. Ensuite, cliquez une deuxième fois sur appliquer pour inverser l’image afin que toutes les structures fluorescentes deviennent noires. Pour quantifier le nombre et la forme des lésions, sélectionnez analyser et définir les mesures, puis cochez la zone.

Décochez toutes les autres cases. Ensuite, sélectionnez analyser les particules et dans le champ taille, utilisez la zone de la plus petite lésion déterminée comme étant une seule cellule par ImageJ, pour définir la plage de formes que le programme énumérera. Utilisez une image du groupe de véhicules du jour zéro pour choisir la plus petite zone considérée comme une seule cellule tumorale.

Une fois la limite inférieure définie, cliquez sur OK. Une fenêtre de résultats s’affichera contenant toutes les formes énumérées et les mesures de surface. Ensuite, copiez et collez les données de la fenêtre des résultats dans une feuille de calcul et utilisez la fonction mathématique de somme pour ajouter toutes les zones des lésions métastatiques pour cette tranche pulmonaire particulière.

Les propensions métastatiques pour les lignées cellulaires métastatiques élevées et faibles sont visuellement apparentes sur des points temporels progressifs. Plus précisément, ces images de microscopie montrent comment les cellules hautement métastatiques sont capables de coloniser le poumon plus efficacement que les lignées cellulaires faiblement métastatiques. L’analyse d’image, la quantification et l’analyse statistique des données d’image confirment que les cellules tumorales hautement métastatiques peuvent coloniser efficacement le tissu pulmonaire.

Alors que les cellules métastatiques basses ne peuvent pas se développer du tout. La microscopie confocale à fluorescence à fort grossissement permet de visualiser les cellules du parenchyme pulmonaire avec un grand détail spatial par rapport aux cellules tumorales exprimant l’EGFP. Ainsi que facilite l’analyse des structures subcellulaires, telles que ces mitochondries.

Selon le nombre de souris utilisées, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler avec du matériel chirurgical propre et stérile. Après son développement, la technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur le cancer pour explorer la progression des métastases dans les poumons de souris.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que des tests de culture cellulaire in vitro et le western blot, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur les effets de l’inhibition génique ou du traitement médicamenteux sur les cellules cancéreuses. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test de métastases pulmonaires. N’oubliez pas que travailler avec des cellules cancéreuses humaines peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail dans un laboratoire de sécurité biologique doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.