Name: Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Découvrez le protocole PuMA pour visualiser la croissance des cellules d'ostéosarcome métastatique dans le tissu pulmonaire. Cette méthode permet d'étudier l'adaptation et la prolifération cellulaire en trois dimensions.

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Nous tenons à remercier le Dr Arnulfo Mendoza qui a dispensé une formation à la technique de PuMA. En outre, nous tenons à remercier les Drs Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) et Sam Aparicio (BC Cancer Agency) permettant l’utilisation de leurs microscopes au cours de cette étude. Cette recherche a été financée (en partie) par le programme de recherche intra-muros de la National Institutes of Health, centre de recherche sur le Cancer, service d’oncologie pédiatrique. M.M.L. a été soutenu par le National Institutes of Health intra-muros visitant Fellow Program (prix 15335) et est actuellement soutenue par une bourse de Parker de Joan dans la recherche de métastases. P.H.S. est pris en charge par la British Columbia Cancer Foundation.

Tous les protocoles d’animaux d'où proviennent les données d’imagerie ont été effectués avec l’approbation de l’animalier et du Comité d’urbanisme de l’Institut National du Cancer, de la National Institutes of Health. Tous les protocoles animales examiné et décrit dans l’article vidéo ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de l’Université de la Colombie-Britannique.
1. préparation des cellules tumorales pour injection et matériaux pour le modèle de PuMA
Remarque : La quantité de cellules et de la solutions sera suffisant pour 1 souris. Intensifier selon les besoins si plus de souris sont utilisées dans l’étude. Pour les recettes des médias, se reporter au tableau 1 et tableau 2.
<ol><li>Réchauffez 5 mL de A-Media dans un tube conique de 15 mL dans un bain-marie à 37 oC.</li>
	<li>Faire fondre la 1,2 % basse fusion agarose solution (dans de l’eau stérile) utilisant le micro-ondes de laboratoire.</li>
	<li>Transférer 5 mL de l’agarose fondu dans un tube conique de 15 mL et garder au chaud dans un bain-marie à 37 oC. Assurez-vous que l’agarose fondu est à 37 oC et liquide avant l’étape d’insufflation pulmonaire.</li>
	<li>Pré refroidissement éolien 30 mL de grade de culture cellulaire PBS additionné de 1 X stylo/strep dans un bac à glaçons.</li>
	<li>Dans un puits d’une plaque 6 puits, pré-tremper une éponge de gélatine dans 1,5 mL de B-médias. L’éponge sera le point d’ancrage de soutien pour les tranches de poumon.</li>
	<li>S’assurer que les cellules d’OS sont environ 70-90 % confluentes sur le jour de l’intervention. Ne pas utiliser de cellules qui sont trop anastomosé ou si le support est orange à jaune car les cellules sont habituellement stressées et ont diminué de viabilité à ce stade. Pour les lignées cellulaires d’ostéosarcome, MNNG et HOS, 5 x 10,5 , dans un volume de 100 μL serviront à injecter dans la veine caudale de 1 souris. Haut de gamme en conséquence si plus de souris sont utilisées pour l’étude.</li>
	<li>Récolter les cellules tumorales à l’aide de 0,25 % de trypsine-EDTA (3 mL pour une fiole T75 ou 2 mL dans une boîte de Petri de 10 cm). Lorsque les cellules commencent à décoller de la plaque, neutraliser la trypsine-EDTA avec support complet. Faites tourner les cellules et rincez une fois avec la classe de culture cellulaire PBS. Resuspendre le culot dans 5 mL de PBS.</li>
	<li>Effectuez un comptage cellulaire par des méthodes normalisées. Il est préférable que la suspension de cellules plus que ce qui est réellement nécessaire car perte de suspension cellulaire souvent se produit pendant l’aiguille rédiger et injection tentatives infructueuses.</li>
	<li>Effectuez un test d’Exclusion-le bleu Trypan sur un échantillon de la suspension cellulaire afin d’évaluer la viabilité des cellules. Avoir lieu que si la cellule Voir la viabilité de 90 % ou plus.</li>
	<li>Injecter 5 x 105 cellules dans un volume de 100 μL. Pour préparer un excès de 2 X de cette somme, 1 x 106 cellules devraient être tournés vers le bas et resuspendues dans 0,2 mL de HBSS.</li>
	<li>Placez la suspension cellulaire dans un seau à glace tout en préparant les souris pour injection.</li>
</ol>2. Injection dans la veine et Lung Insufflation de queue
Remarque : La quantité de solutions et de cellules dans cette section sera suffisant pour 1 souris. Intensifier selon les besoins si plus de souris sont utilisées dans l’étude. Pour obtenir la liste des équipements, matériaux et instruments chirurgicaux utilisés dans les étapes suivantes, se reporter au tableau 3 et tableau 4.
<ol><li>Réchauffer une souris femelle (âge 6-8 semaines) sous une lampe chauffante pendant 5 min afin de rendre leur queue veineuse plus visiblement apparente. Pour des cellules K7M2 ou K12, utiliser la souris Balb/c ; pour des cellules humaines, MG63.3, MG63, MNNG et HOS, utiliser la souris de déficit immunitaire combiné sévère.</li>
	<li>Assurez-vous que la suspension cellulaire est uniforme en agitant doucement le tube. Dresser soigneusement la suspension cellulaire dans la seringue de 1 mL sans l’aiguille. Aiguille de calibre Cap la seringue avec un 27. Assurez-vous que le biseau de l’aiguille est sur le même côté que les marques de volume sur l’aiguille.</li>
	<li>Placez votre souris dans la drisse et tamponner la queue avec un imbibé d’alcool.</li>
	<li>Passez à effectuer une injection dans la veine queue et injecter le 100 μl de la suspension cellulaire. 5 min après l’injection, placez la souris dans une chambre de CO2 et commencer le mode opératoire normalisé euthanasie (comme le contour de votre Comité de protection des animaux institutionnelle). Dislocation cervicale ne devrait pas servir de moyen d’euthanasie car la procédure risque d’endommager la trachée.</li>
	<li>Une fois que la souris est euthanasiée, débutez la préparation de la hotte à flux laminaire pour l’insufflation du poumon souris avec la solution d’agarose/A-media. Dans la hotte à flux laminaire, mis en place un espace de travail avec votre tampon stérile. Sur cette touche, vous placerez vos instruments stérilisés, cathéter IV, IV extension ensemble et appareil de perfusion de gravité (voir la Figure 1).</li>
	<li>Placez votre souris en recumbancy dorsale. Avec des ciseaux stériles de petit, disséquer attentivement sur le sternum pour exposer la cavité thoracique. Prenez soin de ne pas perforer le poumon car une solution d’agarose/A-media sera utilisée pour insuffler du poumon.</li>
	<li>Lorsque la dissection sur le sternum, disséquer passé l’entrée thoracique sur les deux côtés la trachée. Exposer la trachée en disséquant loin des tissus mous environnants.</li>
	<li>Canule dans la trachée avec un cathéter IV de 20 calibre. Vaguement un nœud chirurgicale avec suture catgut stérile autour de la trachée canulée.</li>
	<li>Attacher une extension IV la seringue de 10 mL de l’appareil de perfusion de gravité la valeur de la trachée cathétérisée.</li>
	<li>Combiner le pré chauffé 37 oC agarose (5 mL) et A-media (5 mL) dans un mélange 1:1. Verser la solution de gel d’agarose/A-media liquide dans la seringue de 10 mL de l’appareil de perfusion gravité. Avant insufflation des poumons avec une solution d’agarose/A-media, veiller à ce que toute la longueur de l’ensemble de l’extension a été amorcée avec l’agarose/A-media, niant ainsi l’insufflation accidentelle des échantillons pulmonaires à l’air.</li>
	<li>Remplir le poumon l’agarose/A-media solution jusqu'à ce que le poumon est entièrement insufflé.</li>
	<li>Une fois que le poumon est entièrement insufflé, retirer la canule et attacher fermement le noeud chirurgical pour éviter les fuites de la solution de l’agarase/A-media dans la trachée.</li>
	<li>Passez à disséquer sur le courage (trachée, coeur et poumon) de la cavité thoracique. Faites attention à pas de perforation ou d’endommager la surface du poumon.</li>
	<li>Place le pluck (dans aucune orientation particulière) à l’avance réfrigérée 30 mL de PBS additionné de 1 X stylo/strep et permettre l’agarose/A-media solidifier pendant 20 min.</li>
	<li>À l’aide des ciseaux et pince à épiler, couper de petits morceaux du poumon (3 x 1,5 mm) comme le montre la Figure 1 a. Petites tranches de poumon peuvent être facilement photographiées à l’aide d’un objectif X 2,5. Plusieurs sections peuvent être coupées par les conditions expérimentales, généralement de 4 à 10 tranches par groupe. Remarque : Pour chaque groupe expérimental, déposer les tranches de poumon dans un puits distinct (plaque 6 puits) contenant une éponge de gélatine de 2 x 2 cm préalablement trempée dans B-médias. Le montant des médias / puits devrait être de 1,5 mL. Modifier les médias tous les 2-3 jours. Pour les études de médicaments, la fréquence de l’évolution des médias/médicament est utilisateur déterminé.</li>
</ol>3. Widefield Fluorescence Imaging de tranches de poumon et d’analyse
Remarque : Pour widefield fluorescence imaging, petites tranches sont coupés (3 x 1,5 x 1 mm) afin d’intégrer la section poumon 1 image en utilisant un objectif X 2,5.
Acquisition d’images sur un microscope à fluorescence widefield :
<ol><li>Tranches de poumon sont généralement imagés à 0, 3, 7 et 14 jours après injection. Dans l’environnement stérile du cabinet biologique, transvaser avec soin les tranches de poumon de la gélatine, éponges à un fond en verre stérile 35 mm rond plat. Prenez soin de dab hors du liquide excédentaire dans la tranche de poumon comme l’excès de liquide va agir comme un miroir et réfléchissent la lumière fluorescente venant de cellules tumorales.</li>
	<li>Disposer les tranches de poumon de façon similaire, représentée dans la Figure 1 a. Chaque colonne représente une condition expérimentale différente. Prenez soin de ne pas la contamination croisée des poumons avec la pince à épiler. Rincer avec de l’éthanol à 70 % et sécher avant de manipuler des tranches de poumon d’un autre groupe expérimental.</li>
	<li>Optimiser les paramètres d’imagerie (ie. gain, décalage, l’exposition le temps, binning) qui offre le meilleur contraste entre les cellules tumorales fluorescent et le tissu pulmonaire arrière-plan du contrôle (véhicule non traitée) groupe. Utilisez les mêmes paramètres appartenant au groupe témoin afin d’imager les groupes expérimentaux. Enregistrer en tant que format d’image tiff.</li>
	<li>Pour une référence de l’échelle, prenez une photo numérique d’un micromètre le même objectif.</li>
	<li>Puisque le poumon auto-fluorescence change au fil du temps, les paramètres d’imagerie doivent être ajustés aux poumons contrôle chaque séance d’imagerie. Les paramètres d’imagerie pour une session ne peuvent pas nécessairement être optimales pour les sessions ultérieures d’imagerie.</li>
</ol>Analyse d’images : Remarque : Les étapes de traitement image suivants sont effectués avec ImageJ 1,51 h software package 17.
<ol><li>Ouvrir un fichier image dans ImageJ (Figure 3 a).</li>
	<li>Soustraire le fond : processus > soustraire fond > rayon de Rolling ball (Commencez par 50 pixels), décochez la case « Lumière de fond » (Figure 3 b).</li>
	<li>Convertir image en 8 bits format : Image > Type > 8 - bit (Figure 3).</li>
	<li>Valeur des unités de pixels : Image > Enter « Pixels » dans l’unité de longueur, entrez 1 dans « Largeur en pixels », « Hauteur en pixels », « Voxel profondeur ». Case « Global » à appliquer aux images suivantes.</li>
	<li>À l’aide de l’outil de sélection polygone, esquisser la forme de la tranche de l’ensemble du poumon et de déterminer la zone (pixel2) de la tranche totale des poumons. Cette valeur servira à calculer la charge de pourcentage tumeur du poumon.</li>
	<li>Image de seuil : Image > réglage > seuil > souligner « Par défaut » et « B & W » > Utilisez le curseur seuil l’image telle que la majorité des cellules tumorales est correctement mis en évidence. En appuyant sur « Appliquer » se traduira par une image noir et blanc où le poumon est tout noir, et les lésions fluorescentes sont blanches (Figure 3D). Une seconde pression sur « Apply » va inverser l’image où toutes les structures fluorescents sont maintenant des formes noires (Figure 3E).</li>
	<li>Quantification du nombre et la forme de lésions : Analyser > définir les mesures > Vérifier la « Zone ». Décochez toutes les autres cases. Analyser les particules > taille (pixels2) : 0-infini représente la plage de formes qui énumère ImageJ. Empiriquement déterminer la plus petite lésion qui est réputée pour être une cellule tumorale unique en images de véhicule jour 0. Utilisez la zone de cette cellule tumorale unique comme la limite inférieure pour les images restantes dans le jeu de données. Pour le travail présenté dans cet article, 11 pixel2 est définie comme la limite inférieure. Pour le œuvre présentée dans l’exemple de vidéo, 24 pixel2 est définie comme la limite inférieure. Gamme « Circularité » laissez 0-1. « Show » peut être définie sur « Nothing ». Par ailleurs, si le « Show » et « Contours » est sélectionné, un dessin de toutes les formes décrites est généré. Consultez « Affichage des résultats » pour une fenêtre séparée des mesures pour faire apparaître. Éventuellement, après avoir « Ajouter au manager » case cochée sauvera toutes les formes quantifiées à un responsable du ROI, qui peut être enregistré pour référence ultérieure. Après avoir appuyé sur OK, une fenêtre de « Résultats » apparaîtra contenant toutes les formes énumérées et les mesures de surface (Figure 3F).</li>
	<li>Copiez et collez les données dans la fenêtre « Résultats » dans une feuille de calcul. Utiliser la fonction mathématique de somme dans Excel pour la somme de toutes les zones des lésions métastatiques pour cette tranche particulière de poumon. Pour évaluer la charge de tumeur de poumon pourcentage de tranche de poumon, diviser la somme des superficies des lésions métastatiques de la superficie totale de la tranche du poumon. Ce paramètre est également connu sous le nom de fraction de zone (unA) qui est décrite plus loin par Underwood 18. Charge de tumeur pulmonaire = somme de domaine domaines/total lésion métastatique de la tranche de poumon</li>
	<li>Calculer la charge tumorale pour le reste des sections pulmonaires dans le groupe témoin et autres groupes. Tracer le fardeau de tumeur pulmonaire moyenne par groupe 0, 3, 7 et 14 jours. Représentant widefield images fluorescentes de haute et basse métastatiques cellules OS humains de plus en plus dans le modèle de PuMA aux moments progressive s’affichent (Figure 4 a). Un ligne graphique montrant le pli-changement (normalisé à jour 0) fardeau de la tumeur métastatique pourcentage au fil du temps s’affiche (Figure 4 b).</li>
</ol>4. confocal Fluorescence Imaging du modèle PuMA
NOTE : Pour l’imagerie confocale, traitement de tissu est similaire à celle de la section précédente sauf que les plus grandes tranches de poumon sont coupés (coupes transversales complets, 1-2 mm d’épaisseur) afin de permettre plus de ROIs à être photographié.
Étiquetage du parenchyme pulmonaire avec DAR4M :
<ol><li>Plonger les tranches de poumon en 10 μμM de DAR4M (dans HBSS) pendant 45 min à 37 ° C. DAR4M étiquettes espèces réactives d’azote dans les cellules du poumon.</li>
	<li>Après 45 min d’incubation, rincer les tranches de poumon avec frais HBSS.</li>
	<li>Placer la tranche de poumon dans un fond en verre 35 mm rond plat et l’image sur la microscopie confocale.</li>
	<li>Les paramètres d’imagerie pour les images de l’exemple illustrés à la Figure 5 sont répertoriés dans le tableau 5.</li>
	<li>Acquérir une Z-pile pour une région d’intérêt. Utilisez l’épaisseur de tranche Z suggérée pour l’échantillonnage de Nyquist. Un film représentatif d’un empilement 3D montrant des cellules d’OS fluorescentes vertes dans le tissu pulmonaire marqué DAR4M est fourni dans Movie 1 et supplémentaire 1 film.</li>
</ol>Pour les images confocales d’exemple, illustrés à la Figure 5, la séance d’imagerie a été terminale. Si l’imagerie longitudinale est nécessaire, l’utilisation d’un 2-photon ou multiphotonique équipée LSM microscope confocal pour l’imagerie est conseillée car il est moins photovieillissement à vie tissus19,20. L’imagerie mito-DP MG63 cellules exprimant dans le modèle de PuMA :
<ol><li>Effectuer le protocole PuMA comme contour dans étape 1 et 2 avec l’aide de MG63 cellules exprimant la construction mito-DP.</li>
	<li>Placer la tranche de poumon dans un fond en verre 35 mm rond plat et l’image sur la microscopie confocale.</li>
	<li>Les paramètres d’imagerie pour les images de l’exemple illustrés à la Figure 6 sont répertoriés dans le tableau 6. Un film représentatif d’un empilement 3D montrant les cellules fluorescentes vertes de OS rouge fluorescents mitochondries est fourni dans le film 2 et 2 film supplémentaire.</li>
</ol>

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<li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+metastatic+phenotype+of+a+panel+of+established+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells.</a> Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’article technique suivant décrit certains aspects pratiques du modèle PuMA dans l’étude de colonisation de poumon dans les OS. Certaines étapes critiques du protocole où les chercheurs devraient prendre des précautions supplémentaires sont les suivantes :
un) canulation de la trachée. La trachée peut être facilement endommagée en disséquant les muscles environnants et le tissu conjonctif. En outre, l’aiguille du cathéter peut facilement être poussé à travers la trachée. Porter une attention ...

Amélioration des résultats pour les patients pédiatriques atteints d’ostéosarcome métastatique (OS) reste encore une critique comblés clinique 1. Cela souligne l’importance de développer des nouvelles thérapies moléculaires ciblées. Des agents chimiothérapeutiques classiques que la prolifération des cellules tumorales cible n’ont pas été prouvées pour être efficace dans le traitement de la maladie métastatique et donc de nouvelles stratégies doivent cibler le processus métastatique lui-même 2. L’actuel article porte sur les aspects pratiques d’un type relativement nouveau de ex vivo le modèle métastase pulmonaire, le dosage de métastase pulmonaire (PuMA) développé par Mendoza et ses collègues3, qui fournit un outil utile pour découvrir de nouveaux conducteurs moléculaires dans la progression de métastases pulmonaires en OS 4,5. Toutefois, avant de poursuivre, il serait prudent d’aborder brièvement plusieurs modèles actuels de métastases et comment le modèle PuMA offre plusieurs avantages sur conventionnelles in vitro tests.
Des modèles plus expérimentaux utilisés pour étudier les métastases comprennent des systèmes in vitro et in vivo de récapitulent une étape spécifique ou plusieurs étapes de la cascade métastatique. Ces étapes incluent : émigrer loin de la tumeur primitive, l’intravasation 2) dans des navires voisins (sanguin ou lymphatique) et transport en commun au sein de la circulation, des cellules de tumeur 1) 3) arrêter au site secondaire, extravasation 4) et la survie du site secondaire, formation de 5) des micrométastases et 6) la croissance des métastases vascularisés (Figure 1). Les modèles in vitro de la métastase peuvent inclure 2 dimensions migration (2D) et 3 Dimensions (3D) analyses d’invasion Matrigel qui sont examinés en détaillent ailleurs 6. Pour les modèles in vivo , les deux systèmes de modèles couramment utilisés comprennent : 1) le modèle de métastase spontanée est où des cellules tumorales sont orthotopically injecté dans un type spécifique de tissu pour former une tumeur locale qui apporte spontanément des cellules métastatiques à des endroits éloignés ; 2) le modèle expérimental de métastase est où les cellules tumorales sont injectés dans le vaisseaux sanguins en amont de l’organe cible. Par exemple, une queue injection dans la veine des résultats de cellules de tumeur dans le développement du poumon métastases5,7,8. Autres modèles expérimentaux métastase comprennent l’injection de cellules tumorales dans la rate ou de la veine mésentérique qui se traduit par le développement des métastases hépatiques9,10. Des considérations pratiques de ces modèles in vivo sont examinées en détail par Welch 11. Un autre modèle in vivo utilisé pour étudier des métastases dans les sarcomes pédiatriques est le modèle d’implantation sous-capsulaire tumeur rénale rein qui provoque la formation de tumeurs locales et métastase spontanée aux poumons 12,13. Une technique plus techniquement exigeante comme vidéomicroscopie intravitale peut visualiser directement, en temps réel, interactions entre les cellules de cancer métastatique et la microcirculation d’un site métastatique (ie. poumon ou du foie) tel que décrit par MacDonald14 et Entenberg,15, ou cancer cell extravasation dans la membrane chorio-tel que décrit par Kim, 16.
Le modèle de PuMA est une ex vivo, l’explant tissu pulmonaire, système de culture fermée où la croissance des cellules tumorales fluorescent peut être longitudinalement observée par microscopie de fluorescence au cours d’une période d’un mois (voir la Figure 2 a). Ce modèle récapitule les étapes initiales de la colonisation de poumon (étapes 3 à 5) dans la cascade métastatique. Quelques grands avantages du modèle PuMA par rapport aux modèles classiques in vitro sont : 1) elle offre la possibilité de mesurer la croissance des cellules cancéreuses métastatiques dans un micro-environnement 3D qui conserve de nombreuses caractéristiques du microenvironnement poumon longitudinalement dans vivo 3; 2) puMA permet au chercheur de déterminer si la précipitation d’un traitement de gène ou médicament candidat a une activité anti-métastatique dans le contexte d’un micro-environnement poumon 3D ; 3) le modèle PuMA est souple avec une multitude de plateformes de microscopie de fluorescence (Figure 2 b) comme la microscopie de fluorescence widefield ou microscopie confocale à balayage laser, des exemples de chacun sont montrés dans la Figure 2 -D, respectivement. Cet article discute comment utiliser le modèle PuMA pour obtenir des données d’imagerie longitudinales sur la croissance métastatique de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP)-exprimer, les cellules humaines ostéosarcome métastatique haute et basse (MNNG et HOS cellules, respectivement) à l’aide faible grossissement widefield fluorescence. Exemples d’imagerie un colorant fluorescent qui étiquète le parenchyme pulmonaire et une protéine fluorescente rouge journaliste génétique qui étiquète mitochondries dans les OS des cellules dans le modèle de PuMA à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser sont également discutés.

<table><tbody><tr><td>Tableau 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactifs de culture cellulaire pour milieux A, B et milieux complets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNNG-HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1547</td><td>lignée cellulaire de SG hautement métastatique</td></tr><tr><td>HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td>lignée cellulaire de SG faiblement métastatique</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Laboratoire Amy LeBlanc (NCI)</td><td>N/A</td><td>lignée cellulaire OS hautement métastatique</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td><td>lignée cellulaire OS faiblement métastatique</td></tr><tr><td>10X M199 milieu</td><td>Thermofisher</td><td>11825015</td><td>Milieu de base pour A-média et milieu B</td></tr><tr><td>Eau distillée (stérilisée)</td><td>Thermofisher</td><td>15230-147</td><td>Composant du média A & B-media</td></tr><tr><td>7,5</td> % solution de bicarbonate de sodium <td>Thermofisher</td><td>25080094</td><td>Composant de A-media & B-media</td></tr><tr><td>Hydrocortizone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>H6909</td><td>Composant de A-media & B-media</td></tr><tr><td>Acétate de rétinol soluble dans l’eau</td><td>Sigma-Alrich</td><td>R0635-5MG</td><td>Composant de A-media & B-media</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine 10X solution concentrée (10000 U/ml)</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td>Composant de A-media & B-media, média complet.</td></tr><tr><td>Solution d’insuline bovine (10mg/ml)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>I0516-5ML</td><td>Composant des A-media & Milieu B</td></tr><tr><td>DMEM, Thermofisher à haute teneur en glucose</td><td></td><td>11965092</td><td>Milieu de base du milieu complet</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermofisher</td><td>25030081</td><td>composant du milieu complet</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermofisher</td><td>16000044</td><td>composant du milieu complet</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Thermofisher salin tamponné au phosphate</td><td></td><td>14190144</td><td>utilisé en culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Hank' s Solution de sels tamponnés, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol</td><td>Thermofisher</td><td>14175095</td><td>Utilisé pour remettre en suspension les pastilles cellulaires avant l’injection</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol</td><td>Thermofisher</td><td>25200114</td><td>Utilisé en culture cellulaire.</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>Utilisé pour marquer le parenchyme pulmonaire.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Table 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials for PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal LSM</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Upright LSM confocal microscope</td></tr><tr><td>Zeiss 780 LSM confocaux</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Microscope confocal LSM inversé</td></tr><tr><td>Souris SCID</td> Charles <td>River</td><td>N/A</td><td>NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, femelle, 6-8 semaines</td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-9863</td><td>Utilisé comme support pour les coupes de tissu pulmonaire.</td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>Utilisé lors de l’insufflation du poumon.</td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml avec aiguille de calibre 27</td><td>Fisherscientific</td><td>14-826-87</td><td>Utilisée pour l’injection dans la veine de la queue.</td></tr><tr><td>Seringue de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td>Utilisée pour l’insufflation du poumon.</td></tr><tr><td>Cathéter de calibre 20</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2032CA</td><td>Utilisé lors de l’insufflation du poumon.</td></tr><tr><td>Kit d’extension Abbott IV (30", stérile)</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>Utilisé lors de l’insufflation du poumon.</td></tr><tr><td>Tampons imbibés d’alcool</td><td>BD</td><td>326895</td><td>Pour essuyer la veine de la queue avant l’injection</td></tr><tr><td>Gants chirurgicaux stériles</td><td>Fisherscientific</td><td>Varie selon la taille</td><td>Manipulation asceptique des poumons de souris Règle de</td></tr><tr><td>30 cm</td><td>Agrafes Utilisées</td><td></td><td>pour l’insufflation du poumon.</td></tr><tr><td>Support pour règle</td><td>Pipette.com</td><td>HS29022A</td><td>Utilisé pour l’insufflation du poumon.</td></tr><tr><td>Boîte de culture à fond de verre de 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Utilisée lors de l’imagerie de coupes pulmonaires</td></tr><tr><td>Sous-couches absorbantes avec barrière étanche contre l’humidité</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>Utilisée pour tapisser la zone de travail stérile dans la hotte biologique.</td></tr><tr><td>Catgut Plain Absorbable Suture</td><td>Braun</td><td>N/A</td><td>Utilisé pour attacher la trachée canulée.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Table 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments chirurgicaux pour PuMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Ciseaux 3.5" Straight Sharp/Sharp</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>Pour couper des sections pulmonaires</td></tr><tr><td>4" (10 cm) Longue Dentelée Droite Extra Délicate Pointe de 0,5 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td>Pour manipuler/tenir des sections pulmonaires.</td></tr><tr><td>4 pouces (10 cm) Longue Dentelée Légère Courbe 0.8mm Pointe</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>Pour manipuler/tenir des sections pulmonaires.</td></tr><tr><td>pince à pansement pour le pouce ; Dentelé; Délicat; 4,5" Longueur ; Largeur de pointe de 1,3 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>Pour la dissection générale.</td></tr><tr><td>Pince à pansement pour pouce 4,5" dentelée 2,2 mm Largeur de l’embout</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>Pour la dissection générale.</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection micro fins extra fins 3,5" Sharp / Sharp, lame de 20 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td>Pour la dissection générale.</td></tr><tr><td>Ciseaux Knapp ; Droit; Tranchant-émoussé ; Longueur de lame de 27 mm ; Longueur totale de 4 "</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>pour la dissection générale.</td></tr></tbody></table>

considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

L’essai de métastase pulmonaire (PuMA) est une ex vivo explant de poumon et le système de culture de cellules fermées qui permet aux chercheurs d’étudier la biologie de la colonisation de poumon dans l’ostéosarcome (OS) par microscopie à fluorescence. Cet article fournit une description détaillée du protocole et traite des exemples d’obtenir des données d’image sur la croissance métastatique à l’aide de widefield ou plateformes de microscopie confocal fluorescence. La souplesse du modèle PuMA permet des chercheurs d’étudier non seulement la croissance des cellules d’OS dans le microenvironnement de poumon, mais aussi pour évaluer les effets de la thérapeutique anti-métastatique au fil du temps. La microscopie confocale permet l’imagerie haute résolution, sans précédent des interactions cellulaires OS avec le parenchyme pulmonaire. En outre, le modèle PuMA est associé à des colorants fluorescents ou reporters génétique de la protéine fluorescente, les chercheurs peuvent étudier le microenvironnement de poumon, les structures cellulaires et subcellulaires, la fonction du gène et l’activité de promoteur dans les cellules d’OS métastatiques. Le modèle PuMA offre un nouvel outil pour les chercheurs d’ostéosarcome à découvrir la nouvelle biologie de métastase et évaluer l’activité de nouveaux traitements anti-métastatiques et ciblées.

Microscopie de fluorescence faible grossissement widefield
Pour la microscopie de fluorescence widefield de tranches de poumon de PuMA, images représentatives et des données de quantification sont indiquées dans la Figure 2et la Figure 4 a et B. Les propensions métastatiques des lignées de cellules métastatiques haute et basse ...

L’objectif de cet article est de fournir une description détaillée du protocole pour le dosage de métastase pulmonaire (PuMA). Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier la croissance des cellules dans les tissus pulmonaires à l’aide d’une fluorescence widefield ou microscope confocal à balayage laser ostéosarcome métastatique (OS).

Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

L’objectif global de ce test de métastases pulmonaires est de visualiser et d’étudier directement la croissance des cellules d’ostéosarcome métastatique dans le tissu pulmonaire viable. Cette méthode peut aider à répondre à des questions vraiment clés dans le domaine des métastases de l’ostéosarcome. Par exemple, comment les cellules métastatiques de l’ostéosarcome s’adaptent, survivent et prolifèrent dans le microenvironnement pulmonaire.Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une visualisation directe de la croissance cellulaire d’un ostéosarcome métastatique dans un micro-environnement tridimensionnel pertinent. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, en raison des étapes techniquement difficiles de la canulation de la trachée et de l’insufflation du poumon. L’injection de cellules tumorales dans la veine caudale et l’euthanasie chez la souris sont effectuées conformément aux directives institutionnelles standard.Après cinq minutes, placez la souris euthanasiée en décubitus dorsal sur un coussinet stérile dans une hotte à flux laminaire, et utilisez de petits ciseaux stériles pour disséquer soigneusement le sternum, au-de

practical-considerations-studying-metastatic-lung-colonization

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JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Cet article décrit les procédures d'un essai de métastases expérimentales qui est utilisé pour déterminer le potentiel métastatique de lignées cellulaires humaines de cancer.

Assay Métastases expérimentales

Le nouveau protocole indiqué dans la présente étude permet une détection sélective des métastases pulmonaires à la résolution cellule unique chez la souris par...

Amélioration de la visualisation des métastases pulmonaires à la Résolution Single Cell chez les souris en combiné<em&gt; In situ</emPerfusion&gt; du tissu pulmonaire et coloration X-gal de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tag cellules tumorales

Cet article décrit une méthode pour quantifier l’accumulation de cellules de tumeur dans les poumons dans un modèle animal de métastases tumorales.

Analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire

Ce travail préséque un protocole avancé pour évaluer avec précision la charge tumorale par la détection de protéines fluorescentes vertes et de signaux de bioluminescence ainsi que l’intégration de la technique quantitative de détection moléculaire.

Étudier le cancer du sein triple négatif à l’aide d’un modèle orthotopique de cancer du sein

L'approche décrite combine des tests expérimentaux de métastaser de veine de queue avec l'imagerie animale vivante in vivo pour permettre la surveillance en temps réel de la formation et de la croissance de métastes de cancer du sein en plus de la quantification du nombre et de la taille des métastes dans les poumons.

Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons

L’injection intraveineuse de cellules cancéreuses est souvent utilisée dans la recherche sur les métastases, mais la charge tumorale métastatique peut être difficile à analyser. Ici, nous démontrons un modèle d’injection de métastases dans la veine de la queue et incluons une nouvelle approche pour analyser la charge tumorale pulmonaire métastatique qui en résulte.

Analyse pathologique des métastases pulmonaires après injection latérale de cellules tumorales dans la veine caudale

Les modèles de métastases osseuses ne développent pas de métastases uniformément ou avec une incidence de 100%. L’injection directe de cellules tumorales intra-osseuses peut entraîner une embolisation du poumon. Nous présentons notre technique de modélisation des tumeurs osseuses primaires et des métastases osseuses en utilisant l’implantation d’une greffe de tumeur solide dans l’os, conduisant à une greffe et une croissance reproductibles.

Modélisation des tumeurs osseuses primaires et des métastases osseuses avec implantation d’une greffe de tumeur solide dans l’os

Ici, une implantation orthotopique syngénique suivie d’une procédure d’amputation de l’ostéosarcome avec métastases pulmonaires spontanées pouvant être utilisée pour l’investigation préclinique de la biologie des métastases et le développement de nouvelles thérapies est décrite.

Un modèle de rat Sprague Dawley d’ostéosarcome orthotopique syngénique avec amputation pour contrôler le taux de métastases

Le présent protocole décrit l’injection intratibia de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins portant des lésions d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires.

Injection intratibiale de cellules d’ostéosarcome pour générer des modèles murins d’ostéosarcome orthotopique et de métastases pulmonaires

Le manuscrit décrit une méthodologie pour l’établissement ainsi que le suivi longitudinal de la croissance des métastases pulmonaires spontanées à partir de tumeurs mammaires injectées orthotopiquement, susceptible d’intervention à tous les stades de la cascade métastatique.

In vivo Imagerie pour mesurer les métastases pulmonaires spontanées de cellules tumorales mammaires injectées orthotopiquement

Ce protocole expérimental offre une méthode stable, rentable et efficace qui combine le knockdown de l’ARNnc avec des tests formant des colonies afin de quantifier l’effet de l’ARNnc sur la prolifération cellulaire de l’ostéosarcome.

Essai de formation de colonie détectant la capacité proliflective des cellules d’ostéosarcome à élimination d’ARNCn

Découvrez le protocole PuMA pour visualiser la croissance des cellules d'ostéosarcome métastatique dans le tissu pulmonaire. Cette méthode permet d'étudier l'adaptation et la prolifération cellulaire en trois dimensions.

Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal

Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires

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