Name: Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Découvrez comment optimiser la microscopie à fluorescence pour visualiser le transport axonal de la cargaison endogène chez Caenorhabditis elegans. Ce protocole améliore l'imagerie des protéines cytosoliques abondantes.

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<meta charset="utf8"></head><body>Amélioration de l’analyse du transport axonal chez les C. elegans vivants à l’aide de RAB-3 marqué GFP

<ol><li>Millecamps, S., Julien, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).</li>
<li>Brady, S. T., Morfini, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+proteins%2C+axonal+transport+deficits+and+adult-onset+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).</li>
<li>Kevenaar, J. T., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axonal+cytoskeleton%3A+from+organization+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The axonal cytoskeleton: from organization to function.</a> Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).</li>
<li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+unseen%3A+the+hidden+world+of+slow+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport.</a> Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).</li>
<li>Watson, E. T., Pauers, M. M., Seibert, M. J., Vevea, J. D., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+proteins+are+selectively+delivered+to+axons+in+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons.</a> Elife. 12, e82568(2023).</li>
<li>Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap%2C+a+toolkit+for+high-throughput+CRISPR%2FCas9+gene+modification+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).</li>
<li>Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+to+analyze+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons.</a> J Vis Exp. (128), e56690(2017).</li>
<li>Caenorhabditis genetics center (CGC). University of Minnesota. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cgc.umn.edu/">https://cgc.umn.edu/</a> (2023).</li>
<li>Ghanta, K. S., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melting+dsDNA+donor+molecules+greatly+improves+precision+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).</li>
<li>He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NATF+%28Native+and+Tissue-Specific+Fluorescence%29%3A+A+strategy+for+bright%2C+tissue-specific+GFP+labeling+of+native+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).</li>
<li>Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CeNGEN+Project%3A+The+complete+gene+expression+map+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system.</a> Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).</li>
<li>Taylor, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+topography+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular topography of an entire nervous system.</a> Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).</li>
<li>Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CeNGEN+project%3A+The+complete+gene+expression+map+of+an+entire+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system.</a> Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).</li>
<li>Takihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+of+mitochondria+in+the+diseased+and+aged+mammalian+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).</li>
<li>Li, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuronal+kinesin+UNC-104%2FKIF1A+is+a+key+regulator+of+synaptic+aging+and+insulin+signaling-regulated+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory.</a> Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).</li>
<li>Viancour, T. A., Kreiter, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+fast+axonal+transport+rates+in+young+and+old+rat+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons.</a> Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).</li>
<li>Cross, D. J., Flexman, J. A., Anzai, Y., Maravilla, K. R., Minoshima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decrease+in+axonal+transport+measured+by+MR+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo.</a> Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).</li>
<li>Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Lissencephaly-1+levels+augments+mitochondrial+transport+and+has+a+protective+effect+in+adult+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons.</a> J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoAnalyzer%3A+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li>
<li>Hall, D. H., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+posterior+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+serial+reconstruction+of+identified+neurons+and+complete+pattern+of+synaptic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions.</a> J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+ventral+nerve+cord+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>Park, J., Xie, Y., Miller, K. G., De Camilli, P., Yogev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-binding+protein+1+promotes+specific+motor-cargo+association+in+the+cell+body+prior+to+axonal+delivery+of+dense+core+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles.</a> Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).</li>
<li>Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+genome+editing+with+short+single-stranded+and+long%2C+partially+single-stranded+DNA+donors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency%2C+homology-directed+genome+editing+in+Caenorhabditis+elegans+using+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).</li>
<li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-wrmScarlet+and+split-sfGFP%3A+tools+for+faster%2C+easier+fluorescent+labeling+of+endogenous+proteins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 217 (4), (2021).</li>
<li>Cranfill, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SapTrap+assembly+of+Caenorhabditis+elegans+MosSCI+transgene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors.</a> G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).</li>
<li>Glomb, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-1+adaptor+complex+controls+bimodal+slow+axonal+transport+of+spectrin+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de recouvrement (22 mm x 22 mm, No1) ; Verre de protection Gold Seal</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A14</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>ChemCruz</td><td>sc-205730</td><td></td></tr><tr><td>Microscope : Microscope inversé Nikon Ti2, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Appareil photo Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, Objectif à immersion dans l’huile Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA, Scanner de photostimulation Nikon à 488 nm avec un filtre d’émission ET525/36</td><td></td><td>Microscope</td> confocal à disque tournant Nikon <td></td></tr><tr><td>&nbsp ; NIS-elements AR</td> Logiciel <td>Nikon</td><td></td><td>pour le Nikon Ti2&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lames de microscopie simples prénettoyées</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td></td></tr><tr><td>Nematode strain</td><td>Identifier</td><td>Source</td><td></td></tr><tr><td>rab-3(ox699[GFP ::flip-on ::rab-3]) (II) ; shyIs43(glr-4p ::FLP-NLSx2 ; odr-1p ::RFP) (II)</td><td>Park et al. (DOI : 10.1016/j.cub.2023.07.052)</td><td>MTS1161&nbsp ;</td><td>Sera déposé à la CGC (https://cgc.umn.edu/)</td></tr></tbody></table>

optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez caenorhabditis elegans vivant

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo by Fluorescence Microscopy in Living Caenorhabditis elegans

Vue d’ensemble du système modèle et de la procédure de mesure Pour visualiser le transport axonal des précurseurs des vésicules synaptiques, nous avons tracé de manière endogène la GFP marquée RAB-3. Ici, nous utilisons une souche6 de GFP ::Flip-on ::RAB-3 récemment générée, dans laquelle l’expression de la recombinase Flippase sous un promoteur spécifique de la cellule (glr-4p) marque RAB-3 endogène dans le motoneurone DA9. DA9 est un motoneurone bipolaire, dont le corps cellulaire est situé à l’arrière de l’animal, sur la face ventrale, près de l’anus (Figure 1A). Il contient une courte dendrite qui court vers l’avant le long du cordon nerveux ventral et un long axone qui court vers l’arrière, forme une commissure puis court vers l’avant le long du cordon nerveux dorsal, où il forme des synapses en passant qui innervent le muscle dorsal et le neurone VD 22,23,24. Nous visualisons le transport axonal dans la région asynaptique ; la plupart des événements de transport peuvent être capturés avec un seul plan focal (Figure 1A). Une première étape de photo-blanchiment est mise en œuvre pour réduire le bruit de fond des vésicules stationnaires dans cette zone, qui ont souvent tendance à s’arrêter dans cette région (Figure 1B). Des vidéos en accéléré sont enregistrées sur une période de 3 minutes et le signal RAB-3 le long de la région asynaptique est tracé dans un kymographe pour extraire les événements de transport individuels (Figure 1C).
Ajustement du paramètre d’acquisition pour optimiser la visualisation du transport axonal Pour surmonter la faible intensité du signal de nombreuses protéines endogènes marquées par fluorescence, les paramètres d’acquisition du microscope doivent être optimisés. Pour une quantification robuste des événements de transport, l’intensité du signal des événements de transport individuels doit être aussi brillante que possible sur le fond cytoplasmique ou sur la cargaison stationnaire en pause. Les précurseurs des vésicules synaptiques s’arrêtent souvent dans la région asynaptique dans des bassins de vésicules distincts, ce qui interfère avec la détection de nouvelles vésicules entrantes et rend difficile le suivi de leurs traces de transport7.
Une seule étape initiale de blanchiment de fluorescence peut réduire considérablement le signal de fluorescence dérivé des flaques de vésicules afin d’améliorer la détection de mouvement de nouvelles vésicules entrantes (Figure 2A). L’étape de blanchiment n’a que légèrement amélioré le signal de déplacement des vésicules RAB-3 sur l’intensité du fond cytoplasmique, probablement parce que la fraction cytoplasmique de RAB-3 est très faible (Figure 2D).
L’utilisation du binning fournit une couche supplémentaire pour améliorer le signal sur l’arrière-plan des événements de transport individuels en combinant un tableau de pixels en un seul pixel. Un binning 2 x 2 réduira de moitié la résolution spatiale (ici de 108,33 nm/pixel à 216,7 nm/pixel), ce qui est toujours suffisant pour suivre les particules de transport RAB-3 individuelles (Figure 2B) mais améliore considérablement l’intensité du signal des vésicules individuelles (Figure 2D). À moins qu’une très haute résolution spatiale ne soit requise, le binning peut également être appliqué pour visualiser de nombreuses autres cargaisons axonales.
Ensuite, nous nous sommes demandé comment les changements dans le temps d’exposition peuvent améliorer l’intensité du signal d’événements de transport uniques. Nous avons particulièrement inclus le temps d’exposition dans l’analyse pour démontrer également qu’un temps d’exposition allant jusqu’à 500 ms avec 700 ms entre les points d’imagerie suivants fournit toujours une résolution temporelle à laquelle les précurseurs des vésicules synaptiques peuvent être suivis (Figure 2C,D).
Génération et analyse de kymographes avec Fidji Générer un kymographe et analyser les événements de transport individuels en suivant les étapes de la figure 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble du système modèle permettant de visualiser le transport axonal du RAB-3 fluorescent endogène. (A) Panneau supérieur : Vue d’ensemble du nématode avec l’axe postérieur-antérieur et l’axe ventral-dorsal indiqués. Le motoneurone DA9 est étiqueté en bleu. Panneau central : Zoom avant sur la zone encadrée affichée dans le panneau supérieur avec compartimentation DA9 indiquée. En passant, les synapses sont illustrées en vert, * indique l’anus. Notez que l’axone se poursuit dans le cordon nerveux dorsal jusqu’à ce qu’il passe par la vulve. La case rouge indique la région de la zone asynaptique. Panneau inférieur : Image de microscopie confocale de la GFP endogène marquée RAB-3 dans l’axone proximal dans un seul plan focal. Notez qu’il existe des puits vésiculaires de RAB-3 en pause plus longue dans la région asynaptique, bien que la plupart des signaux RAB-3 se regroupent dans la région synaptique. La région asynaptique est encadrée en rouge. Echelle : 20 μm. (B) Images représentatives d’un enregistrement en accéléré pour visualiser le transport axonal. Pour améliorer la traçabilité des particules de transport individuelles par rapport aux particules stationnaires, la région asynaptique est d’abord photoblanchie. Les panneaux inférieurs en boîte violette montrent un exemple d’un événement de mouvement antérograde (pointe de flèche orange) et rétrograde (pointe de flèche bleue). Les panneaux de haut en bas représentent des points temporels consécutifs. (C) L’enregistrement en accéléré en (B) a été tracé sous forme de kymographe (représentation 2D du temps sur la position). Les lignes diagonales représentent des événements de mouvement dans lesquels la pente indique la vitesse. Les lignes verticales montrent les événements stationnaires. La boîte violette est un zoom avant du kymographe pour mettre en évidence les événements de transport qui sont également représentés en (B) et les événements de transport antérogrades (orange) et rétrogrades (bleu) sont tracés. Les lignes verticales pointillées indiquent les événements de pause. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig02.jpg"> Figure 2 : Optimisation des étapes et des paramètres d’acquisition pour améliorer la visualisation du fret axonal endogène. Des GFP ::RAB-3 endogènes ont été visualisés dans la zone asynaptique de l’axone DA9 en prenant des images d’un seul plan focal sur un microscope à disque rotatif confocal. Des kymographes ont été acquis pour visualiser les événements de transport individuels dans les directions antérogrades (de droite à gauche) et rétrogrades (de gauche à droite) (A-C). (A) Les kymographes montrent des événements de transport de RAB3 sans (kymographes gauches) ou avec une étape de blanchiment intégrée. Notez que l’étape de blanchiment améliore la visualisation des événements de pause (indiqués par des pointes de flèches jaunes) entre des événements de transport consécutifs (pointes de flèches orange). (B) La mise en œuvre du binning 2 x 2 permet d’améliorer l’intensité du signal des événements de transport RAB3 faibles. Les images ont été acquises à un temps d’exposition de 300 ms et avec (C) l’augmentation progressive du temps d’exposition (de 100 ms à l’extrême gauche à 500 ms à l’extrême droite) contribue à améliorer l’intensité du signal des événements de transport individuels. Les images ont été acquises en binning 2 x 2 et en utilisant une première étape de photoblanchiment. Tous les kymographes ont une durée totale de 3 min et sont dessinés à la même échelle, de sorte que les kymographes avec moins de points de temps d’acquisition en raison d’un laps de temps plus long entre les points d’imagerie consécutifs ont une longueur totale du kymographe plus courte. (D) Quantification de l’intensité du signal par événement de transport après soustraction de la fluorescence de fond des kymographes en (A-C). Notez que le binning et l’étape de photoblanchiment ont été acquis à un temps d’exposition de 300 ms. Comparaison statistique à l’aide de n événements pendant 100 ms (névénements = 27 chez nanimaux = 2), 200 ms (névénements = 30 chez nanimaux = 2), 300 ms (névénements = 88 chez nanimaux = 6), 500 ms (névénements = 12 chez nanimaux = 1), 300 ms sans regroupement (w.o.) (névénements = 31 chez nanimaux = 3), 300 ms avec regroupement (w) (névénements = 88 chez nanimaux = 6) et 300 ms, 2 x 2 binning avec blanchissement (névénements = 88 chez nanimaux = 6) et sans blanchiment. Chaque point de données représente l’intensité du signal d’un événement de transport RAB-3 individuel après la soustraction du bruit de fond (cytoplasme de l’axone) à un seul point temporel le long de sa trace qui a été choisi au hasard. Le temps d’exposition a été comparé à l’aide d’un test de Kruskal-Wallis suivi d’une comparaison multiple de Dunn, le binning et le photoblanchiment ont été comparés à l’aide d’un test de Mann-Whitney par paires. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66236/66236fig03.jpg"> Figure 3 : Procédure étape par étape pour générer un kymographe et mesurer les événements de transport individuels. (A) Après avoir chargé l’enregistrement vidéo dans Fidji, l’outil de ligne segmentée est utilisé pour tracer une ligne sur toute la longueur du segment axonal qui va être analysé. (B) Un kymographe (panneau de droite) est généré à l’aide du plugin Kymoreslicewide avec les paramètres représentés dans le panneau de gauche. (C) Les événements de transport individuels sont suivis à l’aide de l’outil de ligne linéaire et stockés dans le gestionnaire de retour sur investissement. Le panneau de droite affiche les paramètres de mesure utilisés pour générer le tableau des résultats. (D) Les résultats de la table sont utilisés pour calculer le paramètre de transport. Les cases indiquent les paramètres importants qui sont décrits dans la section méthodes du protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66236/66236fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant

Axonal transport is a prerequisite to deliver axonal proteins from their site of synthesis in the neuronal cell body to their destination in the axon. ...

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L'abondance des récepteurs de neurotransmetteurs dans les synapses en cluster influe fortement sur la force synaptique. Cette méthode permet de quantifier les récepteurs des neurotransmetteurs marquage fluorescent en trois dimensions avec une seule synapse...

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Cette vidéo montre comment les vésicules neuronales sont marquées avec des protéines fluorescentes spécifiques pour visualiser leur mouvement. Tout d’abord, un plasmide codant pour une protéine fluorescente est incubé avec un agent de transfection, puis introduit dans une culture de neurones. Par la suite, des images des neurones sont acquises et analysées pour suivre le mouvement des vésicules.

Visualisation des motilités vésiculaires dans les neurones à l’aide de l’imagerie par fluorescence

Le transport intracellulaire des cargaisons, telles que les vésicules ou les organites, est effectué par des protéines motrices moléculaires qui suivent les microtubules polarisés. Ce protocole décrit la corrélation entre la directionnalité du transport des particules de cargaison individuelles se déplaçant à l’intérieur des neurones et la quantité relative et le type de protéines motrices associées.

Caractériser la composition de moteurs moléculaires sur les moyens axonale Cargo Utilisation de l&#39;analyse &quot;Cargo Mapping&quot;

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un bon modèle pour étudier le transport axonal et intracellulaire. Ici, je décris un protocole in vivo d’enregistrement et d’analyse du transport axonal et de chez c. elegans.

Immobilisation Caenorhabditis elegans , à analyser le Transport intracellulaire dans les neurones

Cette étude décrit des mesures quantitatives de la taille et de la localisation synaptiques, de la morphologie musculaire et de la forme mitochondriale chez C. elegans à l'aide d'outils de traitement d'image librement disponibles. Cette approche permet à des études futures chez C. elegans de comparer quantitativement l'étendue des changements structurels tissulaires et organllés résultant de mutations génétiques.

Approches quantitatives pour l'étude des structures cellulaires et de la morphologie d'organite à Caenorhabditis elegans

Un protocole d’imagerie des microtubules dynamiques in vivo à l’aide d’une protéine de liaison à l’extrémité sous marquage fluorescent a été présenté. Nous avons décrit les méthodes pour étiqueter, imager et analyser les microtubules dynamiques dans le neurone du microtubule latéral postérieur (PLM) de C. elegans.

In vivo Évaluation de la dynamique et de l’orientation des microtubules dans les neurones de Caenorhabditis elegans

À l’aide de souris fluorescentes transgéniques, des protocoles détaillés sont décrits pour évaluer le transport axonal in vivo des endosomes de signalisation et des mitochondries dans les axones moteurs et sensoriels du nerf sciatique intact chez les animaux vivants.

Élargir la boîte à outils pour l’imagerie in vivo du transport axonal

Ce protocole fournit une approche standardisée pour l’imagerie de la morphologie mitochondriale dans plusieurs tissus de C. elegans au cours du vieillissement.

Imagerie et quantification de la morphologie mitochondriale chez C. elegans au cours du vieillissement

Nous fournissons ici des instructions sur l’utilisation efficace de SegElegans, un système d’apprentissage profond que nous avons développé pour la segmentation automatisée de vers individuels dans des images de microscopie à grand champ, pour une utilisation ultérieure dans des logiciels d’analyse d’images tels qu’ImageJ. Nous fournissons des moyens d’utiliser le système à la fois en ligne et hors ligne.

Analyse automatisée d’images de fluorescence de C. elegans à l’aide de SegElegans

Découvrez comment optimiser la microscopie à fluorescence pour visualiser le transport axonal de la cargaison endogène chez Caenorhabditis elegans. Ce protocole améliore l'imagerie des protéines cytosoliques abondantes.

Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant (Vidéo) | JoVE Journal

Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant

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