Analyse des Complexes protéiques dynamique assemblés sur et libéré de Biolayer interférométrie biocapteur à l’aide de la spectrométrie de masse et de microscopie électronique

L’objectif général de cette procédure est d’observer l’assemblage dynamique de complexes protéiques dans différents environnements de pH à l’aide de l’interférométrie des biocouches et de confirmer les composants à l’aide de la microscopie électronique et de la spectrométrie de masse. L’identification et la compréhension de la spécificité régissant la formation et l’assemblage des complexes protéiques sont d’un intérêt extrême pour les chercheurs en biochimie. La méthodologie dont nous parlons aujourd’hui permet aux chercheurs d’assembler, de visualiser et de valider les complexes macromoléculaires prédits.

La nature complexe de la surface du biocapteur permet alors aux chercheurs de libérer facilement des complexes assemblés en petits microvolumes pour l’analyse en microscopie électronique et en spectrométrie de masse. Dans cette démonstration, nous avons suivi la cinétique des réarrangements structurels induits par le pH du complexe de toxine de l’anthrax et vérifié ces réarrangements par des méthodes de microscopie électronique et de spectrométrie de masse, tout en évitant l’agrégation. Alexandra Machen et Pierce O’Neil, étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de l’assemblage de la toxine anthrax à la surface du biocapteur BLI, de la libération de macro-échantillons et de la coloration EM négative.

Le Dr Antonio Artigues joue un rôle déterminant dans l’analyse et l’identification des microéchantillons libérés par BLI, à l’aide du spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos. Pour commencer, hydratez une pointe de biocapteur BLI réactive aux amines de deuxième génération en l’immergeant dans 250 microlitres d’eau et incubez-la pendant 10 minutes. Dans le logiciel Blitz, programmez les temps de pas comme indiqué dans ce tableau.

Commencez le cycle BLI en immergeant la pointe du biocapteur dans 250 microlitres d’eau pendant 30 secondes pour mesurer une base initiale de l’épaisseur et de la densité du biocapteur. Ensuite, activez le biocapteur en immergeant l’embout dans 250 millilitres de NHS de 50 millimolaires et d’EDC de 200 millimolaires pendant sept minutes. Ensuite, plongez le biocapteur activé dans 50 millimolaires de PDEA dissous dans un tampon de borate 0,1 molaire, pH 8,5, pendant cinq minutes pour générer une surface bioréactive activée.

Maintenant, plongez le biocapteur bioréactif activé dans 250 microlitres d’une solution contenant 100 nanomolaires d’E126C LFn dans 10 millimolaires d’acétate de sodium pH cinq, 100 millimolaires de chlorure de sodium tampon pendant cinq minutes. Plongez l’embout LFn dans 50 millimolaires de L-cystéine, 1 molaire de chlorure de sodium, 0,1 molaire d’acétate de sodium pH cinq pendant quatre minutes pour éteindre tous les groupes thiol-réactifs libres restants. Après avoir immergé l’embout LFn trempé dans du Tris de 50 millimolaires, du chlorure de sodium de 50 millimolaires pour établir une base tampon, immergez l’embout dans un prépore d’antigène protecteur de 0,5 micromolaire, un Tris de 50 millimolaires, un chlorure de sodium de 50 millimolaires pendant cinq minutes pour créer le complexe de prépores de LFn PA.

Une fois que le PA-prépore est associé, retirez l’embout de la solution de PA-prépore et plongez l’embout dans 50 millimolaires de Tris, 50 millimolaires de chlorure de sodium pendant 30 secondes pour éliminer tout PA-prépore non spécifiquement lié. Immergez le complexe LFn PA-prépore dans 0,5 CMG2 micromolaire dans 50 millimolaires de Tris, 50 millimolaires de chlorure de sodium pendant cinq minutes. Plongez le complexe LFn PA-prepore CMG2 dans 50 millimolaires de Tris, 50 millimolaires de chlorure de sodium pendant 30 secondes pour éliminer tout CMG2 non lié afin de former un complexe pré-endosomal.

Pour l’analyse EM, libérez le complexe LFn PA-prépore CMG2 de l’extrémité du biocapteur en immergeant l’extrémité dans un tube PCR contenant cinq microlitres de DTT 50 millimolaires, 50 Tris millimolaires et 50 millimolaires de chlorure de sodium. Pour l’analyse MS en tandem des peptides du complexe, libérez le complexe LFn PA-prepore CMG2 de l’extrémité du biocapteur en immergeant le biocapteur dans un tube PCR contenant cinq microlitres de DTT de 50 millimolaires, six molaires de chlorhydrate de guanidine sans kératine et 25 millimolaires de bicarbonate d’ammonium, pH huit. Pour visualiser le complexe après la transition du pH, assemblez le complexe LFn PA-prepore CMG2 sur le biocapteur, comme nous venons de le démontrer.

Immergez l’extrémité du biocapteur dans un acétate d’acétate de 10 millimolaires pH cinq pendant cinq minutes pour initier la transition du prépore PA au pore PA. Cette transition est indiquée par une amplitude croissante, suivie d’une diminution d’amplitude plus importante qui est supposée être substantielle pour la dissociation complète du récepteur en raison d’une affinité de liaison diminuée. Pour l’analyse EM, plongez l’extrémité du biocapteur dans une solution contenant 1,25 micelles millimolaires pendant cinq minutes, afin d’éviter l’agrégation dans la solution après libération de disulfure.

Pour effectuer une microscopie électronique à coloration négative, commencez par décharger une grille en cuivre 300 recouverte de carbone à une pression atmosphérique stable de 0,38 millibar et à moins 15 milliampères pendant 20 secondes, puis ventilez l’appareil avec de l’air. Fixez la grille entre une pince à épiler propre. Ensuite, pipetez quatre microlitres d’échantillon complexe libéré sur la grille et laissez l’adsorption pendant 60 secondes.

À l’aide d’une cale de papier filtre, évacuez le liquide restant. Ensuite, colorez la grille en pipetant cinq microlitres de formiate d’uranyle filtré à 0,75 % zéro à deux microns dessus et après cinq secondes, évacuez l’excès de tache. Laissez la grille sécher à température ambiante pendant qu’elle est couverte.

Utilisez ensuite le microscope électronique à transmission pour visualiser l’échantillon. Enfin, après avoir préparé les échantillons pour la spectrométrie de masse conformément au protocole texte, faire fonctionner le spectromètre de masse à l’aide d’un CID et d’une énergie de collision normalisée de 35 sous contrôle automatique pour effectuer en continu un balayage MS, suivi d’autant de balayages MS-MS en tandem que possible sur une période de trois secondes. Le tracé du sensogramme BLI est une lecture en temps réel des changements d’amplitude dus à l’ajout spécifique de composants de la toxine de l’anthrax.

La première montée est le chargement LFn sur la pointe. Après la trempe et la ligne de base, le prépore de PA se lie à LFn, suivi de l’ajout de CMG2 soluble, ce qui donne le complexe pré-endosomal assemblé. Le complexe est ensuite soumis à un faible pH qui affaiblit la liaison du récepteur et entraîne la transition du prépore vers sa confirmation de pores étendus qui est confirmée par l’ajout de micelles.

On voit ici des images EM de coloration négative de complexes lors de la libération du biocapteur. Les grilles d’échantillons pré-endosomiques ont montré des densités compatibles avec des complexes ternaires intacts constitués de LFn PA-prépore CMG2. Les grilles complexes de post-acidification montrent que le PA est passé au pore et solubilisé par inclusion micellaire sans densité évidente de CMG2.

Comme l’a montré la MS, qui a confirmé les complexes protéiques, les échantillons de MS pré-endosomale contenaient des peptides des trois composants de la toxine avec une couverture de 60,46, 67,97 et 54,15 % pour LFn, PA et CMG2 respectivement. Les échantillons post-endosomaux ne contenaient que des peptides de LFn et de PA. L’absence de CMG2 est cohérente avec la diminution nanométrique observée de BLI lors de la formation des pores. La capacité de surveiller et de valider l’assemblage de complexes de grandes macromolécules est une étape cruciale vers la compréhension de la spécificité et de la fonctionnalité des grands assemblages biomoléculaires.

Notre capacité à libérer des complexes macromoléculaires pré-assemblés à partir de biocapteurs dans des microvolumes pour la visualisation en microscopie électronique sera extrêmement utile pour l’analyse de la structure. Notre analyse de la composition des complexes d’assemblage de biocapteurs n’a utilisé que 0,04 femtomole du complexe de libération pour identifier ses composants avant et après l’acidification endosomale assimilée. Le protocole de libération de l’assemblage du biocapteur peut être adapté pour suivre les transitions endosomiques naturelles mais insaisissables induites par le pH d’autres toxines bactériennes dans les structures protéiques virales, avec l’avantage supplémentaire d’éviter l’agrégation des protéines.