Applications microfluidiques pour Diagnostics jetables

Je m’appelle Catherine CloudBridge et je suis professeure en fabrication, en ingénierie et en génie biomédical à l’Université de Boston. Et je suis le directeur du Laboratoire des microdispositifs biomédicaux et des microenvironnements. Nous travaillons principalement à la fabrication de diagnostics jetables pour des applications dans des environnements à ressources limitées.

Nous utilisons donc la microfluidique pour fabriquer ces dispositifs. Nous nous intéressons en fait à deux domaines d’études. Nous nous intéressons principalement à la façon dont les biomolécules et les cellules interagissent avec les surfaces des plastiques, des polymères.

C’est notre principal parapluie. Ce travail s’incarne dans les applications microfluidiques pour les diagnostics jetables. Donc, en laboratoire, ce que nous fabriquons, ce sont des dispositifs microfluidiques.

Dans les matériaux thermoplastiques que nous n’utilisons pas, nous utilisons généralement le PDMS, qui est le matériau caoutchouteux que la plupart des gens utilisent pour fabriquer de la microfluidique en laboratoire. Nous fabriquons nos appareils en thermoplastiques. Nous sommes intéressés à utiliser ces dispositifs thermoplastiques pour faire de la biologie moléculaire à l’échelle microscopique de manière à ce que cette biologie moléculaire puisse être faite sur le terrain, loin d’un laboratoire centralisé.

Comment cela fonctionne, dans le laboratoire, c’est que nous fabriquons de petites cartes en plastique et à l’intérieur de ces petites cartes en plastique se trouvent des colonnes d’extraction en phase solide, des colonnes de lyse cellulaire ou des colonnes de mélange. Nous effectuons également une réaction en chaîne par polymérase sur la puce comme technique de détection. Toutes ces choses sont intégrées dans un petit appareil qui, finalement, dans les perspectives à long terme de la recherche, finirait par être un appareil intégré qui pourrait être tenu à la main et exécuté sur le terrain ou dans des environnements où un laboratoire à grande échelle avec tous les centres de fusion et de chauffage présents, des incubateurs et ainsi de suite ne serait pas disponible.

Nous aimerions donc pouvoir idéalement commencer avec un échantillon humain comme du sang, de l’urine, des selles ou un écouvillon nasopharyngé, par exemple, qui serait du mucus. Et puis, à la sortie de la puce, ayez une réponse, oui ou non, quelqu’un est infecté par un micro-organisme particulier. Et la façon dont nous le faisons est de rechercher l’ADN de cet ARN particulier, en fonction du micro-organisme de ce micro-organisme particulier dans l’échantillon du patient.

Les défis techniques qui se posent se situent donc en grande partie du côté de la préparation des échantillons de cette équation. Ainsi, lorsque vous commencez avec du sang, des selles ou de l’urine, vous devez vous retrouver dans une situation où vous avez un échantillon humain salissant avec beaucoup de particules potentiellement dedans ou des inhibiteurs de la PCR ou d’autres techniques d’amplification. Et vous voulez finir avec un échantillon très propre et éludé d’acides nucléiques que vous pouvez ensuite utiliser pour amplifier ou rechercher un ADN ou un ARN particulier qui vous dira si un micro-organisme que vous recherchez était là.

Donc, pour nettoyer ces échantillons, vous devez faire quelques choses. Tout d’abord, vous devez filtrer l’échantillon, ce qui, selon l’échantillon, peut impliquer une filtration de cours ou une étape de rotation rapide avant que l’échantillon ne soit placé sur la puce. C’est pourquoi nous essayons toujours de commencer par les échantillons au fur et à mesure qu’ils proviennent du clinicien.

Donc, avec l’urine, les selles et les écouvillons nasopharyngés, notre objectif est que le clinicien fasse son travail comme il le ferait normalement et prélève l’échantillon comme il le ferait normalement. Ensuite, nous prenons cet échantillon et le mettons sur les puces. Donc, si une autre filtration doit avoir lieu à cette étape, cette filtration se produirait dans la puce.

La deuxième étape implique, parce que nous faisons des tests moléculaires, nous devons lyser les cellules et les micro-organismes qui se trouvent dans cet échantillon. Nous effectuons donc une étape de lyse, qui consiste généralement à forcer l’échantillon à passer à travers un filtre de petite taille de pore. Parfois, ce filtre contient également des nanoparticules comme des nanotubes de carbone, qui ont des arêtes vives, qui peuvent être utilisées pour déchirer certains des organismes qui ont des parois cellulaires plus robustes comme C difficile, qui est une bactérie à Gram positif avec laquelle nous travaillons, qui est très difficile à lys.

Nous devons donc avoir des colonnes de lyse plus robustes. Mais généralement, nous effectuons une lyse chimique et mécanique combinée à l’intérieur de la puce. Après cela, notre objectif est de prendre le lysat, puis d’extraire les acides nucléiques purifiés.

Donc, nous passons la lyse, nous passons le lysat sur une colonne d’extraction en phase solide qui résonne dans la puce microfluidique. Et cette colonne d’extraction en phase solide est faite de plastique et elle est fabriquée à l’aide de la chimie photo-initiée à l’intérieur du canal microfluidique après qu’elle ait déjà été fabriquée. Et il est également imprégné de particules de silice, généralement parce que nous voulons lier et libérer des acides nucléiques.

Dans certains cas, nous avons incorporé des billes d’oligo-DT si nous voulons nous lier et libérer de l’ARNm de manière spécifique, par exemple, ou des billes qui contiennent des anticorps particuliers, si nous voulons nous lier et libérer des protéines particulières. Et nous pouvons créer des colonnes d’extraction qui font toutes ces choses. Mais aujourd’hui, nous allons vous montrer comment faire la colonne d’extraction sase avec les billes de silice.

Donc, après avoir fait cela, passez le lysat sur la colonne de silice, cela fonctionne exactement comme un kit kyogen fonctionnerait dans un laboratoire à grande échelle. Nous nous lavons ensuite pour nous débarrasser de toutes les autres choses que nous ne voulons pas, de tous les glucides et des lipides et d’autres choses dans le lysat cellulaire et dans le reste de l’échantillon humain que nous ne voulons pas. Et puis à la toute fin, nous faisons allusion à l’eau.

Et ce qui est bien avec ces colonnes d’extraction en phase solide à l’échelle microscopique, c’est que nous pouvons éluer avec une très petite quantité d’eau, généralement de l’ordre d’un à cinq microlitres. Et nous récupérons presque tous les acides nucléiques que nous avons ajoutés. Nous avons un taux d’efficacité d’environ 70 à 90 % et les 10 premiers microlitres que nous récupérons de ce canal.

Donc, si nous lavons deux fois avec deux à 10 microlitres, nous récupérons presque tous les acides nucléiques que nous y avons mis. Il ne s’agit donc pas seulement d’un échantillon propre capable d’être soumis à la PCR, mais aussi d’un échantillon beaucoup plus concentré que ce que vous pourriez obtenir avec un kit de paillasse standard. L’objectif final de toutes ces techniques de préparation d’échantillons est donc de faire des choses qui sont compatibles avec certains des autres travaux que les gens ont effectués.

Très beau travail sur le terrain montrant que l’on peut faire de l’amplification PCR sur une puce. Vous pouvez effectuer la réaction de transcriptase inverse sur une puce si vous avez affaire à un virus à ARN ou si vous voulez faire une expérience d’expression génique. Nos techniques de préparation d’échantillons peuvent être directement couplées à la PCR sur une puce, de sorte que vous n’auriez pas à effectuer ce nettoyage et cette préparation d’échantillons sur le banc.

Et, et, et aussi l’étape de concentration que vous devriez faire afin d’obtenir les petits volumes nécessaires pour faire de la PCR multiplexée sur une petite puce. Ainsi, les expériences que nous allons vous montrer aujourd’hui montrent comment nous assemblons la puce microfluidique, qui est fabriquée en thermoplastique et non en PDMS. Cela nécessite donc un processus de fabrication un peu différent de celui généralement utilisé, la façon dont ces copeaux sont scellés.

Et puis comment nous faisons la chimie initiée par la lumière à l’intérieur de la puce pour fabriquer les monolithes de polymère qui sont utilisés à la fois pour la lyse cellulaire et pour l’extraction en phase solide. Et à la fin de ce processus, qui sont actuellement des processus modulaires en laboratoire, mais qui peuvent être intégrés et qui l’ont été, vous obtenez à la fin un échantillon hautement concentré d’acides nucléiques, d’ARN et d’ADN dans l’eau, qui peut ensuite être transféré en aval à un module de PCR ou à un autre module d’amplification où l’identification d’un micro-organisme ou d’une infection peut se produire. Nous avons donc une subvention sur laquelle nous travaillons en ce moment où nous avons commencé à collecter des échantillons humains du Boston Medical Center sur des patients qui peuvent ou non être infectés par la grippe A.So comme c’est la saison de la grippe, ce sont les échantillons que nous collectons.

Et puis en laboratoire, nous effectuons les tests de référence pour déterminer si une personne est infectée ou non par la grippe A, ce qui est essentiellement un test de culture, qui prend plusieurs jours à réaliser. Et parallèlement à cela, nous transmettons ces échantillons dans nos modules de notre puce. Nous les faisons donc passer dans la colonne de lyse, nous les faisons passer dans la colonne d’extraction en phase solide, puis nous effectuons la PCR pour voir si nous nous en sortons bien par rapport aux méthodes de référence.

C’est donc l’étape où nous en sommes en ce moment. Si ces expériences se concrétisent, je pense qu’au cours des quatre à six prochaines années, peut-être que nous serons dans une situation où nous aurons une puce intégrée et un test complet pour la grippe A et où nous travaillerons également sur des échantillons de clostridium difficile et de selles. Et nous sommes, nous sommes, nous sommes également très proches d’avoir non seulement le dispositif intégré, mais aussi le test intégré.

Ainsi, le développement du test et la conception de la puce doivent se faire main dans la main. Donc, pour une application particulière, se rendre au chevet du patient, c’est vraiment un processus axé sur la cible. Vous devez connaître, vous savez, l’échantillon avec lequel vous commencez et le micro-organisme que vous recherchez afin d’optimiser la puce pour une utilisation au chevet du patient.

Donc, je ne pense pas que nous soyons si loin de faire en sorte que cela se produise à la manière d’un prototype. Ce sont nos objectifs finaux, alors j’espère que nous y arriverons.