Applications microfluidiques pour Diagnostics jetables

Je m'appelle Catherine CloudBridge et je suis professeure en fabrication, génie et génie biomédical à l'Université de Boston. Je suis également directrice du laboratoire des microdispositifs et microenvironnements biomédicaux. Nous travaillons principalement sur la création de diagnostics jetables destinés à des applications dans des contextes à ressources limitées.

Nous utilisons donc la microfluidique pour fabriquer ces dispositifs. Nous nous intéressons en réalité à deux domaines d'étude. Principalement, nous souhaitons examiner comment les biomolécules et les cellules interagissent avec les surfaces en polymères plastiques.

Voilà notre principal domaine d'application. Ce travail se concrétise dans des applications microfluidiques destinées aux diagnostics jetables. Ainsi, dans le laboratoire, nous concevons des dispositifs microfluidiques.

Dans les matériaux thermoplastiques, nous n'utilisons pas, contrairement à l'habitude, le PDMS, qui est le matériau caoutchouteux que la plupart des personnes utilisent pour fabriquer des dispositifs microfluidiques en laboratoire. Nous réalisons nos dispositifs à partir de thermoplastiques. Nous souhaitons utiliser ces dispositifs thermoplastiques pour effectuer de la biologie moléculaire à l'échelle microscopique, de manière à ce que cette biologie moléculaire puisse être réalisée sur le terrain, loin d'un laboratoire centralisé.

Ce que cela donne en pratique dans le laboratoire, c’est que nous fabriquons de petites cartes en plastique, et à l’intérieur de ces cartes se trouvent des colonnes d’extraction en phase solide, des colonnes de lyse cellulaire ou des colonnes de mélange. Nous réalisons également la réaction en chaîne par polymérase sur la puce comme technique de détection. Toutes ces fonctions sont intégrées dans un petit dispositif qui, à long terme, dans la perspective de cette recherche, deviendrait un appareil intégré pouvant être manipulé à la main et utilisé sur le terrain ou dans des environnements où un laboratoire de grande envergure, avec toutes les centrifugeuses, les incubateurs chauffants et autres équipements associés, ne serait pas disponible.

Nous aimerions donc pouvoir idéalement commencer avec un échantillon humain, comme du sang, de l’urine, des selles ou un prélèvement nasopharyngé, par exemple, qui correspondrait à du mucus. Ensuite, en sortie de la puce, obtenir une réponse claire indiquant oui ou non si une personne est infectée par un microorganisme particulier. Pour ce faire, nous recherchons l’ADN ou l’ARN de ce microorganisme spécifique, selon le type de microorganisme, dans l’échantillon du patient.

Ainsi, les défis techniques qui se posent sont principalement liés à la préparation de l'échantillon dans cette équation. Lorsque vous partez de sang, de selles ou d'urine, vous devez passer d'une situation où vous avez un échantillon humain complexe, contenant potentiellement de nombreuses particules ou des inhibiteurs de la PCR ou d'autres techniques d'amplification. Et vous souhaitez aboutir à un échantillon d'acides nucléiques très purifié que vous pourrez ensuite utiliser pour amplifier ou rechercher un ADN ou ARN particulier, vous indiquant ainsi si l'organisme microbien recherché était présent.

Ainsi, afin de purifier ces échantillons, vous devez effectuer plusieurs étapes. Premièrement, vous devez filtrer l'échantillon, ce qui, selon le type d'échantillon, peut impliquer une filtration grossière ou une courte centrifugation avant son dépôt sur la puce. Nous essayons donc toujours de commencer avec les échantillons tels qu'ils proviennent du clinicien.

Ainsi, avec les échantillons d'urine, de selles et les prélèvements nasopharyngés, notre objectif est simplement que le clinicien accomplisse son travail comme il le fait habituellement et effectue le prélèvement de la manière habituelle. Ensuite, nous prenons cet échantillon et le déposons sur les puces. Si une filtration supplémentaire est nécessaire à cette étape, elle s'effectuera alors dans la puce.

La deuxième étape consiste, puisque nous effectuons des tests moléculaires, à lyser les cellules et les micro-organismes présents dans cet échantillon. Nous réalisons donc une étape de lyse, qui consiste généralement à forcer l'échantillon à traverser un filtre doté de pores de petite taille. Parfois, ce filtre contient également des nanoparticules telles que des nanotubes de carbone, possédant des bords tranchants capables de déchirer certains organismes dotés de parois cellulaires plus robustes, comme C difficile, une bactérie à Gram positif avec laquelle nous travaillons et qui est très difficile à lysér.

Nous devons donc disposer de colonnes de lyse plus robustes. Mais généralement, nous effectuons une lyse chimique et mécanique combinée à l’intérieur de la puce. Après cela, notre objectif consiste à prélever le lysat, puis à extraire les acides nucléiques purifiés.

Nous faisons donc passer la lyse, nous faisons passer le lysat sur une colonne d'extraction en phase solide qui est intégrée à la puce microfluidique. Cette colonne d'extraction en phase solide est constituée de plastique et est fabriquée à l’aide d’une chimie initiée par la lumière à l’intérieur du canal microfluidique, une fois celui-ci assemblé. Elle est également imprégnée de particules de silice, généralement, car nous souhaitons capter et libérer les acides nucléiques.

Dans certains cas, nous avons intégré des billes oligo DT si nous souhaitons lier et libérer spécifiquement l'ARNm, par exemple, ou des billes portant des anticorps particuliers, si nous voulons lier et libérer des protéines spécifiques. Et nous pouvons fabriquer des colonnes d'extraction capables d'effectuer toutes ces opérations. Mais aujourd'hui, nous allons vous montrer comment fabriquer la colonne d'extraction sase avec les billes de silice.

Après avoir effectué cette étape, faites passer le lysat sur une colonne de silice, ce qui fonctionne exactement comme un kit kyogénique fonctionnerait à l'échelle macroscopique en laboratoire. Nous procédons ensuite à des lavages pour éliminer tous les éléments indésirables, tels que les glucides, les lipides et autres composants présents dans le lysat cellulaire et dans le reste de l'échantillon humain que nous ne souhaitons pas conserver. Enfin, à la toute dernière étape, nous élutions avec de l'eau.

Ce qui est intéressant avec ces colonnes d'extraction en phase solide à l'échelle microscopique est que nous pouvons éluer avec une très petite quantité d'eau, généralement de l'ordre d'un à cinq microlitres. Nous récupérons ainsi presque tous les acides nucléiques que nous avons introduits. Nous obtenons un rendement d’environ 70 à 90 % dans les premiers 10 microlitres récupérés à partir de ce canal.

Ainsi, si nous effectuons deux lavages avec deux à dix microlitres, nous récupérons presque tous les acides nucléiques que nous avions déposés. Il ne s'agit donc pas seulement d'un échantillon purifié compatible avec la PCR, mais aussi d'un échantillon beaucoup plus concentré que ce que l'on pourrait obtenir avec un kit standard de laboratoire. L'objectif final de toutes ces techniques de préparation d'échantillons est de produire des échantillons compatibles avec d'autres travaux déjà réalisés par la communauté scientifique.

Très bon travail sur le terrain démontrant que l'on peut réaliser une amplification par PCR sur une puce. On peut effectuer la réaction de transcriptase inverse sur une puce lorsqu'on travaille avec un virus à ARN ou lorsqu'on souhaite réaliser une expérience d'expression génique. Nos techniques de préparation d'échantillons peuvent être directement couplées à la PCR sur puce, de sorte qu'il n'est pas nécessaire d'effectuer de nettoyage ni de préparation d'échantillons au laboratoire.

Et, en outre, l’étape de concentration que vous devriez effectuer afin d’obtenir les petits volumes nécessaires pour réaliser une PCR multiplexée sur une petite puce. Ainsi, les expériences que nous allons vous montrer aujourd’hui illustrent comment nous assemblons la puce microfluidique, fabriquée en thermoplastique et non en PDMS. Cela nécessite un procédé de fabrication légèrement différent de celui habituellement utilisé, ainsi que des méthodes spécifiques pour sceller ces puces.

Ensuite, nous expliquons comment nous réalisons la chimie amorcée par la lumière à l’intérieur de la puce afin de former les monolites polymères utilisés à la fois pour la lyse cellulaire et pour l’extraction en phase solide. À l’issue de ce processus, qui comprend actuellement des étapes modulaires en laboratoire mais qui peuvent être intégrées — et ont déjà été intégrées — on obtient un échantillon fortement concentré d’acides nucléiques, ARN et ADN dans l’eau, pouvant ensuite être transféré vers un module PCR ou un autre module d’amplification permettant l’identification d’un microorganisme ou d’une infection. Nous disposons en effet actuellement d’une subvention dans le cadre de laquelle nous commençons à recueillir des échantillons humains provenant du Boston Medical Center, prélevés sur des patients potentiellement infectés ou non par la grippe A. Étant donné que nous sommes en période de grippe, ce sont les échantillons que nous collectons actuellement.

Ensuite, au laboratoire, nous effectuons les tests de référence pour déterminer si une personne est infectée par le virus de la grippe A, qui consiste essentiellement en un test de culture, prenant plusieurs jours à réaliser. Parallèlement, nous analysons ces échantillons à l’aide des modules de notre puces. Nous les faisons donc passer par la colonne de lyse, puis par la colonne d’extraction en phase solide, avant de réaliser la PCR afin d’évaluer notre performance par rapport aux méthodes de référence.

Nous en sommes donc là actuellement. Si ces expériences aboutissent, je pense que dans les quatre à six prochaines années, nous serons peut-être dans une situation où nous disposerons d'une puce intégrée et d'un test complet pour la grippe A, et nous travaillons également sur le *Clostridium difficile* et les échantillons de selles. Et nous sommes, nous sommes, nous sommes également très proches non seulement de l'intégration du dispositif, mais aussi de l'intégration du test.

Ainsi, le développement du test et la conception de la puce doivent aller de pair. Pour une application particulière destinée à un usage au chevet du patient, il s'agit en réalité d'un processus orienté vers un objectif précis. Vous devez connaître l'échantillon de départ ainsi que le micro-organisme que vous recherchez afin d'optimiser la puce pour une utilisation au chevet du patient.

Donc, je ne pense pas que nous soyons si loin que cela de pouvoir concrétiser cela sous forme de prototype. Ce sont là nos objectifs finaux, j'espère donc que nous y parviendrons.