Name: Expériences de relaxation RMN 15N pour l’étude de la dynamique structurelle des protéines de la picoseconde à la nanoseconde (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Apprenez les expériences de relaxation RMN 15N pour étudier la dynamique structurale des protéines de la picoseconde à la nanoseconde. Cette méthode permet d'analyser la flexibilité résidue par résidue.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocole pour la relaxation RMN 15N et les expériences hetNOE dans l’étude de la dynamique des protéines

Ce protocole décrit la mise en place d’expériences de relaxation RMN 15N par Lakomek et al.69 et Stief et al.70. Nous nous sommes concentrés sur les séquences d’impulsions RMN à l’aide d’un schéma de détection HSQC à sensibilité améliorée. Les expériences 15N R1 et R1ρ sont mises en œuvre comme décrit en détail par Stief et al.70, et l’expérience hetNOE est décrite par Lakomek et al.69.
Lors de la mise en place des expériences de relaxation RMN, le 15N R1ρ est le plus critique, car le choix d’une période de relaxation maximale trop longue ou d’une amplitude RF trop élevée du verrou de spin peut endommager la sonde. Pour la période de relaxation, il est souhaitable d’échantillonner la courbe de décroissance complète de manière égale de 100 % à 25 % d’intensité (par rapport à l’expérience de référence). Pour les protéines à relaxation lente, telles que les IDP, avec une longue 15N T2 fois, il ne sera souvent pas abordable d’échantillonner la courbe de décomposition dans sa pleine mesure, car le dépôt de puissance dans la sonde doit être limité.
Pour l’amplitude de radiofréquence (RF) de 15N, théoriquement, plus l’amplitude RF est élevée, νspin-lock, mieux c’est, car davantage de processus d’échange peuvent être recentrés . En règle générale, les processus d’échange plus lents que 1 / (2π νspin-lock ) peuvent être recentrés . Cependant, des limitations de puissance RF s’appliquent. Par exemple, dans notre main, nous ne dépasserions pas une période maximale de verrouillage de spin de 65 ms lorsqu’une amplitude RF de 2 kHz est appliquée pour rester du bon côté. Dans le même temps, l’amplitude RF à verrouillage de spin-lock d’un spectromètre de 600 MHz devrait être supérieure à 1 kHz, par exemple 1,4 kHz à 600 MHz, ce qui s’est avéré suffisant pour la petite protéine globulaire gb369. Pour couvrir les largeurs spectrales et éviter les effets de dés-résonance à des intensités de champ plus élevées, l’amplitude RF correspondante doit s’adapter au champ magnétique, par exemple, 1,5 fois plus élevée à 900 MHz (νspin-lock <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67088/67088eq03.jpg" style="margin: auto;"> 2 kHz). Cependant, il doit rester dans les limites de la sonde. (Reportez-vous à la liste locale des limitations de puissance du spectromètre et contactez votre responsable de l’installation RMN pour obtenir des conseils.)
Pour le choix de l’espacement des retards de relaxation entre l’expérience de référence (retard court-circuité) et la période de retard la plus longue (déterminée par les facteurs discutés ci-dessus), nous préférons un espacement égal des points de données du retard de relaxation et choisissons un nombre de 8 (si le temps de mesure alloué et le rapport signal/bruit le permettent). La première augmentation (et les suivantes) sera dominée par les résidus les plus intenses (et souvent les plus lents à se détendre). Par conséquent, en fonction de la plage dynamique de la protéine, les signaux RMN de plusieurs résidus dans la séquence protéique peuvent déjà avoir défailli après la période de relaxation maximale choisie. En espaçant uniformément les points de retard, nous nous assurons que les courbes de relaxation des résidus de relaxation rapide seront également couvertes par un nombre suffisant de points de données échantillonnant la courbe de relaxation.
De plus, un bon choix de délai de récupération est essentiel pour obtenir des données de relaxation précises et éviter des dommages à long terme à la sonde. Nous choisissons un délai de récupération d’au moins D1 = 2 s pour éviter tout dommage à la sonde. Pour des résultats précis, il faut également laisser suffisamment de temps aux protéines de polarisationlongitudinale 1 H et 15N pour revenir à l’équilibre ou au moins à un état stable et stable. Le 1H T1 varie généralement entre 1 s et 4 s à 600 MHz pour une protéine de petite ou moyenne taille (jusqu’à 20 kDa) ; pour les protéines plus grandes et les champs plus élevés, le 1H T1 augmentera encore. Pour la petite protéine globulaire gb3, nous avons trouvé D1 = 3,5 s suffisant pour les expériences 15N R1 et R1ρ . Pour le petit IDP Syb-2 présenté dans ce protocole, nous avons récemment montré que D1 = 2 s était adéquat70.
Le 15N hetNOE a la sensibilité la plus faible, car l’excitation commence sur 15N, et aucun 1 H-15N INEPT au début de la séquence d’impulsions n’est appliqué. De plus, la période de saturation de 1H et le délai de récupération de 15N doivent être de 5 fois 15N T1 pour obtenir des données précises. Alors que pour l’IDP Syb-2 présenté ici, un délai de saturation/récupération de 5 s plus un délai de récupération D1 supplémentaire de 2 s (total de 7 s) était suffisant, pour les protéines plus grandes et/ou les protéines deutérées, ce temps peut être considérablement plus long, par exemple, 10 s ou plus. Cependant, si les données qualitatives sont suffisamment bonnes, un léger décalage systématique peut être accepté. Dans ce cas, des résultats raisonnables peuvent être obtenus déjà à 3 fois 15N T1, car 95% de la saturation sera atteinte. Dans ce cas, les valeurs hetNOE résultantes montreront un décalage systématique vers des valeurs plus élevées.
Dans ce protocole, nous avons travaillé avec du Syb-2 15N entièrement protoné, ce qui est le plus rentable. La deutération en chaîne latérale est recommandée pour réduire le nombre de voies de relaxation et travailler avec les paires de spins amides de squelette 1 H-15N les plus isolées. Cependant, en comparant 15N2H Syb-2 et 15N syb-2, nous ne remarquons que très peu de différences entre les échantillons deutérés et entièrement protonés70. Pour des raisons pratiques, des données de relaxation RMN sont fréquemment enregistrées sur les échantillons marqués en double ou triple (15N13C ou 2H15N13C). Les séquences d’impulsions RMN discutées sont capables de recentrer l’évolution du couplage J entre 13C et 1noyau H ou 15N. De toute évidence, les voies de relaxation augmenteront également lorsque l’étiquetage 13C est introduit. Cependant, entre nos mains, à des fins pratiques, l’erreur introduite, le cas échéant, est inférieure à 5 % et pourrait être acceptable lorsque seules des données qualitatives sont nécessaires.
Lorsque l’on travaille avec des protéines de différentes tailles pour la détection, la question se pose souvent de savoir s’il faut choisir les expériences détectées par HSQC70 ou les expériences détectées par TROSY69. Pour les petites protéines, les expériences RMN détectées par HSQC offrent un gain deux fois plus élevé en rapport signal/bruit (à condition qu’une bonne suppression de l’eau puisse être obtenue). Pour les protéines plus grandes, les expériences détectées par TROSY l’emporteront. Le seuil de rentabilité est d’environ 20 kDa pour les protéines repliées. Pour les IDP, pour lesquels on peut obtenir de faibles constantes de vitesse R2 qui augmentent à peu près linéairement avec l’augmentation de la longueur de la chaîne, le seuil de rentabilité peut être déplacé vers des poids moléculaires plus élevés. Pour des raisons pratiques, nous recommandons de mettre en œuvre les expériences détectées par HSQC ou par TROSY en cas de doute. Ensuite, choisissez celui qui donne le meilleur rapport signal/bruit dans le premier incrément.
La discussion sur le choix des expériences détectées par HSQC ou TROSY ne s’applique que lorsque le rapport signal/bruit est le critère principal. Lorsque les plus petites largeurs de ligne et la résolution la plus élevée sont requises, TROSY l’emportera toujours. De plus, TROSY offre toujours la meilleure suppression de l’eau, car moins d’impulsions de protons et aucun découplage de protons ne sont nécessaires. Nous nous référons à l’article69 précédemment publié pour une discussion plus approfondie.
Une dernière remarque sur la question de la suppression de l’eau. Bien que le réglage du gain du récepteur (rg) à 16 puisse être suffisant sur les consoles Bruker Avance NEO, un gain du récepteur dans la plage de 128-256 est généralement souhaitable pour les consoles Bruker Avance (plus anciennes). Le rg réalisable (déterminé par la commande de Bruker rga) est souvent obtenu à partir de l’intensité du signal d’eau résiduel par rapport au niveau de bruit. Une mauvaise suppression de l’eau introduira toujours un bruit supplémentaire dans les spectres. Ainsi, même si un rg = 16 peut être atteint sur une console Bruker Avance NEO, le signal d’eau restant peut contribuer de manière substantielle au niveau de bruit. Par conséquent, le rapport signal/bruit serait réduit. Par conséquent, nous recommandons de viser un niveau de rg de 128-256. Les séquences d’impulsions présentées70 ont été testées à 600 MHz et 1200 MHz. Les deux intensités de champ fonctionnent avec la même configuration de gradient, comme indiqué dans la séquence d’impulsions. Nous les recommandons au moins comme un bon point de départ pour une optimisation ultérieure.
Comme mentionné dans l’introduction, les expériences de relaxation RMN discutées ne couvrent que la gamme de temps de la picoseconde à la nanoseconde. Pour un aperçu de la dynamique de la microseconde à la milliseconde, nous nous référons aux expériences de dispersion de relaxation, aux expériences CPMG et à une extension des expériences R1ρ avec des amplitudes de verrouillage de spin changeantes (ou fréquences porteuses) sont utilisées 44,46,58,59,60,61,85,86 . Des dynamiques inférieures à la microseconde peuvent être capturées 15N CEST (transfert de saturation par échange chimique)RMN 62, spectroscopie d’échange (EXSY, millisecondes à secondes) ou RMN RT (temps réel) (secondes à heures)63,64. L’effet PRE (paramagnetic relaxation enhancement) des sondes paramagnétiques, ainsi que des couplages dipolaires résiduels (RDC), peut être utilisé pour évaluer toute la gamme de dynamiques ps à ms 65,66,67,68.
Toutes ces expériences ne couvrent que la dynamique de base. Pour étudier la dynamique de la chaîne latérale, Kay et ses collègues ont introduit une autre pléthore d’expériences de RMN, fournissant des informations sur la dynamique de la chaîne latérale pour les protéines jusqu’à 1 MDa 2,87.
Pour obtenir des informations plus quantitatives sur la dynamique du squelette protéique, une analyse combinée des trois paramètres RMN, 15N R1, R2 et hetNOE, est nécessaire - impliquant parfois encore plus de paramètres, tels que des constantes de taux de relaxation corrélées croisées. Différentes méthodes d’analyse sophistiquées ont été développées. L’approche dite sans modèle a été largement appliquée dans la RMN biomoléculaire 43,88,89,90,91. De plus, la cartographie de la densité spectrale peut fournir des informations précieuses 55,92,93. Bien qu’il s’agisse de méthodes d’analyse puissantes pour les protéines globulaires avec un temps de corrélation rotationnelle bien défini, leur applicabilité est limitée pour les IDP. Un domaine plié est nécessaire pour définir un temps de corrélation de rotation39. Cela peut être partiellement contourné lorsque la fonction de corrélation C(t) peut être modélisée par la somme des fonctions décroissantes exponentiellement dans le cas où les différentes échelles de temps impliquées peuvent être bien séparées 23,31,84. En l’absence d’un temps de corrélation de rotation bien défini, d’autres approches impliquant une distribution des temps de corrélation, par exemple l’analyse IMPACT94 ou l’analyse DETECTOR95,96, sont une alternative. De plus, une analyse combinée des données de relaxation RMN et des simulations MD est également prometteuse pour les IDP97 ; actuellement, nous sommes toujours confrontés à des limitations d’échantillonnage et de champ de force pour les simulations d’atomes entiers de plus grands IDP31,98.

<table><tbody><tr><td>Spectromètre Bruker 600 MHz AVANCE III HD&nbsp ;</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html</td><td>expériences RMN menées&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

expériences de relaxation rmn 15n pour l’étude de la dynamique structurelle des protéines de la picoseconde à la nanoseconde

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

Expériences de relaxation RMN 15N pour l’étude de la dynamique structurelle des protéines de la picoseconde à la nanoseconde

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

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