Une méthode efficace d’extraction de l’épithélium de la trompe de Fallope humaine pour des analyses de cellules uniques

Notre objectif de recherche est de comprendre et de combattre la résistance à la chimiothérapie dans les cancers de l’ovaire. Notre objectif est de découvrir les mécanismes et les sous-populations cellulaires à l’origine de la résistance et de nouvelles cibles pour éradiquer ces populations agressives.

Le séquençage de l’ARN unicellulaire facilite la caractérisation des sous-populations dans les tumeurs ovariennes hétérogènes. Nous exploitons les cellules épithéliales non cancéreuses des trompes de Fallope comme cellule d’origine normale pour les analyses du cancer de l’ovaire.

L’isolement efficace des cellules épithéliales des trompes de Fallope dans une suspension unicellulaire enrichie aidera à mieux comprendre l’initiation du cancer de l’ovaire séreux de haut grade. Cette technique de digestion mécanique et enzymatique offre un processus plus efficace pour extraire une suspension unicellulaire enrichie de cellules épithéliales viables des trompes de Fallope.

[Narrateur] Pour commencer, prélevez des trompes de Fallope humaines fraîches dans un tube de 15 ou 50 millilitres contenant un milieu de dissociation et placez le tube sur de la glace. Transférez les trompes de Fallope dans une boîte de Pétri stérile contenant un milieu de dissociation frais et placez l’échantillon sous un microscope à dissection. Maintenant, à l’aide d’une pince à pointe fine et de ciseaux Vannas-Tübingen, disséquez la graisse, le tissu conjonctif et tous les vaisseaux entourant les tubes. Ensuite, coupez le plan coronal des trompes de Fallope avec des ciseaux pour former de petits cylindres de trois à cinq millimètres de diamètre. Utilisez une pince fine=point pour stabiliser le tissu pendant la coupe. Aspirez soigneusement le milieu de dissociation de la boîte contenant les morceaux de tissu. Lavez les morceaux de tissu deux fois avec deux millilitres de 1x PBS froid et tournez légèrement l’assiette. Après avoir aspiré le PBS, incubez les morceaux de tissu pendant cinq minutes dans de l’EDTA froid de cinq millimolaires à température ambiante. Mettez les fragments de tissu en suspension dans une solution saline équilibrée froide de Trypsin Hanks à 1 % et incubez à quatre degrés Celsius pendant 40 minutes. Aspirez la solution saline équilibrée de Trypsin Hanks à 1 % et lavez les morceaux de tissu deux fois dans un milieu de dissociation à froid pour inactiver la trypsine. Incuber les fragments de tissu dans deux millilitres de milieu de dissociation avec 0,4 milligramme de DNase pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Sous un microscope de dissection, alors que vous êtes encore dans un milieu DNase, tenez un fragment de la trompe de Fallope avec une pince de sorte que la lumière soit parallèle au fond de la boîte. Utilisez des pinces pour appuyer à plusieurs reprises sur le tissu afin d’expulser les cellules épithéliales de la lumière. Confirmez la libération d’un halo de cellules autour du tissu. Transférez les cellules contenant le milieu dans un tube stérile de 15 millilitres. Lavez la boîte de Pétri deux fois avec un milieu de dissociation et combinez les lavages dans le même tube. Jetez les fragments restants du tube stromal. Pour récolter les cellules, centrifugez-les à 500 g pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu de dissociation. Maintenant, mélangez 10 microlitres de suspension cellulaire avec un volume égal de bleu trypan. Pipetez 10 microlitres du mélange dans une lame de comptage en chambre et insérez-la dans un compteur de cellules pour déterminer le nombre de cellules. Remettre les cellules en suspension dans neuf millilitres de milieu de dissociation contenant de la collagénase de type un et de la DNase. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes dans un agitateur orbital réglé à 200 tr/min. Pour récolter les cellules, centrifugez à 500 g pendant cinq minutes. Après avoir aspiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu de dissociation pour éliminer la collagénase. Passez la suspension cellulaire à travers une crépine de 100 micromètres dans un tube de 50 millilitres et centrifugez le filtrat à 500 g pendant cinq minutes. Si la pastille cellulaire apparaît rouge, préparez un tampon de lyse des globules rouges pour lyser les globules rouges. Aspirez le milieu de la pastille, ajoutez cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges dilué et incubez l’échantillon sur de la glace pendant trois minutes. Pour arrêter la lyse des globules rouges, ajoutez 45 millilitres de 1x PBS dans le tube. Centrifugez le tube à 500g pendant cinq minutes. Après avoir récolté et remis en suspension les cellules dans un millilitre de milieu de dissociation, mélangez 10 microlitres de suspension cellulaire avec un volume égal de bleu de trypan. Pipetez 10 microlitres du mélange dans une lame de comptage de chambre et insérez-la dans le compteur de cellules. L’analyse par cytométrie en flux a confirmé l’isolement d’une population de cellules épithéliales viable et enrichie à partir de tissus de trompes de Fallope avec une viabilité moyenne de 82 %. Après l’extraction des cellules immunitaires CD45 positives, les cellules épithéliales positives à l’EpCAM représentaient en moyenne 80 % de l’échantillon, tandis que la contamination par les cellules stromales CD10 positives était minime à 7,8 %. Des cellules épithéliales isolées ont formé des amas adhérents ressemblant à des galets en culture 2D après quatre à six jours de placage, confirmant l’identité épithéliale. L’immunochimie a révélé que la plupart des cellules cultivées exprimaient EpCAM et PAX8 avec seulement quelques cellules positives à la vimentine. Des cellules ciliées étaient présentes en culture.