Extraction, marquage et purification de cellules spécifiques à la lignée à partir de follicules antraux humains

Le protocole démontré ici permet le marquage et l’isolement de lignées cellulaires spécifiques présentes dans les follicules ovariens dès les premiers stades antraux, permettant ainsi l’analyse et la culture à haute résolution. Cette approche très précise utilise des combinaisons d’anticorps conjugués fluorophores pour cibler les marqueurs de surface cellulaire qui sont exprimés de manière robuste et spécifique parmi les lignées discrètes de granulosa, de stroma et de thèque. Commencez par placer l’ovaire dans une boîte de Pétri stérile et versez-le un milieu réfrigéré pour hydrater le tissu, en veillant à ce que l’ovaire soit à moitié immergé dans le milieu.

Retirez les sutures ou tout autre matériau et disséquez les tissus environnants résiduels loin de l’ovaire. Pour isoler les follicules antraux, identifiez les follicules individuels et choisissez des follicules sains. Exclure tous les follicules remplis de sang, sombres ou non symétriques.

Isolez les follicules antraux choisis de l’ovaire à l’aide de scalpels, en gardant l’antre intact et en excisant le tissu cortical englobant le follicule. Placer chaque follicule antral intact excisé dans un puits sur la plaque des six puits. À l’aide d’une règle placée sous le plat, déterminez le diamètre du follicule à des fins descriptives.

À l’aide d’un scalpel, couper en deux le follicule antral intact pour évaluer la cavité antrale et ajouter six millilitres de milieu de détachement de cellules enzymatiques avant d’incuber la plaque dans un incubateur humidifié pendant 10 minutes. Après l’incubation, ajouter six millilitres de milieu disponible contenant 20% de sérum bovin fœtal, ou FBS, et rincer avec le milieu en pipetant vigoureusement répété sur les follicules coupés en deux avec une micropipette P-1000. Ensuite, collectez le milieu et passez-le à travers un filtre de 100 millimètres.

Après avoir centrifugé le surnageant filtré à 300 G et quatre degrés Celsius pendant trois minutes avant, aspirer le surnageant. Placer le reste du tissu dans un mélange de 100 unités par millilitre de collagénase et une unité par millilitre de dispase diluée dans une solution saline équilibrée avant 30 minutes d’incubation. perturber mécaniquement le tissu en triturant et en pipetant vigoureusement deux fois après 10 et 20 minutes.

Une fois cela fait, récupérez le tissu et rincez par pipetage, à travers une pointe de micropipette P-1000, et filtrez à travers un filtre de 100 millilitres. Centrifuger le tissu tendu à 300 G et quatre degrés Celsius pendant trois minutes avant de mettre la pastille cellulaire enrichie avec les cellules thèques et les cellules stroma sur de la glace pour le marquage et le FACS. Pour identifier les cellules de la granulosa et les cellules de thèque, remettre en suspension les pastilles cellulaires dans une solution de blocage contenant des anticorps directement conjugués et incuber à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après avoir lavé et centrifugé les cellules, remettre les cellules en suspension dans un tampon FACS contenant du 4-6 diamidino-2-phénylindole, ou DAPI, et faire passer la suspension cellulaire à travers un instrument FACS pour capturer une petite population de cellules, en utilisant l’intensité fluorescente des anticorps conjugués fluorophore pour le déclenchement. Couper en deux le reste de l’ovaire. Irriter la moelle à l’aide de ciseaux fins et de scalpels incurvés, évitant ainsi d’endommager le cortex ovarien.

Poursuivre le traitement et l’amincissement du cortex ovarien par grattage doux jusqu’à ce qu’il reste un minimum de moelle. Divisez le tissu cortical en bandes de deux à trois millimètres de large le long de la longueur de l’ovaire. Pour la congélation du tissu ovarien, placer une bandelette corticale dans chaque flacon cryogénique réfrigéré contenant la solution de congélation.

Agiter les flacons cryogéniques contenant les bandes corticales sur une plaque rotative pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Nucléer la formation de cristaux de glace en touchant chaque flacon cryogénique avec une pointe de coton brièvement immergée dans de l’azote liquide. Les cellules ovariennes ont été collectées et les fractions cellulaires ont été triées des follicules antraux FACS à plus de 95% de pureté.

Les cellules de granulosa CD99 spécifiquement marquées dans PVRL1, ou nectine, étaient de plus en plus localisées dans le compartiment cellulaire de l’oophorus granulosa à mesure que les follicules antraux augmentaient en taille. On a vu que les anticorps contre l’endogline ou CD55 délimitaient spécifiquement toutes les cellules stroma et thèques et que l’alanine aminopeptidase était spécifiquement exprimée par les cellules thèques androgènes. Les cellules ont été marquées avec un anticorps dirigé contre CD99 pour identifier les cellules de la granulosa et des anticorps contre CD45 ont été utilisés pour exclure les cellules hématopoïétiques.

Les anticorps dirigés contre PVRL1 ont séparé la population de cellules de la granulosa en compartiments oophorus et mural. Après digestion enzymatique avec la collagénase dispase, les préparations cellulaires marquées avec des anticorps contre CD55, CD34 et alanine aminopeptidase ont permis la capture de toutes les cellules stroma ou thèque ou androgènes thèques à l’exclusion des cellules endothéliales des populations de cellules thèques. Prenez particulièrement soin d’éviter de perturber l’antre des follicules lors de l’isolement initial du follicule en coupant dans une marge de sécurité autour des bordures du follicule.

En aval de cette procédure, les cellules peuvent être utilisées pour l’analyse moléculaire ou diagnostique ou bien cultivées in vitro pour des études toxicologiques, des analyses expérimentales ou la récapitulation du microenvironnement du follicule. À ce jour, ces méthodes ont été utilisées pour modéliser les troubles endocriniens impliquant l’ovaire et pour identifier de nouvelles sous-populations de cellules associées au follicule.