Génération 3D de tissu myocardique humain à l’aide de l’écriture électrofilée à l’état fondu d’échafaudages de polycaprolactone et de cellules cardiaques dérivées de hiPSC

Une méthode reproductible est présentée pour générer des tissus myocardiques 3D combinant l’écriture par électrofilage fondu (MEW), des échafaudages de polycaprolactone (PCL) et des hydrogels de fibrine avec des cardiomyocytes et des fibroblastes dérivés de hiPSC. Cette technique offre un contrôle précis de l’architecture de l’échafaudage et peut être appliquée dans les tests précliniques de médicaments et la modélisation des maladies cardiaques.

Cette étude vise à développer des tissus cardiaques biométriques 3D à l’aide d’échafaudages électriques fondus et de cellules cardiaques humaines dérivées d’iPSC afin d’améliorer la modélisation des maladies, les tests de médicaments et les applications de médecine régénérative. Les rapports induits par l’homme dans les cardiomyocytes de cellules souches restent immatures, ce qui limite leur fonctionnalité. De plus, il est difficile de reproduire la grande complexité requise pour modéliser le tissu cardiaque en 3D.

Ce modèle imite mieux le myocarde natif, permettant des interactions matricielles extracellulaires 3D complexes pour la modélisation des maladies, les tests de médicaments et les applications spécifiques aux patients. Il offre une alternative plus pertinente aux cultures 2D et aux modèles animaux. À l’avenir, nos recherches se concentreront sur l’étude de modèles de cardiomycologie, l’amélioration des protocoles de maturation tissulaire 3D et le développement de constructions plus grandes pour les thérapies précliniques de l’infarctus du myocarde dans de grands modèles animaux tels que les porcs.

Pour commencer, connectez la seringue à un tuyau d’alimentation en azote sous pression et introduisez-la à l’intérieur de la chambre de chauffe. Allumez l’équipement d’écriture électrofilage à fusion et réglez les régulateurs de température à 80 degrés Celsius pour la chambre et à 65 degrés Celsius pour la buse. Au bout de 30 minutes, déplacez la plaque collectrice jusqu’à ce que la tête d’impression soit positionnée sur un bord de la plaque ou à l’endroit souhaité.

Ajustez manuellement la distance entre la chambre de chauffe et la plaque collectrice à 10 millimètres dans le plan z. Fermez la porte de l’équipement, qui connecte automatiquement l’alimentation du champ électrique. Réglez la tension à sept kilovolts en pression d’azote à deux bars pour l’extrusion à travers la pointe de calibre 23.

Chargez le code G de conception dans le logiciel pour imprimer des échafaudages avec une géométrie de motif carré. Ajustez la vitesse du collecteur à 1080 millimètres par minute. Appuyez ensuite sur le bouton Démarrage du cycle pour lancer l’impression.

Une fois l’impression terminée, retirez délicatement l’échafaudage du collecteur. Découpez le treillis imprimé à l’aide d’un poinçon de six millimètres de diamètre pour obtenir les échafaudages finaux pour la fabrication de tissus. Traitez les échafaudages pendant cinq minutes avec du plasma d’oxygène.

Stérilisez les mailles en les immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 minutes. Lavez-les abondamment à l’eau distillée stérile pendant 30 minutes, puis laissez-les sécher. Après avoir détaché les cardiomyocytes iPSC humains, remettez en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de génération de tissu et comptez les cellules à l’aide de la chambre de Neubauer.

De même, après avoir détaché les fibroblastes cardiaques iPSC humains, remettez en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de génération de tissu et comptez les cellules. Mélangez le total des cellules nécessaires dans un nouveau tube et référez-vous au contenu comme Cell Mix. Et centrifuger à 300G pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, remettez le mélange cellulaire en suspension dans le volume requis de milieu de génération de tissus. Pour générer un mélange d’hydrogel, ajoutez le volume requis de fibrinogène dans le tube à température ambiante et mélangez soigneusement. Ensemencez le mélange d’hydrogel sur une surface en polytétrafluoroéthylène pour empêcher l’adhérence de la fibrine à la plaque.

Pipetez la moitié du volume du tissu, en le laissant sous forme de goutte. Placez un échafaudage en polycaprolactone, ou PCL, sur chaque goutte et ajoutez le volume restant sur l’échafaudage. Maintenant, ajoutez la quantité requise de thrombine et mélangez rapidement l’hydrogel, en évitant soigneusement les bulles.

Incuber les tissus à 37 degrés Celsius pendant une heure pour terminer la polymérisation de la fibrine. Prélevez délicatement chaque tissu par le bord à l’aide d’une pince à épiler stérile et transférez-le dans des plaques à 12 puits contenant un milieu de génération de tissu complété par de l’aprotinine. Incuber les tissus à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, rafraîchissez le milieu avec deux millilitres de milieu d’entretien des tissus, en éliminant les résidus de KSR et d’Y-27. L’ensemencement d’un mélange de huit à deux cardiomyocytes humains iPSC et de fibroblastes cardiaques iPSC humains dans des hydrogels de fibrine permet d’obtenir une distribution cellulaire uniforme à travers les pores de l’échafaudage dans l’heure qui suit la polymérisation. Les images d’immunofluorescence confocale ont montré une distribution cellulaire mixte des cellules à travers le tissu 3D interagissant avec l’échafaudage PCL avec une majorité de cardiomyocytes iPSC humains colorés pour l’actinine sarcomérique intercalés avec des fibroblastes cardiaques iPSC humains marqués à la vimentine.

Les cardiomyocytes iPSC humains présentent une structure de sarcomère bien organisée par la protéine actinine sarcomérique régulièrement espacée. Les cellules ont commencé à battre spontanément le deuxième jour avec une fréquence moyenne de battements de 30 battements par minute au septième jour, montrant une contraction stabilisée dans tout le maillage. Une baisse progressive a été observée au fil du temps, atteignant 17 BPM au jour 14.

Malgré cela, l’activité métabolique est restée stable entre le septième et le 14e jour, confirmant la viabilité cellulaire soutenue. Enfin, l’analyse des points de piste des tissus battants a montré une vitesse de contraction de 38 micromètres par seconde et une amplitude de contraction de 29 micromètres.