Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l'impression par microcontact

L’objectif de l’expérience suivante est de générer un tissu myocardique fonctionnel aligné par micro-impression par contact. Ceci est réalisé par la première impression par micro-contact de fibronectine sur des substrats de poly diméthylsiloxane. Dans un deuxième temps, double transgénique.

Les lignées de cellules souches embryonnaires sont différenciées in vitro et isolées au moyen d’un tri cellulaire activé par fluorescence, ce qui permet d’obtenir des populations hautement purifiées de progéniteurs fortement cardiogéniques. Ensuite, des progéniteurs cardiaques isolés sont ensemencés sur des substrats PDMS micro-brevetés pour les rendre malignes et prendre la forme d’un myocyte cardiaque. On obtient des résultats qui montrent l’isolement réussi et une croissance isotrope des progéniteurs cardiaques sur la base de faits et d’une analyse par immunofluorescence.

La génération d’un tissu myocardique isotrope peut aider à progresser dans les domaines de la biologie des cellules souches et de la bio-ingénierie tissulaire en soulevant la possibilité de développer une réanalyse cellulaire spécifique à une maladie pour le développement et la découverte de médicaments. Et en jetant les bases de la médecine régénérative cardiaque. Première protection IL, 180 4 élastomère de polydiméthyl alane à un rapport d’agent d’acuring de 10 pour un et bien mélanger.

Dégazez l’ensemble à l’aide d’un dessiccateur pour éliminer les bulles d’air. Versez le PDMS dans un master préalablement fabriqué avec des arêtes d’outil de 20 microns de large et deux crêtes de micron séparées par un espacement de 20 microns, puis durcissez pendant deux jours dans un dessèchement à température ambiante pour obtenir des tampons PDMS micro-texturés. Après avoir rendu les surfaces du tampon PDMS hydrophiles avec un nettoyant plasma.

Stérilisez les tampons avec de l’éthanol à 70 % pendant une minute. Dans une enceinte de sécurité biologique, sécher rapidement à l’air comprimé. Couvrez les surfaces stériles du tampon avec une solution de fibronectine à absorber pendant au moins 10 minutes après l’absorption.

Secouez la solution de fibronectine des tampons et séchez-les rapidement à l’air comprimé. Établissez un contact conforme entre le tampon et les lamelles de protection en verre enduit de PDMS préalablement préparées, comme décrit dans le protocole de texte, pendant deux minutes et appuyez fermement. Rincer les substrats à micromotifs avec de l’eau distillée.

Conservez-les dans de l’eau distillée pendant un maximum de deux semaines à quatre degrés Celsius, à moins qu’ils ne doivent être utilisés immédiatement. Enduisez six plaques de puits de gélatine stérile à 0,1 % dans de l’eau distillée et laissez-la absorber pendant 15 minutes 37 degrés Celsius Pendant ce temps, préparez les fibroblastes embryonnaires de souris à partir d’une aliquote en les ajoutant à 50 millilitres de PBS dans un tube conique. Centrifugez la méthamphétamine à 1000 tr/min pendant cinq minutes et mettez-les en suspension dans un support de méthamphétamine.

Une fois le temps d’incubation écoulé, aspirez l’excès de gélatine et ajoutez les mes dans les puits. Permettez un jour au MES de se fixer. Préparez les cellules souches embryonnaires ou cellules ES à partir d’une aliquote pensée en les ajoutant à 50 millilitres de PBS dans une centrifugeuse à tube conique.

Les cellules ES 1000 tr/min pendant cinq minutes et Resus les suspendent dans un milieu ESC. Ajoutez les cellules E ES dans les puits contenant les mythes et maintenez-les dans le milieu ESC jusqu’à ce que la confluence soit atteinte pour masser les cellules ES cofluentes. Aspirez d’abord le milieu ESC et lavez les cellules une fois avec du PBS stérile.

Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez 500 microlitres de voyages dans le puits. Incuber l’assiette pendant trois minutes et demie à 37 degrés Celsius. Pipetez la solution TRIPSIN de haut en bas plusieurs fois.

D’abord pour briser les colonies de cellules Ees. Neutralisez ensuite la solution tripsin en ajoutant 500 microlitres de milieu ESC dans le puits. Massez les cellules ES selon le rapport requis ici, les cellules ES E sont passées dans un rapport de un à 30, ce qui leur permet d’atteindre la confluence en trois jours.

Commencer la différenciation in vitro lorsque les cellules ES ont atteint la confluence. Enduisez d’abord des plats de culture de 10 centimètres de gélatine stérile à 0,1 % dans de l’eau distillée et laissez-le absorber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, récoltez les cellules ES comme précédemment.

Une fois les 15 minutes écoulées, aspirez tout excès de gélatine et ajoutez environ un tiers à la moitié de la suspension de cellules E ES dans des boîtes de culture contenant un milieu d’adaptation. Après avoir cultivé les cellules dans un milieu d’adaptation pendant deux jours, récoltez les cellules ES adaptées dans un tube conique de 50 millilitres contenant du PBS en utilisant 1,5 millilitre de trypsine. Centrifugez-les à 1000 tr/min pendant cinq minutes et mettez-les en suspension dans le milieu de différenciation.

Faites des corps embryonnaires ou EBS d’environ 1000 cellules par goutte de 10 microlitres de milieu de différenciation dans des boîtes de culture de 15 centimètres. À l’aide d’une pipette multicanaux, inversez les plaques et la culture. EBS suspend des gouttelettes pendant deux jours et demi à 37 degrés Celsius.

Après deux jours et demi, tirez l’EBS de six à huit boîtes de 15 centimètres en une seule à l’aide d’un milieu de différenciation et cultivez-les pendant trois jours et demi supplémentaires. Après trois jours et demi supplémentaires, prélevez l’EBS dans un tube conique de 50 millilitres et lavez la plaque une fois avec du PBS stérile pour recueillir tout l’EBS. Ensuite, laissez-les couler au fond pendant environ cinq minutes.

Retirez ensuite le supinate et lavez l’EBS avec du PBS stérile. Laissez l’EBS couler à nouveau au fond pendant environ cinq minutes. Dissociez l’EBS en ajoutant 2,5 millilitres de trypsine et secouez doucement le tube au bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.

Ajoutez ensuite 2,5 millilitres de PBS stérile à la solution de tripsin et pipetez de haut en bas avec la pipette sérologique de 10 millilitres environ huit à 10 fois pour décomposer les amas de cellules. Neutralisez la trypsine avec 10 millilitres de tampon de fax contenant 7,5 % E de cellule ES ou FBS de différenciation et 0,01 % DPI dans une centrifugeuse PBS, EBS dissocié à 1000 tr/min pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le supinate et ajoutez environ un millilitre de pipette tampon de télécopie de haut en bas avec une pipette d’un millilitre environ huit à 10 fois pour décomposer les grappes de cellules.

Transférez les cellules dans un tube stérile à fond rond avec une crépine de cellules de 35 microns pour obtenir une suspension à cellule unique. Triez les cellules ES différenciées à l’aide d’un cytomètre en flux aria et obtenez des populations purifiées de progéniteurs ventriculaires engagés. Voir la partie texte du protocole pour la stratégie de contrôle détaillée.

Manger les substrats de micro-motifs avec 1 % de F1 27 onique dans de l’eau distillée pendant 10 minutes. Ensuite, lavez-les trois fois avec du PBS stérile. Fixez les joints PDMS autour de la zone du motif et appuyez fermement.

Ensuite, ensemencez les progéniteurs cardiaques sur des substrats de micro-motifs de fibronectine. Les images suivantes sont tirées d’un tableau représentatif de cytométrie en flux de cellules ES différenciées in vitro du sixième jour. Cette image montre le gate sur l’amplitude de diffusion vers l’avant FSCA et l’amplitude de diffusion latérale SSCA.

Cela permet de séparer des cellules entières des débris cellulaires. Ici, on voit le gate sur FSCA et la largeur de diffusion vers l’avant FSCW. Cela permet d’isoler les singlets cellulaires des doublets et autres agrégats cellulaires.

Cette image montre le gating sur SSCA et la diffusion avec SSCW. Cela augmente la pureté des singuets de cellules. Cette image montre le contrôle de la coloration FSCA et DPI qui permet d’isoler les cellules DPI négatives viables des cellules non viables.

Ici, on voit des portes pour fico, rine, PE et PE cyan dans DI sept, PE SI sept. Cela permet d’obtenir des cellules rouges positives et négatives rouges vraies et d’exclure les cellules négatives rouges autofluorescentes. Ces images montrent un contrôle pour l’ajustement d’amplitude de l’isothiocyanate de fluorescéine CA et PEA qui permet de trier les cellules vertes positives et vertes négatives au sein des populations rouges positives et négatives rouges.

La purification par fax de cellules ES différenciées in vitro révèle quatre populations distinctes de progéniteurs, comme le montre ce graphique de cytométrie en flux. Les quatre populations distinctes de progéniteurs sont le rouge, le vert positif, le rouge positif, le vert positif, le rouge négatif, le vert négatif positif et le rouge négatif vert négatif. Cette image représentative de microscopie d’immunofluorescence montre des substrats de fibronectine à micro-motifs.

La barre d’échelle représente 80 microns. Cette image montre une microscopie d’immunofluorescence représentative de faits dérivés embryonnaires, des progéniteurs isolés dans les panneaux supérieurs et des faits dérivés de l’ESL, des progéniteurs isolés dans les panneaux inférieurs après cinq jours supplémentaires de culture sur des noyaux de micro-motifs de fibronectine colorés en bleu. L’alpha actinine sarcomérique colorée en rouge S-M-M-H-C-A apparaît verte.

La barre d’échelle est de 40 microns. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer du tissu myocardique fonctionnel anisotrope à partir d’une source cellulaire renouvelable de protus cardiaque.