Name: Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Découvrez la construction de tissus cardiaques humains définis par tri cellulaire pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque. Cette méthode permet d'évaluer les interventions thérapeutiques.

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Ce travail a été soutenu par le NIH (1F30HL118923-01A1) à TJC, contrat NIH / NHLBI PEN HHSN268201000045C à KDC, le conseil de subvention de recherche de Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) à BDG, l&#39;American Heart Association (12PRE12060254) à RJ, et de la recherche du Conseil de Grant RASHK (TBRS, T13-706 / 11) à RL des fonds supplémentaires ont été fournis à TJC par le NIH DRB 5T32GM008553-18 et comme un stage sur la formation NIDCR-interdisciplinaire dans les systèmes et le développement Biologie et anomalies congénitales T32HD075735. Les auteurs tiennent également à remercier Arthur Autz au Centre Zahn du City College de New York pour l&#39;assistance à l&#39;usinage du bioréacteur et Mamdouh Eldaly pour l&#39;assistance technique. Nous remercions également le Dr Kenneth Boheler pour obtenir des conseils sur la différenciation cardiaque, et le Dr Joshua Hare pour fournir généreusement des cellules souches mésenchymateuses humaines.

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<li>Dubois, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).</li>
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<li>Gago-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THY-1+receptor+expression+differentiates+cardiosphere-derived+cells+with+divergent+cardiogenic+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential.</a> Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La construction de tissus humains définis par génie cardiaque (HECT) peut fournir un modèle plus cohérent et fiable de la fonction cardiaque humaine myocytes. Critique, tous les composants cellulaires et extracellulaires dans le système sont connus et peuvent être manipulées comme désiré, en éliminant ainsi l&#39;influence des facteurs de confusion d&#39;autres types cellulaires inconnus résultant du processus de différenciation. Pour équilibrer la croissance cellulaire rapide et un rendement élevé, il est préférable qu...

L&#39; ingénierie tissulaire cardiaque a beaucoup progressé dans la dernière décennie, avec plusieurs groupes d&#39; édition de résultats, les tissus entièrement fonctionnels en battant fabriqués à partir de deux cardiomyocytes murins 1-6 et, plus récemment, les myocytes cardiaques de cellules souches dérivées humaines 7-12. Le domaine de l&#39; ingénierie du tissu cardiaque est entraîné par deux objectifs principaux et essentiellement indépendants: 1) pour développer des greffes exogènes qui peuvent être transplantées dans des cœurs défaillants pour améliorer la fonction 4-6; et 2) pour développer des modèles in vitro pour étudier la physiologie et de la maladie, ou comme outils de dépistage pour le développement thérapeutique 2,7. Dimensions Trois (3-D) culture cellulaire est considérée comme essentielle pour le développement d&#39;outils de dépistage de la prochaine génération, comme la matrice 3-D reflète un microenvironnement cardiaque plus naturel que la culture traditionnelle 2-D cellulaire monocouche; En effet , certains aspects de la biologie cellulaire sont fondamentalement différents en 2-D cultures par rapport à 3-D 13,14 </sup&gt;. En outre, les tissus cardiaques modifiés sont construits à partir de composants complètement définies: une matrice extracellulaire et d&#39;une population cellulaire. Pour les tissus cardiaques humains génétiquement traditionnels, tandis que la composition de la matrice extracellulaire (habituellement fibrine ou collagène 9 7,8,10) est strictement contrôlée, la composition de la cellule d&#39;entrée est moins bien définie, avec l&#39;ensemble du mélange de cellules à partir d&#39; une différenciation cardiaque dirigée soit les cellules souches embryonnaires (ESC 7,9) ou des cellules souches pluripotentes induites (CISP 10,12) étant ajoutés aux tissus. En fonction de la lignée cellulaire spécifique et l&#39;efficacité du protocole de différenciation utilisé, le pourcentage résultant de cardiomyocytes peut varier de moins de 25% à plus de 90%, le phénotype des cardiomyocytes spécifique (c. -à ventricular-, atrial- ou pacemaker) peut également varier, même la fraction non-cardiomyocytes peut être très hétérogène 15,16 et de modifier la maturité du m cardiaque différenciéyocytes 17. Récentes cardiaque travaux de génie tissulaire a tenté de contrôler la population d&#39;entrée des cellules, soit avec une surface les marqueurs 18 reporter cardiaque lignée de cellules souches embryonnaires humaines 8 ou de la cellule utilisée pour isoler la composante de myocytes cardiaques de la différenciation. Bien qu&#39;initialement un tissu composé de seulement myocytes cardiaques semble être l&#39;idéal, cela est en fait pas le cas; hECTs composés uniquement de myocytes cardiaques ne parviennent pas à compacter dans des tissus fonctionnels, avec certains groupes de trouver un rapport de 3: 1 des myocytes cardiaques: fibroblastes produisant la force de contraction le plus élevé 8. En utilisant différents procédés de sélection de cellules, y compris les marqueurs de surface pour le tri des cellules vivantes, il est possible de créer hECTs avec des populations cellulaires définies. Tandis que les marqueurs de cellules stromales non cardiaques sont disponibles depuis un certain temps, tels que le marqueur CD90 des fibroblastes putatif 19,20, les marqueurs de surface des myocytes cardiaques ont été plus difficilespour identifier. SIRPα a été parmi les premiers marqueurs de surface cardiaques identifiés pour les cardiomyocytes humains 18 et il a été montré très sélectif pour la lignée cardiaque. Récemment, nous avons constaté que double tri pour SIRPα + et CD90 - cellules cardiomyocytes rendements presque purs, avec le CD90 + population présentant un phénotype de type fibroblaste (Josowitz, observations non publiées). Sur la base de ces constatations recueillies, nous décrivons ici la création d&#39; hECTs en utilisant un 3: 1 combinaison de SIRPα + / CD90 - cardiomyocytes et CD90 + fibroblastes. La capacité à concevoir un tissu cardiaque humain complètement défini est essentiel non seulement pour créer des outils de dépistage robustes, mais aussi pour le développement de systèmes modèles pour étudier émergents cellules et thérapies cardiaques géniques. En particulier, de nombreuses thérapies cellulaires pour l&#39; insuffisance cardiaque, en utilisant des types de cellules incluant des cellules souches mésenchymateuses (MSC) 21 </sup&gt;, les cellules souches cardiaques 22 et les cellules mononucléaires de la moelle osseuse 23-25 ​​ont été testés dans des essais cliniques. Bien que plusieurs des premiers résultats ont été prometteurs 21,23,25, la prestation initiale diminue souvent au fil du temps 26-29. Une tendance similaire a été rapportée dans murins d&#39; ingénierie des tissus cardiaques, qui présentent un avantage fonctionnel important en raison de MSC supplémentation, mais l&#39;avantage ne ​​soit pas soutenue pendant la culture à long terme 1. Sous-jacent la performance sous-optimale est notre connaissance limitée des mécanismes régissant les thérapies cellulaires. Une meilleure compréhension de la façon dont les cellules thérapeutiques exercer leur influence bénéfique, ainsi que les conséquences négatives potentielles des interactions myocytes-nonmyocyte, permettrait le développement de thérapies améliorées qui donne des avantages cliniquement significatifs et durables, avec des effets secondaires minimes, pour les patients atteints d&#39;insuffisance cardiaque. Ici, nous décrivons l&#39;utilisation de hECTs définies à interrogate mécanismes de thérapie cellulaire. La composition tissulaire contrôlé est essentiel d&#39;identifier les facteurs spécifiques qui influent les performances des cardiomyocytes. Directement complétant hECTs avec le type de cellules d&#39;intérêt thérapeutique (par exemple, MSCs), peut révéler les effets sur la performance cardiaque de myocytes, comme nous l&#39; avons démontré dans ECTs de rat 1. Le protocole en plusieurs étapes suivant commence par la différenciation des cellules souches cardiaques dirigée, suivie par la fabrication du bioréacteur multi-tissulaire, et se terminant par une description de la construction de tissu et l&#39;analyse fonctionnelle. Nos expériences sont effectuées en utilisant la ligne H7 NIH approuvé les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Cependant, les protocoles suivants ont également été testés en utilisant une lignée de CSEh supplémentaire et trois induite cellules souches pluripotentes (hiPSC) lignes avec des résultats similaires. Nous avons constaté que l&#39;efficacité dans la différenciation des cardiomyocytes et de succès dans la fabrication HECT peut être lignée cellulaire dépendante, en particulier for lignes hiPSC dérivées de patients individuels. En suivant ce protocole, deux plats de 6 puits sont plaquées avec un total de 1,68 millions de CSEh (140.000 cellules par puits), ce qui donne environ 2,5 millions de myocytes après différenciation pendant 20 jours et le tri, assez pour faire six tissus définis.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>Préparez un stock de 2,5 mg/ml dans du DMSO et filtrez-stérilisez</td></tr><tr><td>B27 avec Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>17505055</td><td></td></tr><tr><td>B27 sans insuline</td><td>Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Create 6 &mu ; M stocker, puis aliquote et stocker à -20&nbsp ; &deg ;C.</td></tr><tr><td>Essential 8 Media</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>H7 Cellules souches embryonnaires humaines</td><td>WiCell</td><td>WA07</td><td></td></tr><tr><td>hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel</td><td></td><td>Corning 354277</td><td>Décongélation sur glace à 4 &deg ; C pendant la nuit puis aliquote 150 &mu ; l dans des tubes séparés et stocker à -20&nbsp ; &deg ;C.</td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0161</td><td>Créer un stock de 10 mM et aliquote. Conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Sérum de veau néonatal</td><td>Life Technologies</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dissociation non enzymatique : réactif de dissociation cellulaire doux</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Conserver au réfrigérateur</td></tr><tr><td>Y-27632 (inhibiteur de ROCK)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td>Remettre en suspension à une concentration de stock de 10 mM, aliquote et stocker à -20&nbsp ; &deg ;C. Évitez les cycles de gel-dégel.</td></tr><tr><td>Cell Sorting</strong</td><td>>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>CD90-FITC</td><td>BioLegend</td><td>328107</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de dissociation enzymatique : Kit de détachement cellulaire I (0,04 % de trypsine / 0,03 % d’EDTA, solution de neutralisation de la trypsine et solution de sel tamponné Hanks)&nbsp ;</td><td>PromoCell</td><td>C-41200</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Atlanta Biologics</td><td>S11250</td><td></td></tr><tr><td>SIRP&alpha ;-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>323807<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Construction tissulaire</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>0.25 % Trypsine/0.1 % EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-053-CI</td><td>En option : Pour la collecte de cellules supplémentaires d’intérêt</td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0275-100ML</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS Packets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Collagène bovin de type I</td><td>Life Technologies</td><td>A10644-01</td><td>Keep on ice</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagles Modified Medium (DMEM), High Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Sodium HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0536757</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tube à centrifuger en polyproylène</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tube à fond rond en polystyrène</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Avec 35 &mu ; Filtre cellulaire M</td></tr><tr><td>50 ml Tube à centrifuger en polyproylène</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Plaque traitée pour culture tissulaire à fond plat à 6 puits</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Grattoir cellulaire, jetable</td><td>Biologix</td><td>70-2180</td><td></td></tr><tr><td>Polysulfone</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytétrafluoroéthylène (téflon)</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ-61</td><td>Ou similaire, doit avoir un support pour la caméra haute vitesse pour fixer le</td></tr><tr><td>stimulateur électrique</td><td>Astro-Med, Inc</td><td>Grass S88X Stimulator</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Appareil photo</td><td>Pixelink</td><td>PL-B741U</td><td>Ou similaire, mais doit être capable de 100 images par seconde pour une acquisition de données précise</td></tr><tr><td>Contrôle de la température</td><td></td><td></td> de la plaque <td>Utilisé pour maintenir la température du support pendant l’acquisition de données.</td></tr><tr><td>Custom Materials</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>LabView Post-tracking Program</td><td></td><td></td><td>disponible sur demande auprès des auteurs</td></tr></tbody></table>

construction des défini humaines engineered cardiaques tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

L’ingénierie des tissus cardiaques humains peut avoir un impact fondamental sur la découverte thérapeutique grâce au développement de nouveaux systèmes de criblage spécifiques à l’espèce qui reproduisent la biofidélité du myocarde humain natif tridimensionnel, tout en permettant un niveau contrôlé de complexité biologique et en permettant une surveillance longitudinale non destructive de la fonction contractile des tissus. Initialement, les tissus cardiaques modifiés humains (hECT) ont été créés à partir de l’ensemble de la population cellulaire obtenue à partir de la différenciation dirigée de cellules souches pluripotentes humaines, qui produisaient généralement moins de 50 % de cardiomyocytes. Cependant, pour créer des modèles prédictifs fiables du myocarde humain et pour élucider les mécanismes d’interaction hétérocellulaire, il est essentiel de contrôler avec précision la composition biologique des tissus modifiés. 
Pour remédier à cette limitation, nous utilisons le tri de cellules vivantes pour le marqueur de surface cardiaque SIRPα et le marqueur de fibroblaste CD90 pour créer des tissus contenant un rapport de 3:1 de ces types de cellules, respectivement, qui sont ensuite mélangés et ajoutés à une solution matricielle à base de collagène. Les hECT résultants sont donc complètement définis dans leur composition matricielle cellulaire et extracellulaire.
Ici, nous décrivons la construction de hECTs définis en tant que système modèle pour comprendre les mécanismes des interactions cellule-cellule dans les thérapies cellulaires, en utilisant un exemple de cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine (hMSC) qui sont actuellement utilisées dans les essais cliniques humains. La composition tissulaire définie est impérative pour comprendre comment les CSMh peuvent interagir avec les types de cellules cardiaques endogènes afin d’améliorer la fonction tissulaire. Un système de bioréacteur est également décrit qui cultive simultanément six hECT en parallèle, permettant une utilisation plus efficace des cellules après le tri.

Pour obtenir les myocytes cardiaques, une version légèrement modifiée des méthodes de différenciation Boheler et Lian est utilisé 30,31. Il est impératif que la différenciation commence au cours de la phase logarithmique de la croissance cellulaire, mais aussi que la population de départ est suffisamment confluentes pour obtenir un nombre utilisable de cellules après tri (environ 75% est optimal). Typiquement, pour H7 CSEh, placage à une densité de 140.000 CSEh par puits d&#39;un plat à 6 puits dans essentiel...

Ce manuscrit décrit la création de tissus cardiaques modifiés définis à l’aide de l’expression de marqueurs de surface et du tri cellulaire. Les tissus définis peuvent ensuite être utilisés dans un bioréacteur multi-tissus pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque afin de fournir un système modèle fonctionnel, mais contrôlé, du cœur humain.

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

L'objectif général de cette procédure est de créer des tissus cardiaques humains ingénierisés ayant une composition cellulaire définie. Cette méthode peut répondre à des défis clés dans le domaine de l'ingénierie tissulaire cardiaque, notamment en contrôlant la variabilité et les rendements de différenciation cardiaque, ainsi qu'en comprenant l'impact de types cellulaires spécifiques sur la fonction contractile cardiaque. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que le résultat final correspond à un tissu cardiaque humain ingénierisé dont la composition est contrôlée et définie.Des réplications de cette technique s'étendent vers des thérapies contre les maladies cardiaques, car des tissus définis peuvent fournir une plateforme de criblage biomédical nouvelle, biologiquement pertinente et capable d'évaluer des interventions thérapeutiques. Bien que cette méthode puisse offrir des aperçus sur de nouveaux traitements cardiaques, le système de tissu cardiaque humain génie peut également être utilisé pour comprendre les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque. À partir de cultures de cardiomyocytes dérivés de cellules souches embryonnaires humaines, laver les cellules une fois avec du PBS et ajouter un millilitre de trypsine-EDTA 0,04 %.Incuber les cellules pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et 5 %CO2. Pendant que les cellules sont en incubation, ajouter 12 microlitres d'inhibiteur ROCK à six millilitres de solution de neutralisation de la trypsine. Retirer les plaques de l'incubateur et ajouter un millilitre de la solution de neutralisation dans chaque puits de la plaque à six puits.Transférez toutes les cellules de chaque puits dans un seul tube de centrifugation de 15 millilitres. Lavez les six puits avec un volume de trois millilitres de PBS et mélangez ce lavage avec les cellules dans le tube. Centrifugez le tube à 300 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius afin de former un culot cellulaire.Pour préparer les cellules en vue d'un tri cellulaire vivant par FACS, préparez le tampon de marquage en ajoutant cinq millilitres de SFB et 50 microlitres d'inhibiteur ROCK à 45 millilitres de PBS sur glace. Retirez le surnageant des cellules pelletées et resuspendez-les dans 1,2 millilitre de tampon de marquage. Transférez 200 microlitres des cellules en suspension dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres prérefroidi sur glace.Ensuite, transférez le millilitre restant de la suspension cellulaire dans un nouveau tube de centrifugation de 50 millilitres prérefroidi placé sur de la glace, puis ajoutez deux microlitres d'anticorps SIRP alpha-PE/Cy7 et quatre microlitres d'anticorps CD90-FITC. Mélangez délicatement la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette de transfert et placez le tube sur de la glace. Incubez les deux tubes de 50 millilitres contenant le témoin négatif et l’échantillon sur un agitateur rotatif placé sur de la glace à quatre degrés Celsius pendant une heure.Pendant l'incubation des cellules, transférez trois millilitres de milieu de différenciation 2 dans chacun de deux tubes de centrifugation de 15 millilitres. Ajoutez ensuite trois microlitres d'inhibiteur ROCK, puis conservez ces tubes de collecte FACS sur de la glace avant utilisation. Ensuite, récupérez les cellules marquées par centrifugation à 300 × g pendant cinq minutes à 4 °C.Et lavez-les deux fois avec 10 millilitres de PBS glacé. Resuspendez délicatement le culot d'échantillon avec un à trois millilitres de tampon de marquage contenant du DAPI. Ajoutez 500 microlitres de tampon de marquage sans DAPI au culot du témoin négatif.Filtrer les deux suspensions cellulaires à l’aide d’un tamis cellulaire de 40 microns afin d’éliminer les agrégats cellulaires, puis les transférer dans des tubes FACS en polystyrène placés sur de la glace. Acheminer immédiatement les échantillons vers le trieur cellulaire. À partir de l’échantillon témoin de coloration négative, définir les paramètres de sélection.Ensuite, lors de l'analyse des cellules échantillons, sélectionner la population de cellules vivantes négatives pour le DAPI. Recueillir séparément les populations de cellules positives pour le FITC et positives pour le PE/Cy7 à 20 PSI. Après la culture et la réagrégation des cellules, comme indiqué dans le protocole écrit, retirer les plaques de culture cellulaire de l'incubateur et transférer le milieu dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.Lavez les plaques avec trois millilitres de PBS et transférez le lavage dans le même tube de centrifugation de 50 millilitres. Ajoutez ensuite trois millilitres de trypsine-EDTA à 0,04 % sur les plaques et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Après cinq minutes, examinez les plaques au microscope pour vérifier le détachement des cellules.Une fois que toutes les cellules se sont détachées, ajouter trois millilitres de solution de neutralisation de la trypsine dans les plaques. Mélanger délicatement et transférer les cellules dans le tube à centrifuge de 50 millilitres d'origine. Rincer les plaques avec cinq millilitres de PBS et ajouter ce rinçage au tube également.Recueillir les cellules par centrifugation à 300 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans un millilitre de sérum de veau nouveau-né, ou milieu NBS. Ensuite, transférer les cellules dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Centrifuger les cellules à 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante et éliminer le surnageant. Pour commencer la fabrication des six tissus cardiaques modifiés, diluer 60,0 µL du stock de collagène à 5 mg/mL jusqu'à une concentration de 3,125 mg/mL avec 1,5 µL de soude à 1 M, 9,6 µL de PBS 10X et 24,9 µL d'eau stérile ultra-pure. À ce stade, il est essentiel d'éviter l'introduction de bulles d'air dans le mélange de collagène, car les bulles mettent longtemps à s'échapper de la solution visqueuse et peuvent perturber la formation du tissu pendant la contraction tissulaire.Utiliser une pipette pour ajouter sur la paroi du tube de 15 millilitres 12,0 microlitres de chacun de 10X MEM et de 0,2 normal heaps à pH 9 afin de diluer le mélange de collagène. Ajouter ensuite la matrice de la membrane basale au mélange de collagène pour obtenir une concentration finale de 0,9 milligramme par millilitre et mélanger délicatement. Conserver ce mélange tissulaire final sur de la glace.Ensuite, transférez l'ensemble du mélange tissulaire vers le culot cellulaire et ajoutez les cellules supplémentaires comme indiqué dans le protocole écrit. Complétez le tube jusqu'à un volume final de 150 microlitres avec le milieu NBS sans cellules et mélangez délicatement. Pipetez soigneusement 25 microlitres de la suspension cellulaire dans chacun des six puits de la plaque de base du bioréacteur.Répétez la procédure de mélange entre chaque puits afin de resuspendre les cellules qui se seraient éventuellement déposées. Utilisez la pipette pour un seul tissu par puits à la fois afin d'assurer un volume et un nombre de cellules constants par tissu. Indépendamment, insérez deux rangées de capteurs de force en polydiméthylsiloxane, ou PDMS, de chaque côté du cadre en polysulfone afin de former six paires de piliers opposés.Retournez le cadre au-dessus de la plaque de base de manière à ce qu'une paire de piliers pénètre dans chaque puits contenant la suspension cellulaire. Ensuite, placez le bioréacteur dans une boîte de 60 millimètres et insérez cette boîte, sans son couvercle, à l'intérieur d'une boîte de 10 centimètres. Placez le couvercle sur la boîte de 10 centimètres et déplacez l'ensemble du dispositif du bioréacteur dans l'incubateur de culture tissulaire.Après deux heures d'incubation, retirez l'ensemble du bioréacteur et ajoutez 14 millilitres de milieu NBS pour recouvrir la plaque de base. Remettez le bioréacteur dans l'incubateur de culture cellulaire et renouvelez la moitié du milieu chaque jour. Après 48 heures, retirez délicatement la plaque de base par petits déplacements de quelques millimètres à la fois.Ensuite, remettre le bioréacteur avec le tissu face vers le bas dans le milieu. Si un tissu se détache d'un poteau lors du retrait de la plaque de base, le réattacher délicatement sur le poteau. La différenciation des cellules souches embryonnaires humaines donne une culture mixte composée principalement de cardiomyocytes et de fibroblastes qui s'auto-organisent en agrégats et forment des réseaux battants solides répartis dans toute la boîte.Le tri FACS de ces cultures a révélé que cette méthode de différenciation conduit à une population contenant au moins 65 % de cellules positives pour SIRP alpha et 10 % de cellules positives pour CD90. Après retrait de la plaque de base, les tissus cardiaques humains ingénierisés, ou HECTs, sont laissés libres de s'assembler spontanément au sein du bioréacteur. Les HECTs matures et compactés déforment visiblement les micro-piliers intégrés de mesure de force avec une force moyenne comprise entre cinq et quinze micronewtons.Les mesures de force de contraction révèlent comment des variables isolées modifient la force contractile dans ces tissus ingénierisés définis. Ici, lorsque les tissus sont complémentés avec 10 % de cellules souches mésenchymateuses humaines, une amélioration substantielle de la force contractile est observée à la fois aux fréquences de stimulation d'un hertz et de deux hertz. Une fois maîtrisée, la différenciation prend environ 20 jours, le tri cellulaire environ cinq heures et la construction du tissu environ trois heures.Sept autres jours seront nécessaires pour une formation adéquate des tissus après la construction. Après cette procédure, d'autres méthodes, notamment le marquage cellulaire et la supplémentation du mélange tissulaire, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur les effets d'interactions cellulaires spécifiques ou pour déterminer les mécanismes de la thérapie cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de créer des tissus cardiaques humains ingénierisés avec une composition cellulaire connue et contrôlée.

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Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

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