Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Ce manuscrit décrit la création de tissus cardiaques modifiés définis à l’aide de l’expression de marqueurs de surface et du tri cellulaire. Les tissus définis peuvent ensuite être utilisés dans un bioréacteur multi-tissus pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque afin de fournir un système modèle fonctionnel, mais contrôlé, du cœur humain.

L’objectif global de cette procédure est de créer des tissus cardiaques modifiés par l’homme d’une composition cellulaire définie. Cette méthode peut relever des défis clés dans le domaine de l’ingénierie tissulaire cardiaque, notamment le contrôle de la variabilité et de l’efficacité de la différenciation cardiaque et la compréhension de l’impact de types de cellules spécifiques sur la fonction contractile cardiaque. Le principal avantage de cette technique est que le résultat final est un tissu cardiaque modifié par l’homme d’une composition contrôlée et définie.

Les réplications de cette technique s’étendent à la thérapie des maladies cardiaques, car les tissus définis peuvent fournir une plate-forme de dépistage nouvelle, biologiquement pertinente et biomédicale capable d’évaluer les interventions thérapeutiques. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de nouvelles thérapies cardiaques, le système tissulaire cardiaque modifié par l’homme peut également être utilisé pour comprendre les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque. En commençant par des cultures de cardiomyocytes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines, lavez les cellules une fois avec du PBS et ajoutez un millilitre de 0,04 % de trypsine-EDTA.

Incuber les cellules pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Lorsque les cellules sont en incubation, ajoutez 12 microlitres d’inhibiteur de ROCK à six millilitres de solution de neutralisation de la trypsine. Retirez les plaques de l’incubateur et ajoutez un millilitre de solution de neutralisation dans chaque puits de la plaque à six puits.

Transférez toutes les cellules de chaque puits dans un seul tube à centrifuger de 15 millilitres. Lavez les six puits avec un volume de trois millilitres de PBS et combinez ce lavage avec les cellules du tube. Centrifugez le tube à 300 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les cellules.

Pour préparer les cellules au tri des cellules vivantes par FACS, préparez le tampon de coloration en ajoutant cinq millilitres de FBS et 50 microlitres d’inhibiteur de ROCK à 45 millilitres de PBS sur glace. Retirez le surnageant des cellules granulées et mettez-les en suspension dans 1,2 millilitre de tampon de coloration. Transférez 200 microlitres de cellules suspendues dans un nouveau tube à centrifuger prérefroidi de 50 millilitres sur de la glace.

Ensuite, transférez le millilitre restant de la suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger prérefroidi de 50 millilitres sur de la glace et ajoutez deux microlitres de SIRP alpha-PE/Cy7 et quatre microlitres d’anticorps CD90-FITC. Mélangez délicatement la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette de transfert et placez le tube sur de la glace. Incuber les deux tubes de 50 millilitres contenant le témoin négatif et l’échantillon sur un agitateur à bascule sur de la glace à quatre degrés Celsius pendant une heure.

Pendant que les cellules sont en incubation, transférez trois millilitres de milieu de différenciation deux dans chacun des deux tubes à centrifuger de 15 millilitres. Ajoutez ensuite trois microlitres d’inhibiteur de ROCK et stockez ces tubes de collecte FACS sur de la glace avant de les utiliser. Ensuite, granulez les cellules colorées à 300 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Et lavez-les deux fois avec 10 millilitres de PBS glacé. Remettez doucement la pastille d’échantillon en suspension avec un à trois millilitres de tampon de coloration contenant du DAPI. Ajoutez 500 microlitres de tampon de coloration sans DAPI à la pastille de contrôle négatif.

Filtrez les deux suspensions cellulaires à travers une crépine cellulaire de 40 microns pour éliminer les amas cellulaires, puis transférez-les dans des tubes FACS en polystyrène sur de la glace. Apportez immédiatement les échantillons au trieur de cellules. En commençant par l’échantillon de contrôle de coloration négative, établissez les paramètres de contrôle.

Ensuite, lors de l’exécution des cellules d’échantillonnage, sélectionnez la population de cellules vivantes DAPI négative. Collectez les populations de cellules FITC positives et PE/Cy7 positives indépendamment à 20 PSI. Après la culture et la réagrégation des cellules, comme indiqué dans le protocole de texte, retirez les plaques de culture cellulaire de l’incubateur et transférez le milieu dans un tube à centrifuger de 50 millilitres.

Lavez les plaques avec trois millilitres de PBS et transférez le lavage dans le même tube à centrifuger de 50 millilitres. Ajoutez ensuite trois millilitres de 0,04 % de trypsine-EDTA dans les plaques et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Après cinq minutes, examinez les plaques à l’aide d’un microscope pour détecter le détachement des cellules.

Une fois que toutes les cellules se sont détachées, ajoutez trois millilitres de solution de neutralisation de la trypsine dans les plaques. Mélangez délicatement et transférez les cellules dans le tube à centrifuger d’origine de 50 millilitres. Lavez les plaques avec cinq millilitres de PBS et ajoutez également ce lavage au tube.

Granulez les cellules par centrifugation à 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de sérum bovin néonatal ou de milieu NBS. Ensuite, transférez les cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Granulez les cellules à 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante et retirez le surnageant. Pour commencer à générer les six tissus cardiaques modifiés, diluez 60,0 microlitres du stock de collagène de cinq milligrammes par millilitre à 3,125 milligrammes par millilitre avec 1,5 microlitre d’hydroxyde de sodium molaire, 9,6 microlitres de PBS 10X et 24,9 microlitres d’eau stérile ultra-pure. Ici, il est essentiel d’éviter l’introduction de bulles d’air dans le mélange de collagène, car les bulles d’air sont lentes à se libérer de la solution visqueuse et peuvent interférer avec la formation des tissus pendant le compactage des tissus.

Pipetez sur le côté du tube de 15 millilitres pour ajouter 12,0 microlitres chacun de MEM 10X et 0,2 tas normaux à pH 9 pour diluer le mélange de collagène. Ajoutez ensuite la matrice de la membrane basale au mélange de collagène jusqu’à une concentration finale de 0,9 milligramme par millilitre et mélangez doucement. Conservez ce dernier mélange de mouchoirs sur de la glace.

Ensuite, transférez l’ensemble du mélange de tissus dans la pastille cellulaire et ajoutez des cellules supplémentaires comme indiqué dans le protocole de texte. Remplissez le tube jusqu’à un volume final de 150 microlitres avec un média NBS acellulaire et mélangez délicatement. Pipetez soigneusement 25 microlitres de suspension cellulaire dans chacun des six puits de la plaque de base du bioréacteur.

Répétez la procédure de mélange entre chaque puits pour remettre en suspension les cellules qui auraient pu se déposer. Pipetez un seul tissu par puits à la fois pour assurer un volume et un nombre de cellules constants par tissu. Séparément, poussez deux rangées de polydiméthylsiloxane, ou PDMS, forcez les capteurs de chaque côté du cadre en polysulfone pour former six paires de poteaux opposés.

Retournez le cadre sur le dessus de la plaque de base de sorte qu’une paire de poteaux entre dans chaque puits contenant la suspension de la cellule. Placez ensuite le bioréacteur dans une parabole de 60 millimètres et placez cette parabole sans son couvercle à l’intérieur d’une parabole de 10 centimètres. Placez le couvercle sur la boîte de 10 centimètres et déplacez l’ensemble du bioréacteur dans l’incubateur de culture tissulaire.

Après deux heures d’incubation, retirez l’ensemble du bioréacteur et ajoutez 14 millilitres de milieu NBS pour couvrir la plaque de base. Remettez le bioréacteur dans l’incubateur de culture cellulaire et changez la moitié du milieu tous les jours. Après 48 heures, retirez délicatement la plaque de base quelques millimètres à la fois.

Remettez ensuite le bioréacteur avec le tissu vers le bas vers le milieu. Si un mouchoir tombe d’un tenon lors du retrait de la plaque de base, rattachez doucement le mouchoir sur le poteau. La différenciation des cellules souches embryonnaires humaines aboutit à une culture mixte de cardiomyocytes et de fibroblastes qui s’auto-organisent en grappes et forment des toiles battantes robustes dans toute la boîte.

Le tri FACS de ces cultures a révélé que cette méthode de différenciation aboutit à une population contenant au moins 65 % de cellules SIRP alpha positives et 10 % de cellules CD90 positives. Après avoir retiré la plaque de base, les tissus cardiaques modifiés par l’homme, ou HECT, sont autorisés à s’auto-assembler dans le bioréacteur. Les HECT matures et compacts dévient visiblement les poteaux de détection de force intégrés avec une force moyenne de cinq à 15 micronewtons.

Les mesures de la force de contraction révèlent comment des variables isolées modifient la force contractile dans ces tissus modifiés définis. Ici, lorsque les tissus sont complétés par 10 % de cellules souches mésenchymateuses humaines, une augmentation substantielle de la force contractile est observée aux fréquences de stimulation d’un hertz et de deux hertz. Une fois maîtrisée, la différenciation prendra environ 20 jours, le tri cellulaire environ cinq heures et la construction tissulaire environ trois heures.

Sept jours supplémentaires seront nécessaires pour une bonne formation des tissus après la construction. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, y compris le marquage cellulaire et la supplémentation du mélange tissulaire, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant les effets d’interactions cellule-cellule spécifiques ou de déterminer les mécanismes de la thérapie cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer des tissus cardiaques modifiés par l’homme avec une composition cellulaire connue et contrôlée.