L’imagerie tridimensionnelle de tissus porteurs de tumeurs à l’aide du blanchiment itératif étend l’approche de multiplexité

Cette recherche se concentre sur l’identification de cibles pour les médicaments immunomodulateurs et les tumeurs gastro-intestinales solides complexes. L’analyse du paysage cellulaire du microenvironnement tumoral est absolument cruciale pour comprendre la susceptibilité à des traitements tels que l’immunothérapie. Le séquençage unicellulaire et la cytométrie en flux aident à caractériser le microenvironnement tumoral, mais manquent de contexte spatial. Récemment, des plateformes d’imagerie multiplex et de transcriptomique ont vu le jour pour étudier le microenvironnement tumoral dans son contexte in-vivo.

Les technologies multiplex disponibles pour l’analyse du microenvironnement tumoral, qu’elles soient itératives ou tout-en-un, sont limitées à deux dimensions. Ce protocole étend la caractérisation à la dimension de la profondeur, fournissant des informations au-delà des sections FFPE ou congelées uniques.

[Narrateur] Pour commencer, transférez les feuilles de tissu dans un gobelet d’échantillonnage contenant du substrat de récolte chaud et placez-le sur une plaque chauffante à la table de préparation. Montez le tissu sur des plates-formes dans une plaque de 15 centimètres contenant du milieu de récolte. Drapez soigneusement le tissu porteur de la tumeur avec le côté mésothélial vers le haut sur le petit côté orifice de la plate-forme et fixez-le avec une suture en soie 2-0. Placez la plate-forme tissulaire préparée à l’inverse entièrement immergée dans une plaque de 24 puits contenant du milieu de récolte. Pour la fixation, ajoutez 10 millilitres de pellicule fixatrice dans un tube conique de 50 millilitres contenant 30 millilitres de PBS froid pour préparer 40 millilitres de tampon de fixation. À l’aide d’une pince, transférez le tissu monté sur des plates-formes dans le tampon de fixation. Et incuber pendant 24 heures à 4 degrés Celsius. Décantez le fixateur. Remplacez-le par 40 millilitres de PBS froid. Et incuber pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Pour la coloration, ajoutez 1 millilitre de tampon de blocage dans un puits et insérez la plate-forme tissulaire. Bloquer pendant au moins deux heures à température ambiante sur une bascule réglée à basse vitesse de 30 tr/min. Préparez 0,8 millilitre de solution de colorant d’anticorps dans un tube de microcentrifugation et centrifugez à 10 000 g pendant deux minutes à température ambiante. Transférez 0,75 millilitre du surnageant dans un puits propre d’une plaque d’incubation à 9 puits. Et insérez une plate-forme lavée. Enveloppez l’assiette dans du papier d’aluminium. Et incubez pendant au moins deux heures à température ambiante sur une bascule réglée à basse vitesse de 30 tr/min. Lavez la plate-forme dans un tube conique de 50 millilitres contenant 40 millilitres de PBS pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Ajoutez 0,1 millilitre de PBS au centre du fond en verre d’une parabole d’imagerie de 3,5 centimètres et mettez-le de côté. Vissez la bague de réglage de la hauteur sans serrer dans le sens des aiguilles d’une montre dans le couvercle extérieur. Et montez la plate-forme dans le support intérieur en plastique, en assurant l’alignement de la rainure de l’encoche. Fixez la plate-forme avec le curseur. Placez l’adaptateur d’imagerie assemblé sur la parabole à fond en verre et abaissez soigneusement la bague de réglage de la hauteur jusqu’à ce que le tissu touche la mémoire tampon. Une fois que la distance optimale du verre est atteinte, ajoutez 0,2 millilitre de PBS sur le tissu avec le dessous vers le haut pour éviter la déshydratation des tissus pendant l’imagerie. Démarrez le logiciel d’acquisition d’images. Sélectionnez l’objectif approprié, tel que 20X ou 40X, et ajoutez le milieu d’immersion correspondant. Choisissez les paramètres d’acquisition d’image, tels qu’une vitesse de balayage de 600 hertz, une résolution XY de 1024 x 1024 pixels, des moyennes sur trois lignes et un balayage bidirectionnel. Sélectionnez les lignes laser appropriées ou ajustez le laser à lumière blanche pour qu’il corresponde aux spectres d’excitation et d’émission des fluorophores utilisés pour la coloration. Placez la boîte d’imagerie assemblée dans le porte-échantillon sur la platine du microscope. Centrez l’échantillon à l’aide de la commande XY, approchez l’objectif de la vitre de protection et lancez l’acquisition d’images. Après chaque cycle d’imagerie, effectuez une étape de blanchiment. Préparez 5 millilitres de 1,5 milligramme par millilitre de solution de borohydrure de lithium dans de l’eau distillée et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Transférez 1 millilitre de la solution de borohydrure de lithium dans un puits propre de la plaque d’incubation à 9 puits et insérez la plate-forme lavée pendant 60 minutes à température ambiante. Lavez brièvement la plate-forme dans 20 millilitres de PBS à l’intérieur d’un tube conique. Vérifiez le signal fluorescent restant à l’aide du réglage laser le plus élevé pour la compensation Z. Un échantillon péritonéal porteur de tumeur coloré avec la première série de blanchissement itératif étend la multiplexité, ou IBEX 1, panel pour la visualisation est présenté ici. Les lésions tumorales ont été identifiées comme des structures en forme de rosette qui étaient doublement positives pour CD44 et la podoplanine avec des arrangements nucléaires caractéristiques du mésothéliome papillaire. Des images d’immunofluorescence à haute résolution de régions sélectionnées à partir de l’échantillon péritonéal porteur de la tumeur sont présentées ici. Ces images révèlent les régions tumorales et les interfaces de la structure lymphoïde tertiaire tumorale, mettant en évidence une infiltration cohérente des cellules immunitaires avec une forte densité de cellules CD45 positives. Cette figure présente la coloration itérative par immunofluorescence au cours des cycles un à six d’IBEX, illustrant la distribution spatiale des marqueurs immunitaires et structurels au sein de l’interface entre la lésion tumorale et la structure lymphoïde tertiaire de la tumeur. Les projections maximales des différentes sections optiques sont présentées ici. Cette imagerie 3D a confirmé que les lésions tumorales et les structures lymphoïdes tertiaires résident à différentes profondeurs Z, démontrant les limites de l’imagerie 2D dans la capture d’une architecture tissulaire complexe.