3D Flipwell Engineering pour le développement de systèmes asynchrones pour les thérapies toxicologiques et immunomodulatrices dans les cellules bactériennes, intestinales et immunitaires

Nous avons développé un système de co-culture 3D qui imite l’environnement muqueusier intestinal afin d’étudier la diaphonie en série et d’évaluer les réponses aux médicaments pouvant être utilisées pour le dépistage et la compréhension des interactions cellulaires muqueuses. Différents groupes ont développé plusieurs systèmes de culture pour modéliser l’environnement muqueux intestinal en utilisant des techniques de bioingénierie très complexes. Mais à la place, nous avons développé un système de co-culture beaucoup plus facile à réaliser avec des matériaux moins coûteux.

Notre système de co-culture a révélé qu’un médicament protéogénique déclenche des réponses coordonnées entre les bactéries intestinales, les cellules épithéliales et immunitaires, activant probablement l’immunité de l’hôte grâce à nos métabolites bactériens et médiatisant la communication entre espèces. Nous visons à étudier à la fois les souches bactériennes aérobies et anérobiques ainsi que leurs métabolites afin de découvrir les effets modulateurs immunitaires, ouvrant la voie à de nouvelles stratégies immunothérapeutiques basées sur les métabolites bactériens. Pour commencer, ouvrez un couvercle de boîte de Petri et mettez-le de côté.

Placez une lame de scalpel sur le bord du fond de la boîte de Petri. Prenez une pince à épiler stérile et saisissez doucement l’insert en bas pour le retirer de l’emballage. De l’autre main, prenez la lame stérile du scalpel et amenez-la à l’insert.

D’un mouvement en C, percez la membrane au bord et faites glisser doucement la lame du scalpel autour du fond de l’insert, restant près du mur en plastique. Coupez la membrane PET et utilisez la deuxième pince à épiler pour la retirer. Ensuite, utilisez la lame du scalpel pour gratter les copeaux blancs de membrane afin de nettoyer le bord et le bord de l’insert.

Ensuite, étalez doucement une perle de silicone de 2 à 3 millimètres tout autour du bas de l’insert, en faisant attention à ne pas toucher la membrane. Prenez la deuxième série de pinces stériles et soulevez délicatement la première insertion sans membrane hors de son sac protecteur. Rapprochez les deux inserts de bas à bas pour que les rebords inférieurs s’alignent.

Lorsque la pile Flipwell est collée, placez-la dans le paquet stérile d’origine ou dans une boîte de Petri profonde pour la faire sécher pendant 72 heures. Utilisez le couvercle des boîtes de Petri spécifiées pour couvrir l’ensemble de la pile. Pour stériliser les assemblages de la pile, utilisez des pinces stériles pour suspendre la pile Flipwell sur le bord du bord profond de la boîte de Petri spécifiée.

Ensuite, fermez le châssis en verre de l’armoire de biosécurité et allumez la lumière ultraviolette. Pour vérifier la fuite avant le revêtement de collagène, ajoutez d’abord 500 microlitres de PBS stérile ou d’eau déionisée stérile. Le lendemain, aspirez le liquide utilisé pour les tests avant de sécher les cheminées pendant 1 à 2 heures dans l’armoire de biosécurité.

Pour recouvrir la membrane de collagène, ouvrez le couvercle de la boîte de Petri et laissez le Flipwell pendre sur le bord de la boîte de Petri. Ajoutez soigneusement 200 microlitres de solution de collagène d’un côté de la pile d’inserts. Aspirez la solution de collagène après une heure, puis pipettez 200 microlitres de PBS stérile. Après avoir aspiré le PBS, couvrez la boîte de Petri avec un couvercle et laissez sécher la membrane pendant 60 minutes à l’intérieur du placard.

Quand la membrane est sèche, utilisez des pinces ou des pinces stériles et retournez la Flipwell du côté opposé et laissez-la pendre sur le bord de la boîte de Petri. Pour fabriquer l’insert bactérien, placez deux jeux de pinces stériles et les inserts à 24 puits à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Avec une pince stérile, soulevez l’insert de son sac stérile.

Avec la deuxième série de pinces à épiler ou de pinces, cassez les petits pieds en plastique au bas de l’insert. Testez l’insert à 24 puits en l’insérant dans l’une des piles stériles d’inserts Flipwell à co-culture ou dans les inserts originaux à 12 puits. Pour commencer à semer les Flipwells, semez 500 microlitres des lignes cellulaires épithéliales de chaque côté du côté apical du Flipwell.

Couvrez les assemblages d’un couvercle de boîte de Petri, puis incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit jusqu’à ce que les cellules s’attachent. Ouvrez le couvercle de la boîte de Petri et aspirez le média DMEM du côté apical de la pile Flipwell. Avec des pinces stériles, prenez la Flipwell avec précaution par le crochet et faites-la pivoter de 180 degrés.

Avec la deuxième série de pinces stériles, attrapez la pile Flipwell par l’autre crochet maintenant tourné vers le haut. Ensuite, descendez l’ensemble dans la boîte de Petri et suspendez le crochet sur le bord de la boîte de Petri. Ajoutez 500 microlitres de suspension de cellules THP-1 sur le côté apical de la pile d’inserts de coculture.

Ajustez le milieu HT-29 pour les cellules épithéliales du côlon en ajoutant un milieu à la boîte de Petri du puits profond. Pour éliminer toute bulle d’air, tenez la pile Flipwell par le bras avec une pince stérile. Descendez délicatement une aiguille de gavage dans et sous l’ensemble de l’insert et placez très délicatement la pointe souple vers la bulle d’air.

Tirez prudemment et très lentement le ventouse de la seringue vers le haut et regardez la bulle d’air disparaître lentement. Ensuite, retirez soigneusement l’aiguille et la seringue du Flipwell. Après que les bulles d’air ont été retirées à l’aide d’une aiguille de garde, cultivez les deux types cellulaires dans l’incubateur de culture cellulaire.

Avec une pince, placez l’insert dans une boîte de Petri stérile et couvrez avec le couvercle. Transférez la boîte de Petri avec les Flipwells dans l’armoire de biosécurité et mettez-la de côté opposé à l’aide d’inserts bactériens. Faites une pipette de 300 microlitres de milieu DMEM du côté apical du Flipwell pour permettre l’insertion bactérienne, puis couvrez avec le couvercle de la boîte de Petri.

Ajoutez maintenant 50 à 100 microlitres de culture de Bacillus subtilis aux inserts bactériens à 24 puits et insérez-les dans le dessus du Flipwell. Faites pivoter le bras et suspendez-le au bord de la pile d’inserts Flipwell co-culture. Tiens la pile avec la deuxième série de pinces stériles.

Après une incubation de trois heures, utilisez des pinces stériles pour retirer l’insert bactérien du Flipwell. Placez le Flipwell dans un tube conique de 50 millilitres sans le démonter. Pour démonter le Flipwell pour la microscopie électronique, tenez-le à deux mains et détachez chaque partie collée de la pile.

Faites tourner l’insert avec la membrane et posez-le en la faisant face vers le haut. Tenez l’insert, découpez soigneusement la membrane avec une lame de scalpel, puis placez-la dans un tube de 1,7 millilitre contenant une solution d’aldéhyde paraforme. Pour la microscopie confocale, ajoutez 300 microlitres de PBS stérile sur le côté apical.

Retirez soigneusement la pile de la boîte de Petri après avoir pipeté le PBS. Maintenant, retournez le Flipwell et ajoutez 300 microlitres de PBS sur le côté RPMI désormais orienté vers le haut de la pile d’insertion co-culture Flipwell, puis aspirez le sérum tamponné phosphate. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, créez une grosse gouttelette de PBS.

Enlevez l’ensemble de l’insert pour le séparer dans les inserts. Ensuite, positionnez soigneusement la pile Flipwell avec des cellules THP-1 au-dessus de la goutte de 200 microlitres de PBS. Ajoutez 200 microlitres de tampon de perméabilisation sur la face supérieure avec les cellules épithéliales du côlon et laissez reposer pendant 10 minutes.

Pour la coloration immunofluorescente, pipeter 300 microlitres d’anticorps primaire au sommet de l’insert. Ajoutez 300 microlitres d’anticorps primaire dans le puits d’une plaque à 12 puits, puis placez l’insert à l’intérieur du puits au-dessus de la gouttelette. Couvrez bien l’anticorps.

La coloration a montré des augmentations spectaculaires de la sécrétion de mucus dans le compartiment épithélial intestinal après un traitement à la sépiaptérine, comme l’indiquent les hausses de la protéine marqueuse épithéliale CK20 et de la protéine muqueuse MUC2. Dans les monocultures THP-1, le traitement par sépiaptérine augmentait significativement l’expression du marqueur macrophage M1 CD80, tout en modulant le marqueur macrophage M2 CD163, indiquant la polarisation M1. La microscopie électronique à balayage a révélé une augmentation de la sécrétion de mucus des cellules épithéliales dans des cocultures traitées séparément.

Le traitement par sépiaptérine a induit une morphologie des macrophages ressemblant au phénotype M1 dans les monocultures et les co-cultures. Les cellules bactériennes dans les monocultures traitées à la sépiaptérine présentaient des surfaces ridées, caractéristiques de la formation de biofilms.