כתמי גרם של חיידקים ממקורות סביבתיים

צביעת גרם מאפשרת הדמיה מהירה של מורפולוגיה חיידקית והבחנה תאית רחבה ממגוון רחב של דגימות סביבתיות. כדי להכתים חיידקים, מורחים מריחה אחידה על צד זכוכית ומניחים להתייבש. לאחר קיבוע החום של המריחה מוחל סגול קריסטל.

חומר מסיר צבע שוטף את הסגול הקריסטלי מתאים גראם-שליליים, אך לא תאים גראם-חיוביים. צבע שני, בדרך כלל ספרנין, משמש ככתם רקע להמחשת התאים הגראם-שליליים. לאחר הצביעה, ניתן להעריך את התאים עבור מורפולוגיה, גודל וסידור תאים, כגון שרשראות או אשכולות.

סרטון זה ידגים כיצד להכין דגימה סביבתית, לבודד את מיני החיידקים הנמצאים בה, ולבצע צביעת גרם על המושבות המבודדות

צביעת גרם מאפשרת לסווג את רוב החיידקים לשתי קבוצות מבניות רחבות: גרם חיובי וגרם שלילי. בעוד שלשתי המחלקות יש קרום פלזמה פוספוליפיד בסיסי, מבנה דופן התא משתנה מאוד. דופן התא הגרם חיובי מורכבת בעיקר משכבה עבה של פפטידוגליקן, שהוא פולימר המורכב מסוכרים וחומצות אמינו. לדפנות תאים גראם-שליליים יש שכבה דקה יותר של פפטידוגליקן, דחוקה בין קרום שומני שני. קרום חיצוני זה מכיל בדרך כלל ליפופוליסכרידים.

סגול הקריסטל הטעון חיובית נקשר חלש לדופן התא החיידקי הטעון שלילית. יוד גרם יוצר קומפלקס בלתי מסיס עם הצבע הסגול הקריסטלי, ובכך מקבע אותו בדופן התא.

במהלך שלב הסרת הצבע, הפפטידוגליקן בתאים הגראם-חיוביים מתייבש, מה שגורם לו להתכווץ וללכוד את קומפלקסי הסגול-יוד הגבישיים. בתאים גרם שליליים, חומר הסרת הצבע פוגע בקרום החיצוני, ומגדיל את נקבוביותו. זה מאפשר לשטוף את קומפלקסי הקריסטל הסגול-יוד.

כעת, לאחר שהבנתם את העקרונות מאחורי צביעת חיידקי אדמה בגראם, בואו נראה את התהליך שבוצע על חיידקי אדמה במעבדה.

לאחר איסוף דגימת אדמה בשדה, הביאו אותה למעבדה לניתוח. לחדד את הדגימה בעזרת מסננת, ולשקול 10 גרם מהאדמה המסוננת באמצעות איזון אנליטי.

יש לדלל את הדגימה ל-95 מ"ל של מי מלח ומערבולת עם חוצץ פוספט לערבוב. בצע 1 עד 10 דילולים נוספים, מערבולת בין כל דילול. העבירו כמויות של לפחות 3 דילולים רצופים, על גבי צלחות אגרוז דלות בחומרים מזינים.

לאחר עיקור להבת אתנול וקירור של מוט זכוכית כפוף על ידי הקשה על המדיה, מורחים את הדגימה על פני הלוחות. דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה של 3 עד 5 ימים, בחר את הדילול הגבוה ביותר עם 30 עד 300 מושבות בדידות. עם לולאת חיסון סטרילית, בחר מושבות מעניינות לבידוד.

פס את המושבה על חלק אחד של צלחת טרייה. עיקור הלולאה בין הפסים, צור פסים עוקבים בתבנית זיג-זג על כל חלק של הצלחת כדי לאפשר בידוד לאחר מכן של מושבות בודדות בדידות. דגרו את הצלחות למשך יום עד יומיים בטמפרטורת החדר.

כדי להתחיל בהכנת מריחות חיידקים, חבר קליפ למגלשת זכוכית שנוקה מראש כדי להקל על הטיפול. עבור כל מריחת חיידקים, נקה ועיקר להבה לולאת חיסון. הנח 2 לולאות של מים מזוקקים סטריליים על מרכז המגלשה.

לאחר עיקור הלולאה שוב, הסר כמות קטנה של תרבות ממושבה מבודדת, וערבב עם המים שעל המגלשה. חשוב לקרר את הלולאה לפני שנוגעים בתרבית על ידי הקשה על חלק לא מחוסן של אגר מספר פעמים. המריחה צריכה להידמות לחלב מדולל. הניחו לשקופית להתייבש בטמפרטורת החדר. לאחר הייבוש, יש לתקן את המריחה בחום על ידי העברתה במהירות דרך להבה.

לאחר הייבוש, יש להניח סגול קריסטל פיפטה על המריחה, ולהניח לשבת במשך 2-3 דקות. שטפו בזהירות את המגלשה במים מזוקקים על ידי כיוון הזרימה הישירה לכיוון החלק העליון של המגלשה, מה שמאפשר למים לזרום בעדינות כלפי מטה. אל תכוון את זרימת המים ישירות אל המריחה.

מכסים את השקופית ביוד של גראם. לאחר 2 דקות, יש לשטוף בעדינות במים מזוקקים. הסר את צבע השקופית עם 95% אתנול עד שהכתם כבר לא נשטף. יש לשטוף מיד במים מזוקקים. זה יגביל את הסרת הצבע יתר של המריחה.

הוסף ספרנין ככתם נגד למריחה למשך 30 שניות. זה יכתים את כל התאים הגראם-שליליים הקיימים. יש לשטוף בעדינות במים מזוקקים ולייבש בנייר סופג. התבונן בשקופית המתקבלת במיקרוסקופ. השתמש תחילה במטרה בהספק נמוך כדי לבצע התאמות גסות ולמצוא חלק אידיאלי של המריחה לפני שתעבור לשדה הקטן יותר של view של ההגדלות הגבוהות יותר.

לאחר הדמיה נוספת והתאמת המריחה עם יעד הספק בינוני, הוסף שמן טבילה ישירות למריחה. הנפט נחוץ למטרות הספק גבוהות שיספקו את המיקרוגרפיות הטובות ביותר. חיידקים גראם חיוביים יופיעו בצבע כחול או סגול, בעוד שתאים גראם-שליליים יהיו אדומים או ורודים. בנוסף למבנה דופן התא, הצורה והסידור מובהרים מהמיקרוגרפים המתקבלים.

היכולת של צביעת גרם לחקור חיידקים באופן איכותי חשובה למגוון רחב של תחומים מדעיים.

אדמה היא רק אחד המקורות הסביבתיים שמהם ניתן לבודד ולנתח חיידקים. למי שתייה יש לשנות את הכנת הדגימה. ניתן לשאוב דגימות של מי ברז מברז, ולצפות אותן על מצעי גידול המאפשרים צמיחה של מושבות חיידקים הטרוטרופיות מגוונות. עם ציפוי על מדיום כגון R2A, התהליך כמעט זהה להליך האדמה.

עבור טכניקות זיהוי חיידקים מסוימות, הפרמטרים תלויים בסוג דופן התא של החיידקים המעניינים. בדוגמה זו, נבדק דם של חולה ספטי ונמצא כי הוא מכיל חיידקים גראם-חיוביים.

עם מידע זה, נבחרו בדיקות חומצות גרעין פפטידיות ספציפיות למין שייקשרו ל-rRNA של התאים. בדיקות אלה נקשרו לצבעי פלואורסצנט ששימשו לזיהוי המינים הקיימים.

בגלל ההבדלים המהותיים במבנה התא גרם חיובי ושלילי, לחיידקים יש תגובות ייחודיות לתרכובות אחרות מלבד סגול קריסטל. ניסוי זה ביקש לבודד את קלוסטרידיום דיפיצילה, חיידק גרם חיובי, מדגימות צואה. ציקלוסרין, המעכב את צמיחתם של תאים גראם-שליליים, נוסף לצלחת האגר. התאים הגראם-חיוביים שגדלו על הצלחת בודדו עוד יותר בשיטות אחרות.

זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE לצביעה של Gram למחקרים סביבתיים. כעת עליך להבין את היתרונות של התהליך וכיצד לבצע את הטכניקה ולנצל את התוצאות. תודה שצפית!