$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, או HPLC, היא טכניקה רב-תכליתית המפרידה בין רכיבים של תערובת נוזלית על סמך האינטראקציות השונות שלהם עם פאזה נייחת.
HPLC הוא עיבוד של כרומטוגרפיה של עמודות. בכרומטוגרפיה של עמודות, עמודה עמוסה בחרוזים בקנה מידה מיקרו הנקראים השלב הנייח. חרוזי הפאזה הנייחים מתפקדים עם קבוצות כימיות הגורמות לאינטראקציה בין החרוז למרכיבי התערובת הממוקמת בשלב הנוזלי או הנייד. כאשר התערובת זורמת דרך העמודה, הרכיבים מתקשרים עם השלב הנייח בצורה שונה.
ב-HPLC, כרומטוגרפיה של עמודות מבוצעת בקצב זרימה גבוה יותר, ולכן בלחץ גבוה יותר, מאשר כרומטוגרפיה של עמודות קלאסיות. זה מאפשר שימוש בחרוזי פאזה נייחים קטנים יותר עם יחס שטח פנים לנפח גדול יותר, מה שמגדיל מאוד את האינטראקציה של השלב הנייח והרכיבים בשלב הנייד.
סרטון זה יציג את יסודות הפעולה של HPLC על ידי הדגמת הפרדת הרכיבים של משקאות מוגזים דיאטטיים שונים.
ישנם שני סוגים של HPLC המשמשים במעבדה: אנליטי ומכין. ב-HPLC אנליטי, המכשיר משמש לזיהוי רכיבים בנפח קטן, ולאחר מכן הדגימה המנותחת מושלכת כפסולת. ב-HPLC מכין, המכשיר משמש לטיהור תערובת וכמות רצויה של כל רכיב נאספת בשברים.
מכשור ה-HPLC מורכב מסדרה של רכיבים פשוטים. ראשית, השלב הנייד, המוחזק במאגרי ממס, נשאב דרך המערכת על ידי משאבה אחת או יותר בקצב זרימה קבוע. הדגימה מוזרקת לזרם הפאזה הנייד על ידי מזרק הדגימה. הדגימה, המדוללת על ידי השלב הנייד, מועברת לאחר מכן לעמודת HPLC, שם מופרדים רכיבי הדגימה. לאחר מכן הרכיבים מנותחים על ידי הגלאי, ונשמרים בשברים לשימוש מאוחר יותר, או מועברים לבקבוק פסולת.
עמודת ה-HPLC היא המרכיב העיקרי במערכת. הוא מורכב מגליל מתכת או פלסטיק, ארוז בחרוזים בקנה מידה מיקרו של פאזה נייחת, או שרף כרומטוגרפיה. תערובת הדגימה זורמת דרך מצע החלקיקים הארוז בקצב זרימה קבוע וכל רכיב מקיים אינטראקציה עם השלב הנייח כשהוא זורם.
התרכובות מקיימות אינטראקציה עם הפאזה הנייחת בצורה שונה, ולכן עוברות לאורך העמודה לגלאי בקצב שונה. הזמן הנדרש לרכיב לצאת מהעמודה, או להרטה, נקרא זמן השמירה. התוצאה היא תרשים של זמן שמירה לעומת עוצמה, או כרומטוגרמה. זמן השמירה משמש לזיהוי הרכיב. גודל השיא, במיוחד השטח שמתחת לשיא, משמש לכימות כמות התרכובת בתמיסה הראשונית.
הבחירה בשלב נייח תלויה בתכונות הרכיבים בתערובת הדגימה. השלב הנייח הנפוץ ביותר הוא חרוזי סיליקה, מכיוון שהם חומר לא קוטבי אינרטי היוצר חרוזים בקנה מידה מיקרו, ומשיג צפיפות אריזה מספקת. הסוג הנפוץ ביותר של HPLC הוא כרומטוגרפיה בשלב הפוך, המשתמשת בשלב נייח הידרופובי, בדרך כלל חרוזי סיליקה עם שרשראות C18 המחוברות לפני השטח של החרוזים. הרכיבים נפלטים לפי סדר ירידה בקוטביות.
השלב הנייד המשמש בכרומטוגרפיה בשלב הפוך הוא בדרך כלל תערובת של מים וממס אורגני, כגון אצטוניטריל. בהתאם לדגימה, השלב הנייד יכול להישאר יחס קבוע של מים וממס אורגני, המכונה מצב איזוקרטי. עם זאת, זה יכול להוביל לפסגות רחבות, במקרה של תכולת מים גבוהה, או פסגות חופפות, במקרה של תכולה אורגנית גבוהה.
ניתן לשנות את יחס הפאזה הנייד גם באופן ליניארי או צעד במהלך ההפרדה, כדי ליצור שיפוע פאזה נייד. פליטת שיפוע יכולה למנוע הרחבת שיא של הרכיבים הפחות קוטביים, ובכך לשפר את ההפרדה ולקצר את זמן הפליטה.
כעת, לאחר שהותוו היסודות של HPLC, טכניקת HPLC תודגם במעבדה. בניסוי זה, HPLC ישמש להפרדה וכימות של שלושה מרכיבים נפוצים של סודה דיאטטית.
ראשית, כדי להכין את השלב הנייד, הוסף 400 מ"ל אצטוניטריל ל -1.5 ליטר מים מטוהרים. לאחר מכן הוסיפו בזהירות 2.4 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית מדללים את התמיסה לנפח כולל של 2 ליטר. התמיסה המתקבלת צריכה להיות בעלת pH בין 2.8 ל -3.2.
התאם את ה-pH ל-4.2 על ידי הוספת 40% NaOH, טיפה לתמיסת הערבוב, באמצעות מד pH מכויל.
סנן את השלב הנייד דרך מסנן ממברנה של 0.47 מ' תחת ואקום כדי להסיר את התמיסה ולהסיר מוצקים שעלולים לסתום את העמוד. חשוב לנקות את התמיסה, שכן בועות עלולות לגרום לחללים בשלב הנייח, או לפלס את דרכן לתא הגלאי ולגרום לחוסר יציבות במדידות.
הכינו שלושה תמיסות מרכיביות של קפאין, בנזואט ואספרטיים, שהם שלושה מרכיבים אופייניים של משקאות מוגזים דיאטטיים. פתרונות רכיבים אלה משמשים לאחר מכן להכנת הפתרונות הסטנדרטיים שישמשו לקביעת הלא ידועים. הכינו 500 מ"ל מתמיסות הקפאין והבנזואט.
הכן 100 מ"ל מתמיסת רכיב האספרטיים. אחסן את התמיסה במקרר כאשר אינה בשימוש כדי למנוע ריקבון.
לאחר מכן, הכינו 7 תמיסות סטנדרטיות, כל אחת עם ריכוזים שונים של קפאין, בנזואט ואספרטיים. זרקו את הכמות הנכונה של כל רכיב לבקבוק נפחי, ודללו לסימון 50 מ"ל עם פאזה ניידת.
שלושת הפתרונות הראשונים מכילים כל אחד רכיב אחד, כדי לאפשר זיהוי שיא. 4 התמיסות האחרות מכילות טווח ריכוזים של כל 3 המרכיבים, על מנת לתאם את שיא הגובה לריכוז.
יוצקים כל תמיסה סטנדרטית לבקבוקון מסומן במתלה לדוגמה. אחסן את מתלה הדגימה עם דוגמאות ואת שאר התמיסות במקרר.
ראשית, הגדר את השלב הנייד ומכולות הפסולת. ודא שקווי הפסולת מוזנים למיכל פסולת, ואינם ממוחזרים בחזרה לשלב הנייד. ודא שקו הפאזה הנייד של הכניסה מוזן לתוך מיכל הפאזה הנייד.
ודא שקצב הזרימה של השלב הנייד מוגדר ל-0.5 מ"ל/דקה. קצב זרימה זה יאפשר לכל הרכיבים להיפלט תוך 5 דקות, אך הוא איטי מספיק כדי להבטיח פתרון של פסגות בודדות.
לאחר מכן, ודא את הלחצים המינימליים והמקסימליים על מערכת אספקת הממס. הגדרות אלה מכבות את המשאבה במקרה של נזילה או סתימה, בהתאמה.
לחץ על "אפס" בלוח הקדמי של הגלאים, כדי להגדיר את הריק. לשטוף 100-? מזרק L עם מים נטולי יונים, ואז עם כמה נפחים של 1 מתוך 7 תקני העבודה. לאחר מכן מלאו את המזרק בתמיסה זו. התחל עם 3 הדגימות החד-רכיביות על מנת לזהות את השיא של כל רכיב.
לאחר מכן, הזרקו ידנית את התמיסה, על ידי הנחת ידית המזרק במצב העומס. להזריק לאט את ה-100? L של תמיסה דרך יציאת המחיצה.
ודא שתוכנית איסוף הנתונים מוגדרת לאסוף נתונים למשך 300 שניות, מה שמאפשר מספיק זמן לכל 3 הפסגות לחלוף דרך הגלאי. כאשר מוכנים להתחיל בניסוי, סובבו את ידית המזרק למצב ההזרקה, על מנת להזריק את הדגימה לשלב הנייד. מיד, לחץ על "התחל ניסיון" בתוכנית איסוף הנתונים. לאחר השלמת הסריקה, חזור על התהליך עבור כל אחד משבעת הפתרונות הסטנדרטיים. עבור כל אחד משלושת התקנים הראשונים מופיעה רק אחת משלושת הפסגות. שימו לב למיקום השיא, המשמש לזיהוי הרכיב.
בחר 3 דגימות סודה דיאטטיות, ואפשר להן לשבת בחוץ במיכלים פתוחים למשך הלילה כדי להסיר את הגז.
לאחר הסרת גז למשך הלילה, יש לשאוב כ-3 מ"ל מכל סודה דיאטטית למזרק פלסטיק. לאחר מכן, חבר קצה מסנן למזרק ודחף את הסודה דרך המסנן לבקבוקון זכוכית, על מנת להסיר חלקיקים מוצקים.
יש לדלל 2 מ"ל מכל דגימה עם 2 מ"ל מהשלב הנייד כדי להפחית את ריכוז הסודה בחצי.
תיקו 100? L של אחת מדגימות הסודה לתוך מזרק, ולהזריק אותה ללולאת הדגימה. הפעל את גירסת הניסיון עם פרמטרים זהים לפתרונות הסטנדרטיים. חזור על הפעולה עבור כל דגימת סודה.
ראשית, מתאם את אזורי השיא של הדגימות הסטנדרטיות לריכוזים הידועים. לשם כך, קבע את אזורי השיא בכרומטוגרפים עבור כל דגימה סטנדרטית בשיטה המשולשת. חשב את זמני גובה השיא עם הרוחב במחצית הגובה, והשתמש בערך זה כאזור השיא.
שימוש בשטח השיא והריכוזים הידועים יוצר עקומת כיול עבור כל רכיב, וקובע את התאמת הריבועים הפחותים עבור כל עקומת כיול.
חשב את הריכוז של כל מרכיב במשקאות הדיאטה מאזורי השיא. זכור שכל המשקאות המוגזים דוללו בפקטור של 2 לפני ההזרקה ל-HPLC. על סמך תוצאות אלה, חשב את המ"ג של כל רכיב בפחית סודה של 12 אונקיות.
באופן לא מפתיע, כל 3 המשקאות המוגזים שנבדקו הכילו בערך את אותה כמות של החומר המשמר בנזואט. עם זאת, מוצרי הקולה הכילו יותר קפאין. הערכים המחושבים עבור כל הרכיבים תואמים היטב לערכים המדווחים על ידי היצרנים.
HPLC הוא מכשיר רב תכליתי, המשמש במגוון רחב של ניתוחים.
HPLC משמש לעתים קרובות לטיהור מולקולות פפטיד. בדוגמה זו הוכנו קומפלקסים של פפטידים טרנסממברניים, ולאחר מכן יוצבו על ידי קישור חמצוני של החלבונים עם קשרי דיסולפיד.
לאחר מכן החלבונים הומסו בחומצה פורמית, וטוהרו באמצעות HPLC בשלב הפוך. לאחר מכן הדגימה נפלטה באמצעות שיפוע ליניארי של שני ממיסים, והטוהר אושר באמצעות ספקטרומטריית מסה.
HPLC יכול לשמש גם לזיהוי תרכובות אורגניות המסונתזות במעבדה. בניסוי מילר-אורי נחקרה הסינתזה האביוטית של תרכובות אורגניות על כדור הארץ הקדמון. גזים קדמוניים, כמו מתאן ואמוניה, הוכנסו לבקבוק שהכיל מים, המדמים אוקיינוסים מוקדמים. לאחר מכן הופעלה פריקה חשמלית, המחקה ברקים על כדור הארץ הקדמון.
לאחר מכן נותחו המים באמצעות HPLC בשילוב עם ספקטרומטריית מסה, והושוו לתקני חומצות אמינו ידועים. 23 חומצות אמינו סונתזו וזוהו בניסוי זה.
זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE ל-HPLC. כעת עליך להבין את היסודות של הפעלת המכשיר, וניתוח הנתונים המתקבלים.
תודה שצפית!
