אנו מתארים את ההסתגלות של טומוגרפיה הקרנה האופטית (OPT) 1 להדמיה בספקטרום הקרוב אינפרא האדום, והיישום של מספר הכלים חישוביים. פרוטוקולים אלה מאפשרים הערכות של מסת β-תאי לבלב (BCM) בדגימות גדולות יותר, להגדיל את הקיבולת רב של הטכניקה ולשפר את איכות נתוני שטחים כבושים.
מאמר שיטה
קרוב אינפרא האדומה האופטית טומוגרפיה תחזית להערכות של חלוקת מסת β-תאים בחקר הסוכרת
* These authors contributed equally
במאמר זה
הודעת תיקון
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
סיכום
תקציר
על ידי התאמה כבושה לכלול יכולת ההדמיה בספקטרום האינפרא האדום הקרוב (NIR), אנחנו כאן ממחישים את האפשרות לגופי תמונות גדולים יותר של רקמת לבלב, כגון לבלב החולדה, ולהגדיל שעשויה מספר הערוצים (סוגי תאים) להיחקר בדוגמה אחת. אנחנו עוד יותר לתאר את היישום של מספר הכלים חישוביים המספקים: מיצוב 1 / מדויק של דגימה (במקרה שלנו בלבלב) מרכז המסה (COM) בציר הסיבוב (ע"ר) 2; 2 אלגוריתמים / משופרים להודעה יישור כוונון המונע עיוותים גיאומטריות במהלך טומוגרפית השיקום 2 ו 3 / פרוטוקול להשוואת עוצמת להגדיל אות לרעש ביחסי קביעות BCM הכבושים מבוססות 3. בנוסף, אנו מתארים בעל מדגם שממזער את הסיכון לתנועות מכוונות של הדגימה בתמונת רכישה. יחד, פרוטוקולים אלה מאפשרים הערכות של הפצה וoth BCMתכונות אה, שיש לבצע בכל היקף pancreata השלם או איברים אחרים (למשל, במחקרים של איון השתלה) עם רזולוציה עד לרמה של איים בודדים לנגרהנס.
מבוא
מייצר האינסולין β-תאים הם מפתח ליכולת של הגוף לשלוט הומאוסטזיס הגלוקוז בדם. לכן, הערכות של הפצת BCM לבלב הן הכרחיות לתחומים רבים של מחקר סוכרת טרום קליני. בהערכות של משטרים טיפוליים לדוגמה, ההשפעה של אבלציה גן הממוקד בבידול האנדוקרינית תא או מחקרים של אטיולוגיה סוכרת במכרסמים למחלה לעתים קרובות תלויה בניתוחים מסוג זה. באופן מסורתי, אלו סוגים של ערכות הסתמכו על גישות לצרוך זמן stereological שקשה לבצע בשל הגודל והחוקה האנטומי מורכבת של הלבלב. גישות הדמיה ברזולוציה גבוהה ביותר כיום (בדרך כלל אופטי), אינם מספקות עומק חדירה מספיק כדי לאפשר הדמית לבלב כולו במכרסמים. לעומת זאת, גישות הדמיה, שאינם מוגבלות על ידי עומק החדירה שלהם (בדרך כלל גרעיני) לספק לרזולוציה נמוכה כדי לפתור את הפצת BCM המלאה והם הקשובשל המחסור בסוכנים בניגוד הולם 4,5.
טומוגרפיה הקרנה האופטית היא שיטת הדמית 3D, המאפשרת הערכות ברזולוציה הגבוהה של הדגימות ביו במ"מ לקנה מידת הסנטימטר 6. בזאת, מידע על המיקום והנפח של אינסולין האדם להביע איים לנגרהנס המרחבית עשוי להיות מופק בכל הנפח של הלבלב בעכברים נורמלים וסוכרתיים 3,7-10. מטרת המחקר הנוכחי היא לשפר את היכולת של טכניקה זו להערכת לבלב β-תאים נוספים; הפצת אנדוגני, כאשר הושתלו לתוך רקמות אחרות, הקשר שלהם לבוחרי לבלב אחרים (כגון החדרת סוגי תאים) וגדול יותר הכנות לבלב יותר אפשרי בעבר.
טומוגרפיה קרובת אינפרא האדומה אופטי ההקרנה (ניר-OPT) ההתקנה
בהמשך הפרוטוקולים, סורק כבוש מבוסס על הסדרה המקורית תוארה על ידי שארפ 1 et al, מותאם להדמיה בטווח הקרוב אינפרא האדום מתואר ומשומש. להערכות ערוץ אחד של לבלב העכבר (למשל של BCM), SkyScan 3001 סורק (Bioptonics) עשוי לשמש.
מנורה הליד מתכת המספקת אנרגית עירור גבוהה יותר מאשר מנורת קשת כספית באורכי גל מעל 650nm, מספקת אור העירור. האור מועבר באמצעות אור מדריך נוזלי. שילוב שימושי של fluorochromes ומסננים מעבירים פס לניר דימות פלואורסצנטי והפרדת ערוץ מוצג באיור 3. האור הנפלט מזוהה עם מצלמת CCD מואר מאחור, עם יעילות הקוונטית גבוהה בספקטרום הניר. סריקת השטחים הכבושים היא אוטומטית באמצעות פלטפורמת LabVIEW ששולטת במצלמה ומנוע צעד. כדי לתמוך בדגימות בגודל של pancreata השלם חולדה, מראה מצופה כסף מוגן וקובט גדול משמש. לבסוף, בעל מדגם שמבטל movemen האנכי לא רצויts של המדגם במהלך הסריקה תוכנן.
פרוטוקול
1. לדוגמא הכנה וסריקה
הכנת דוגמאות 1.1
ההליך הבא מבוצע למעשה כפי שתואר לעיל 7.
- לקצור את הלבלב. השתמש PBS קר כקרח, כדי למנוע הידרדרות פרוטאוליטי.
- לתקן רקמות ב4% PFA ב PBS על קרח ל2-3 שעות. ודא את אונותיהם "פרוש" בקיבעון. זה יקל על זיהוי של אתרים אנטומיים לאחר שיקום.
- שטוף בPBS העודף למשך 30 דקות.
- מייבש את הלבלב בשלבים שמתנול (33, 66%, 100%), 15 דקות / צעד. הדבר מצמצם את היווצרותן של בועות בהלבנה (ראה שלב 5) ומונע הרס של תאים בהקפאת הפשרה-(ראה שלב 7).
- דגירת הרקמות בMeOH המוכן טרי: H 2 O 2: DMSO הלבנת חיץ ב02:01:03 יחס בRT עבור 24 שעות כדי להרוות פלואורסצנטי הרקמה אנדוגני. לקבלת דוגמיות, החלפה גדולה יותר לbleachi החדשחיץ ng ודגירה במשך שעות 24 נוספות.
- שטוף בMeOH העודף, ON.
- הקפאה, הפשרה לפחות 5 מחזורים ב-80 ° C - RT כדי להקל חדירת נוגדן.
- Rehydrate שלבים חזרה לTBST (33, 66%, 100%), 15 דקות / צעד.
- בלוק בTBST עם סרום 10% (רצוי מאותו המין שבו הנוגדן המשני שנוצר), 5% DMSO ו0.01% NaAz עבור 12-24 שעות בRT
- דגירה עם נוגדנים עיקריים בחסימת חיץ עבור 48 שעות, בRT, להאריך עד 72 שעות לדגימות גדולות (נוגדנים המשמשים כאן מופיעים בטבלה של חומרים כימיים).
- שטוף בTBST העודף, ON.
- דגירה עם נוגדנים משניים fluorescently מצומדות עבור 48 שעות, בRT, להאריך עד 72 שעות לדגימות גדולות.
- שטוף בTBST העודף, ON.
1.2
ההליך הבא מתאר כיצד לעלות במדגם agarose ולצרף אותו לבעל המדגם בהתאמה האישי (ראה איור 7) לפני opt סריקה.
- הפרד את אונות טחול, קיבה והתריסריון לפי דמות 3A בHörnblad אח' 3. הקשר בין האונות עוד מובהר בHörnblad et 11 al.
- הכן 1.5% (w / v) הנמוך ההיתוך agarose טמפרטורה בDH 2 O, מסנן, תאפשר לקירור עד 37 ° C ולשטוף את הרקמה בDH 2 O כדי לשטוף את חומר הניקוי ולהסיר בועות לפני ההטבעה-agarose על קרח.
- גזור את בלוק agarose צרף המדגם שלך ולהשאיר ~ spacer 1 סנטימטר בין המדגם ובסיס agarose. קיצוץ קצוות חדים (≤ 90 °) של בלוק agarose כדי להפחית את פיזור אור.
- מייבש את המדגם בשלבים שMeOH (33, 66%, 100%), המאפשר זמן לאזן בין כל שלב. כאשר הדגימה נועצה אותה נחשב למתאזנת.
- נקה את המדגם ב01:02 פתרון של אלכוהול בנזיל: נזיל נץoate (באב) עד שהוא הופך שקוף. פתרון Exchange אב ודגירה במשך 12 שעות נוספות.
- מקם את המדגם פינה בבעל המדגם ולאבטח אותו על ידי הוספת 2 מחטים דרך spacer agarose דרך החורים שנקדחו במסגרת של הבעל.
- הנח את הדוגמא בסורק ומציב אותו לקובט מלא פתרון סליקת אב. כאשר משווה סדרה של pancreata אותה ההגדלה צריכה לשמש לכל הסריקות. ההגדלה צריכה להיות מותאמת למדגם בגודלו בסדרה.
1.3 מיקום של דגימה בAR
הפרוטוקול הבא מתאר את ההליך בדיוק למצב את המדגם באמצעות אלגוריתם COM-AR. הליך זה חל רק כאשר ההחזר על ההשקעה כולל את כל הדגימה. לתיאורים מפורטים של האלגוריתמים, אנא ראה Cheddad אח' 2.
- לרכוש תמונות של הדגימה בשתי עמדות לבוטשעתי אנטומיה וערוצי אות. 1 עמדה ב0 ° (קשור לציר ה-X), ומציג את השטח הגדול ביותר הקרנה, ומצב 2 ב 90 מעלות (הקשור עם Z-הציר). אנחנו משתמשים בערוץ ה-GFP לדמיין את האנטומיה.
- החל ציפייה-מקסום האלגוריתם (EM) על תמונות אנטומיה לסף את ההחזר על ההשקעה.
- לחשב את נקודתי COM (x-קואורדינטות) של תמונות בינאריות המתקבלות בשלב 2 עבור 0 המעלות ו 90 מעלות תחזיות.
- ערימה של קו אנכי עובר דרך נקודת COM זיהתה מחושבת בשלב 3 וב0 ° 90 ° תמונות של ערוץ האות.
- השתמש בתמונות שנרכשו בשלב 4 כהפניות לעבור את המדגם כך שקו מרכז שדה התצוגה עובר דרך נקודתי COM נמצאו במדגם.
1.4 סריקה
- התאם זמני חשיפה כדי להשיג את האות לרעש הגבוהה ביותר האפשרי ללא saturaטינג כל אזורים בהקרנת התמונות. חזור על פעולה עבור כל הערוצים לסריקה.
- בחר את ערכת המסנן עבור ערוץ פלואורסצנטי הראשון שנסרק. פליטה מfluorophores λ הקצר עשויה לרגש fluorophores עם λ יותר ובכך לגרום לתמונה לבנה. כדי למזער את האפשרות הזאת, לסרוק fluorophore עם λ עירור הארוך ראשון.
- לפתוח את התריס כדי להאיר את המדגם ולאסוף את אות פלואורסצנציה מעל 360 מעלות, מסתובב המדגם לאורך הציר האנכי לכל ערוץ. זווית הצעד משמשת להגדרת ניר-הכבושה היא 0.9 מעלות ול0.45 ° סורק Bioptonics 3001.
- בחר במסנן המתאים לערוץ הבא ולהמשיך כאמורים לעיל.
2. עיבוד ושיקום חישובית
2.1 איתור ותיקון (ערך כוונון) חוסר לאחר רכישה
בטומוגרפיה הקרנה, זה בכלל נחוץכדי להקצות ערך לאחר יישור לתחזיות לעמדה לכוונן תמונות לאורך ציר הסיבוב לפני שיחזור. עם זאת, סטייה קטנה בזווית של המצלמה לכיוון הציר האופטי יכולה לגרום לא אחידי A-ערכים לאורך של מדגם ובכך לגרום לעיוותים גיאומטריות. כדי להימנע מעיוותים כאלה, שיטה חישובית כדי למצוא את הערך לאחר היישור המדויק ואחיד (ערך) לאורך כל הדגימה ניתן להחיל 2.
- השתמש פורה בדיד להפוך לחלק ההקרנה של אות המסוימת ב0 ° 180 מעלות ולמרחק של 8 רחובות גובה פיקסלים ולחשב את השינוי לאורך ציר X (הערך) בין כל בלוק.
- החל רגרסיה לינארית ריבועים לפחות כדי לעזור לחשב את זווית θ ', המתאר את השיפוע של ציר ה-X-SHIFT לאורכו של הממצא, ולמצוא נקודת מרכז סיבוב.
- תקנת לmisalignments במהלך סריקה על ידי סיבוב כל projections θ '/ 2 סביב נקודת מרכז הסיבוב.
השוואת 2.2 ניגודיות מוגבלת אדפטיבית היסטוגרמה (CLAHE)
כדי להקל על איתור ופילוח של אובייקטים (איים) מציגים אותות חלשים מאוד, הנמצאים בסיכון ל" thresholded החוצה "במהלך שיקום ו / או פילוח להערכות כמותיות, אלגוריתם CLAHE ניתן להחיל את הקרנת תמונות. פעולת CLAHE מתבצעת עם שתי תמורות עיקריות בעצמה:
- לעומת המקומי מוערך והשווה בתוך גושים שאינם חופפים בתמונת ההקרנה.
- העוצמות אז מתנרמלים באזורי הגבול שבין בלוקים באמצעות אינטרפולציה bilinear.
שם ניגוד המוגבל מתייחס למגבלת קליפ, אשר מוגדרת להימנע פיקסלים להספיג בתמונה. בפרוטוקול זה, MATLAB פונקציה מובנית "adapthisteq" היה בשימוש ומיושם עם ג ברירת המחדל מגבלת שפה של 0.01 וגודל אריח של 256. שים לב, בגודל האריח האופטימלי צריך להיבדק באופן אמפירי ויכול להשתנות בהתאם לדגימה נתחה. פרטים נוספים על האלגוריתם ודוגמאות ניתן למצוא בHörnblad אח' 3.
הערה! צעדים המפורטים לעיל חישוביות לעיבוד (כולל COM-AR, כוונון ערך וCLAHE, ראו 1.3-2.2) בנויים על אלגוריתמים סטנדרטיים ומבוצעים בMATLAB (Mathworks).
2.3 טומוגרפית שחזור ועיבוד ISO-משטח
- באמצעות אלגוריתם מסונן חזרה הקרנה, תמונות והתיקן מנורמלים עשויות כעת ניתן לשחזר עם פיצוי חוסר אחיד ודרישה מינימאלית לאופטימיזציה של טווח דינמי. בפרוטוקול זה, כל השחזורים מתבצעים באמצעות שיטת ההקרנה האחורית המסוננת הזמינה בNRecon התוכנה (Skyscan), 1.6.8 גרסה (= "_blank"> Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). שים לב, הגדלה של אובייקט הדמיה תלוי במרחק שלו מנקודת המוקד של העדשה, אלא אם כן גיאומטרית קורה מקבילה מיושמת בהתקנת ההדמיה. לכן, בעת יבוא לבסיס נתוני הקרנת תוכנת NRecon זה חשוב לכלול את האובייקט הנכון למרחק מקור (מ"מ) וכיוון סיבוב של הסורק (לקלט "סמ"ק" נגד כיוון שעון ושעון עבור קלט "CW") בליווי קובץ היומן, כדי להימנע מחפצים מושרים קורה חרוט במהלך שיקום.
- כדי להמחיש ולכמת את ערימת חלקים וירטואליים מתקבלים, להפיק-iso משטחי 3D באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מתאימה כגון Imaris או Volocity.
בידוד האיון Murine ונהלי השתלה בוצעו בעיבוד סוכרת המחקר של מכון Preclinical הסלולרי ו-Core הדגם Translational תחת פרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי אוניברסיטת Miamאני טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדה ושימוש. ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים, צפון שבדיה, אושרה כל הניסויים האחרים הקשורות בבעלי חיים.
תוצאות
בדו"ח הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול להפקה והעיבוד ממוחשב של נתוני BCM בpancreata המכרסם (וברקמות אחרות) באמצעות ניר-כבוש (1 איור). כפי שמודגם באיור 2, autofluorescense רקמה מדגימת לבלב הוא כצפוי ירידה ניכרת בספקטרום הניר. זה מוביל לעלייה משמעותית בממוצע אות לרעש (S: N) יחס להערכת איוני כותרת אינסולין לנגרהנס. על ידי העיבודים של שטחים כבושים להדמיה בחלק הניר של הספקטרום, כפי שתואר כאן, לפחות שלושה ערוצים ספציפיים עשויים להיות דמיינו עם S המספק: N יחס כדי לאפשר הערכות של תאים מסוגי נוגדנים שכותרתו לאורך היקף הלבלב העכברי עם מובחן הפרדת ערוץ (ראה איור 3 ו 4). יחול על הדמיה של תהליכי diabetogenic ו / או הערכות BCM באופן כללי, הטכניקה ובכך מאפשרת הדמיה וכימותאזורי אינסולין חיוביים ביחס לסביבה ו / או אינטראקצית סוגי תאים (ראה איור 4). הערכות אלה הן בזכות עומק חדירת הרקמה המוגברת מתקבל בטווח האפשרי הניר לבצע בדגימות גדולות בהרבה מאשר בעבר, לרבות בלבלב בחולדות, שהוא גדול יותר ממקבילו 3-5 פעמי העכבר שלו (ראה איור 5). בין אם אור הנראה או ניר מנוצל, יישום CLAHE עשוי להקל באופן משמעותי opt הערכות מבוססות של BCM בתנאים גנטיים ופיסיולוגיים שונים על ידי גברת רגישות זיהוי של הטכניקה (ראה איור 6). תכנית לבעל המדגם פתח מוצגת באיור 7.
איור 1. תרשים זרימה המתאר את השלבים הקריטיים לניתוחים המבוססים על שטחים כבושים של BCM בMurלבלב ine. הזמן הנדרש כדי להעריך לבלב עכבר טיפוסי הוא 13-14 ימים. רוב הזמן הוא נצרך במהלך עיבוד רקמות וimmunohistochemical מכתים (10 ימים), סליקת רקמות דורשת כ 2 ימים אילו האורך של הסריקה תלויה בזמן החשיפה הנדרשת (שעות בדרך כלל סביב 1). העיבוד חישוביים בהמשך בדרך כלל מתבצע תוך יום. שימו לב, פרוטוקול המכתים הארוך יחסית הוא אידיאלי עבור עיבוד יצווה של כמויות גדולות יותר של דגימות.
איור 2. אות לרעש יחס להערכות BCM באורכי גל שונים. אונת עכבר תריסריון לבלב, מוכתמת באינסולין ועם קוקטייל של נוגדנים משניים fluorochrome-מצומדות (Alexa 488, 594, 680 ו750), הייתה בשימוש כדי לקבוע S: יחסי N באורכי גל שונים. , A תמונות להראות את מסגרת ההקרנה הראשונה לכל ערוץ אות. ב ', גרף הממחיש את משמעות S: N עבור כל ערוץ אות. היחסים נקבעו כעוצמת איון הממוצעת (המבוסס על 215 איים קטנים) מחולקת בעוצמת הרקע (אנדוגני פלואורסצנטי הרקמה מהרקמה אקסוקרינית). ג, גרף מראה S: יחסי N לאיים הבודדים בכל ערוץ המנורמל S: N התקבלו לערוץ 594 אלקסה. דרך אחת ANOVA שמש לניתוחים סטטיסטיים. רמות משמעות מצוינת מתאימות ל** p <0.01. סרגל קנה מידה ב() מתאים ל1 מ"מ. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
דמות3. הפרדת ערוץ., נוגדנים מצומדות עם צבעי Alexafluor המפורטים בטבלה שניים היינו משותקת בנפרד על חרוזי proteinG-sepharose. B, חרוזי הניאון היו מוטבעים אז ברמות שונות בagarose פנטום וצלמו באמצעות מסננים שצוינו.
איור 4. Opt הדמיה רב מבוססת בחקר סוכרת., שטחים כבושים מבוססים שיקום ISO-פני שטח של לבלב (12 שבועות, אונת תריסריון) מהמודל לסוכרת מהסוג 1 הסוכרתי השמן ללא (NOD). הדגימה מוכתמת לאינסולין (איון β-תאים, פסאודו כחול); שריר α-תקטין (כלי דם, אדום) חלק וCD3 (הסתננות לימפוציטים, ירוק). הנוגדנים מהשניים המתאימים ננקטו; Cy3, IRDye-680 וDyeLight-750 בהתאמה.שיבוצים (A'-'' ') יציגו את ערוצי אות הבודדות. ב ', תמונה כבושה (מכה את ההשקפה) של אונת כבד עכבר (lateralis המרושע lobus) מורכבת עם איוני syngenic וצלמה בשבועות שלאחר השתלת הניר opt-. איי האינסולין מבטאים הם pseuodocolored בכחול והשרירים החלקים כולים חיוביים α-יקטינו מסומנים בצבע אדום. הגישה מאפשרת להערכות של הפצת שתל איון בתוך רשת כלי הדם. ברים בקנה המידה מתאימה ל1 מ"מ.
איור 5. ניר-כבוש מאפשר הדמיה של דגימות גדולות., טיוח Iso-פני שטח של הפצת BCM בלבלב עכברוש ממודל שומן צוקר לסוכרת מהסוג 2 (אונת טחול לאחר 9 חודשים), ומדגים את האפשרות לדגימת תמונה על החולדה היקף לבלב על ידי ניר השטחים פלשתינים כבוש. כפי שנקבעבעזרת טכניקה זו האונה המוצגת היא גדולה ~ פי 6 (v / v) ממקבילו עכבר ומטפחת 10139 אינסולין להביע איים לנגרהנס שנפח β-תאים מפצה 1.32% מהנפח הכולל ובולרי. ב ', סעיף מקביל לקו השבור () ממחיש שאיונים מכל מעמקי הרקמות מזוהים טומוגרפית. C, טיוח Iso-פני שטח של הפצת BCM בלבלב עכבר (אונת טחול לאחר 8 שבועות) מוצג כהתייחסות גודל. האונה מוצגת נמלי 2490 איונים מבטאים אינסולין שβ תא נפח מפצה 0.89% מהנפח הכולל ובולרי. Pancreata מגואלות באנטי אינסולין GP אחרי Alexa594 מצומדת עז נגד GP (עכבר) וחמור IRDye 680 מצומדת אנטי GP (חולדה) נוגדני בהתאמה. את הדגימות ב( AC) מתוארות לקנה מידה וסרגל קנה המידה ב( C) מתאים ל2 מ"מ.
איור 6. CLAHE מאפשר זיהוי של איונים בלבלב העכברי ידי הדמיה כבושה. AC, נציג תמונות ISO-משטח שניתנו שטחים הכבושים של לבלב C57Bl / 6 עכבר (אונת טחול לאחר 8 שבועות) מסומנת לאינסולין. שחזורי Iso-פני שטח של תמונות שטחים כבושים בוצעו לפני (ירוק, פסאודו צבעוני) ואחרי פרוטוקול CLAHE יושם (B, פסאודו אדום). ג', כיסוי של הנתונים שאינם המנורמלים ב() ואת עיבודי CLAHE ב( B). C'-C ", כיסוי הגדלה גבוה נציג (B) את התמונות הלא המנורמלות () וCLAHE מעובד. כפי שמוצג על ידי הנוכחות של" האי אדום בלבד ", תסריט CLAHE מאפשר זיהוי של אות קטנה ונמוכה איוני אינטנסיביות. בדוגמא הנוכחית הדגימה המתוארת (לאחר CLAHE עיבוד) טפחו 2419 איים בהיקף של 1.74 מ"מ 3 (מספרים מבוססים על נתוני הקרנת המעובד המקבילים היו 1057 Wi איוניםה בהיקף של 1.77 מ"מ 3). D ו-E, נתוני דוגמה משליטה (ד ') והמודל של עכברי ob / ob לסוכרת מהסוג 2 12 (ה') בגיל 6 חודשים ביישום פרוטוקול CLAHE. שים לב לעלייה הכללית המסיבית בגודל איון בלבלב ob / ob (E). ב( ד ') ו( ה') את מתווית הלבלב (אפור) מבוססת על האותות מautofluorescence רקמות. סרגל קנה המידה ב C הוא 500 מיקרומטר בזרם חילופין. סרגל קנה מידה ב-C "מתאים 200 מיקרומטר בC'' הבר. סולם ג 'ובדואר מתאים ל1 מ"מ (D) ו( ה). תמונות ב( AC) מעובדים מHörnblad אח' 3 ונוצרו באמצעות 3001 סורק Bioptonics.
איור 7. בעל מדגם לקובץ מצורף של דגימות שטחים כבושים. הדגימה הוא מאובטח על ידי החדרת מחטים דרך spacer agarose דרך החורים שנקדחו מראש, במסגרת. הבעל הוא צירים למנוע הצעד באמצעותמגנטים חזקים הממוקמים בבסיסו. התקנה זו משמיטה את השימוש בדבקים לא יציבים ומונעת תנועות לא רצויות של הדגימה במהלך הסריקה.
דיון
הטכניקות המתוארות לשטחי הדמיה מאפשרות מיצוי של פרמטרים מרחביים וכמותיים לאורך היקף הלבלב העכברי. בשל מגבלות ברזולוצית השגה עבור סוג זה של mesoscopic הדמיה יש לציין, כי כעבור רוב שיטות הדמיה, הדגימה גדולה יותר נמוכה הרזולוציה (למרות השימוש גבוה CCD ברזולוציה צריך להגדיל את הרזולוציה של שטחי הסריקה) . לפיכך, להערכת אונות עכבר לבלב תקינות, בטכניקה נוכחית אינה מספקת רזולוצית תא בודדה למרות שקרובים (15-20 מיקרומטר בקירוב) 7. ובכל זאת, להפקת הפצת BCM בלבלב עכבר הפרוטוקולים ספקו נתונים שיותר תתאימו גם לאלה שהושגו על ידי נקודה למשל ספירה morphometry 3,13 יש לציין כי למרות שיישומו של פרוטוקול CLAHE מאפשר זיהוי של איים באופן משמעותי יותר , האיים אלה הם בדרך כלל קטנים ולא contribuטה באופן מהותי להיקפים הכוללים β-התאים.
פרוטוקולי immunohistochemical המעורבים הם ארוכים יחסית (עד שבועות), אבל הידות בפועל בזמן להכנת דגימה הן קצרות ולכן הטכניקה מתאימה גם למחקר של קבוצות גדולות של בעלי חיים 9. אם הפוטנציאל של דפוסי תפוצה הטרוגנית הוא מוקד לחקירה, יש להדגיש שיש להיזהר בצעדים בנוגע לקיבוע ואת ההרכבה, כדי למנוע שרקמת הלבלב הופכת קבוע בדרך שלילית ושטוח ("פרוש" ) הר של הרקמה יש חתר לכדי להקל על הערכות אלה.
נושא חשוב בעת ביצוע כבוש הוא שCOM של המדגם קבוע על ציר סיבוב ושזה לא זז, או אנכי או אופקי, במהלך הליך הסריקה. לכן זה חיוני כדי להיות יציב התקנה מכאנית ומערכת מתפקדת היטב לattaching המדגם. אנחנו פתרנו את הבעיה על ידי בניית הר חדש (איור 7).
גיאומטריה מקבילה לא הייתה נכונה לניר שטחינו או סורק Bioptonics 3001, שזוהה כמשמרת אנכית בין החלק האחורי והקדמיות של אובייקטי העמדות היקפיים בהקרנת התמונות המוקלטות. על ידי התאמה למרחק אובייקט מקור בקובץ היומן של הסורק המתאים (ראה 2.3.1) אנו יכולים לשפר באופן משמעותי את איכות הנתונים שלנו ולתקן את העיוותים גיאומטריות לקצוות המרוחקים של הקרנת תמונות, וזה חשוב במיוחד כאשר הערכת דגימות גדולות.
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מספקים הצעה קובעת מסנן המאפשרים הדמיה של שלושה ערוצים ספציפיים שונים וערוץ "האנטומיה" בהערכות של הכנות לבלב שלמות. ברור שהגדרות אלה יכולים להיות מווסתות טובים יותר כדי להתאים את fluorochromes מנוצל למחקר נתון למרות, כמו עם כל הצורה של מנורות ניאוןמיקרוסקופיה אחוזים, הסיכון הפוטנציאלי של אות לדמם דרך יש להעריך בזהירות. המחקר של איוני אינסולין שכותרתו עם fluorochromes שמתלהבים מעל 750 ננומטר עדיין לא היה אפשרי על ידינו באמצעות מנורה הליד המתכת שהקבוצה שלנו עד מנצלת. ייתכן שמצלמה עם יעילות הקוונטית גבוהה אף יותר באורכי הגל הרלוונטיים בשילוב עם מקורות אור חלופיים (למשל לייזרי דיודה) יכולה להגביר את הפוטנציאל של ניר-כבוש נוספת ולאפשר הדמיה באורכי גל גבוהים יותר.
שטחי הדמיה היא טכניקה מאוד תכליתית עבור הערכות מרחביים וכמותית של דגימה ביו בסולם מ"מ-הסנטימטר. למרות שהפרוטוקולים שהוצגו כאן פותחו למטרה העיקרית של מחקר לבלב / סוכרת הם צריכים להיות אפשריים לתרגם למחקר על מינים אחרים, סוגי דגימה וטושים. על ידי הפוטנציאל לדמיין כמה ערוצים נפרדים בהכנות לבלב שלמות, ניר-כבוש הדמיה וurther בעל הפוטנציאל ככלי להעריך את הספציפיות הספיגה של חומר ניגוד המיועד להערכות בלתי פולשניות בשיטות הדמיה אחרות, כל עוד סוכנים בניגוד אלה יכולים להיות מתוכננים לבצע זיהוי על ידי fluorophore כבוש גם.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
ינדסטרום ד"ר פ 'הוא הודה למתן עכברי ob / ob. ג'יי הטונן הוא הודה על סיוע בהפקת וידאו וג' גילברט לעזרה בעריכה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון לחקר סוכרת הקרן (AP), סוכרת נעורי Research Foundation (AP וUA), הנציבות האירופיות (FP-7, הסכם גרנט לא:. CP-IP 228933-2) (JS ו UA), יסודות קמפ, Umeå האוניברסיטה ומועצת המחקר השבדית לUA
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב / חומרים | חברה | מספר קטלוגים | תגובות |
| מתנול | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H 2 O 2 | Scharlau | HI01362500 | |
| בנזיל אלכוהול | Scharlau | AL01611000 | |
| בנזיל בנזואט | Scharlau | BE01851000 | |
| הנמוך meltingpoint agarose | Lonza | 50100 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | סיגמה אולדריץ | 158127 | |
| DMSO | סיגמה אולדריץ | D5879 | |
| טריטון-x100 | סיגמה אולדריץ | T8787 | |
| עכבר אנטי תסמא-Cy3 | סיגמה אולדריץ | C6198 | נוגדן ראשוני |
| ארנב אנטי CD3 | סיגמה אולדריץ | C7930 | נוגדן ראשוני |
| גינאה חזיר אנטי תוספות | DAKO | A0564 | נוגדן ראשוני |
| דונקי אנטי GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | נוגדן שניוני |
| עיזים אנטי Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | נוגדן שניוני |
| עיזים אנטי GP-Alexa594 | בדיקות מולקולריות | -11076 | נוגדן שניוני |
| אנטי עיזים GP-Alexa488 | בדיקות מולקולריות | -11008 | נוגדן שניוני |
| אנטי עיזיםGP-Alexa594 | בדיקות מולקולריות | -11012 | נוגדן שניוני |
| עיזים אנטי GP-Alexa680 | בדיקות מולקולריות | -21076 | נוגדן שניוני |
| עיזים אנטי GP-Alexa750 | בדיקות מולקולריות | -21039 | נוגדן שניוני |
| שטחי Skyscan 3001 | Bioptonics | Opt-סורק | |
| יקה MZ FLIII | Microsystems היקה | Stereomicroscope | |
| יקה מטרת 0.5x | Microsystems היקה | 10446157 | |
| ליקה מצלמת המתאם 1.0x | Microsystems היקה | 10445930 | |
| EL6000 הלייד | 11504115 | Lightsource | |
| מדריך אור הנוזלי | 11504116 | ||
| קובט | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 מ"מ |
| ראי | אופטיקה אדמונד | F68-334 | 50 50 מ"מ x |
| תידור אייקון-M | תידור טכנולוגיה | DU934N-BV | חזור מואר CCD |
| Filterset | טכנולוגית Chroma | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
| Filterset | טכנולוגית Chroma | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Filterset | טכנולוגית Chroma | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| חרוזי ProteinG-Sepharose | GE Healthcare | 17-0618-01 | חלבון G Sepharose 4 זרימה מהירה |
| יזיד הנתרן | סיגמה אולדריץ | 08591 | נתרן 0.1 פתרון יזיד M |
מקורות
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
- Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).
- Ahlgren, U., Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).
- Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070(2008).
- Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).
- Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936 (2010).
- Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753(2011).
- Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).
הדפסות חוזרות והרשאות
תיקון
Formal Correction: Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research
Posted by JoVE Editors on 11/05/2018. Citeable Link.
A correction was made to Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
