Name: שחרור הדופמין ב מסופי Presynaptic הפרט דמיינו עם FFNs (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: חקור שחרור דופמין בזמן אמת ממסופי presynaptic במוח עכברים באמצעות FFN 511. שיטת הדמיית הפלואורסצנציה החדשנית מאפשרת מדידה אופטית ישירה של שחרור נוירוטרנסמיטרים בתדירויות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ד Sames בזכות הרולד ג &amp; ליילה י Mathers קרן הצדקה ויוזמות של אוניברסיטת קולומביה ב מדע והנדסה. ד Sames וד זולצר להודות לקרן עבור מק &#39;נייט מק&#39; נייט חידושים טכנולוגיים פרס Neuroscience ד זולצר הודות NIDA, NIMH, ואת Picower ומקרנות בין מחלת פרקינסון. ח תודה אנג NARSAD. RH אדוארדס מודה ג&#39;יי מייקל פוקס, קרן, פרקינסון הקרן הלאומית, NIDA ו NIMH. אנו מודים רוברט בורק עבור 6-OHDA זריקות וייעוץ, Sonders סמן לדיון שימושי, Merek סיו עבור תכנות וניתוח הדמיה, ויאן Schmoranzer לקבלת תמיכה טכנית בהגדרת מיקרוסקופיה TIRF.

בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">Gubernator et al. Science 324 (5933). 1441-1444 (2009)</a> . 1. הכנת פרוסות striatal חריפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכנת פרוסות striatal חריפה, יש נוזל חמצן מלאכותי השדרה (ASCF) ומקררים אותו עם קרח למשך 15 דקות לפחות לפני מיצוי את המוח. שמור על קור קרח ACSF ו מחומצן במהלך הניתוח. ACSF (מ&quot;מ): 125 NaCl, KCl 2.5, NaHCO 3 26, CaCl 2 2.4, MgSO4 1.3, KH 2 PO 4 0.3, גלוקוז 10, HEPES 5; pH 7.3-7.4, 290-295 mOsm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף עכבר זכר ללא הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את המוח כולו של העכבר, ו הר זה על מגש vibratome דגש על vibratome באמצעות בדבק מגע ® דבק. מיצוי המוח גובר חייב להיעשות תוך 2 דקות. במהלך הזמן הזה, הקפד לשמור על קור קרח ACSF ו מחומצן כדי לשמור על הרקמה הבריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור העטרה פרוסות המוח striatal על עובי 250μm גבחת בין 1.54-0.62 1. שלוש פרוסות כל יושג אשר לאחר מכן ניתן לחתוך פרוסות 6 וחצי עם מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את פרוסות המוח ACSF מחומצן בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות 1 לפני טעינת בדיקה. Slices להציג טעינת טוב FFN511 ולהישאר פעיל הדמיה עד 4 שעות לאחר ההכנה פרוסה. </li></ol> 2. טוען FFN511 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן FFN511 פתרון הטעינה (10μM FFN511 ב ACSF); גם להכין 100μM ADVASEP-7 ב ACSF. כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים טרי מחומצן לפחות 15 דקות לפני טעינת לפרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד דגירה פרוסה עם פתרון FFN511 טעינה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להסיר את צבען חייב רקמה תאית על ידי דוגרים הפרוסה טעון מחומצן 100μM ADVASEP-7 ACSF במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 2. Slices מוכנים כעת עבור דימות. </li></ol> 3. הדמיה FFN511 את פרוסות המוח הדמיה של FFN511 ב הפרוסות מבוצע באמצעות מיקרוסקופ multiphoton סריקת לייזר. אנחנו משתמשים Ultima Prairie multiphoton מיקרוסקופ סריקת לייזר (היינו באמצעות Zeiss LSM 510 NLO multiphoton מיקרוסקופ סריקת לייזר בעבר כמה תוצאות התקבלו עם מיקרוסקופ Zeiss). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את נתח FFN511 טעון בתא הקלטה (RC-27L, וורנר) ו superfuse עם ACSF חמצן בקצב זרימה של 1-2 מ&quot;ל לדקה. אז במקום נבל פלטינה עם מיתרי ניילון על גבי הפרוסה כדי למזער את התנועה במהלך הניסוי. כדי לצמצם עוד יותר תנועה, לאפשר הפרוסה לייצב במשך לפחות 10 דקות בחדר לפני הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחש לאתר את הסטריאטום הגב עם הארה בשדה בהיר תחת מטרה מים 10x טבילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום ואת המיקום המעוות אלקטרודות טונגסטן דו קוטבית באזור זה, אם ביצוע הניסוי גירוי. האזור הדמיה אידיאלי ממוקם בתוך 300 מיקרומטר בין שני קצות האלקטרודה מגרה דו קוטבית. מניחים את האזור במרכז שדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה FFN511 שכותרתו מסופי striatal תחת מטרה (0.9 NA) 63x טבילה במים אולטרה סגול. FFN511 הוא נרגש על 760 ננומטר עם המאי טאי לייזר לפיסיקה רפאים הקרינה האופטימלי של מסופי striatal נתפסת דרך לעבור הלהקה המסנן (480-520 ננומטר). תמונות נלכדים בתבנית של 12 סיביות עם 75 x 75 אזורים מיקרומטר עניין ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים. על הניסויים destaining מגורה, כדי לפצות על שינוי Z-ציר, סדרה של תמונות-Z 5-7, מופרדים 1 מיקרומטר במטוס-z, מתקבל עבור כל פרק זמן. </li></ol> 4. FFN511 Destaining התווית FFN511 ניתן destained או על ידי ריכוז גבוה של KCl (אנו משתמשים KCl 70 mM), (+), אמפטמין סולפט (AMPH, 20 מיקרומטר), או גירוי חשמלי. במהלך הניסוי destaining KCl, כאשר פתרון גבוה ACSF אשלגן מוחל על פרוסת המוח, FFN511 destains תווית תוך 2 דקות. שיא xyz-t תמונות כדי לעקוב FFN511 destaining לאורך זמן. להלן תיאור גירוי חשמלי תלויי מסוף destaining דופמין: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר FFN511 destaining לאורך זמן, xyz-t תמונות נרשמות. כדי להבטיח תנועה מינימלית של הפרוסה (פחות מ -4 מיקרומטר Z-ציר) ולא על ידי photobleaching, לייזר לשלוט בזמן סדרת תמונות של מחסנית-z צריכים לקבל לפחות 5 דקות לפני הגירוי. אחרת, להתאים את כוח לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התמונות האלה שליטה, להמשיך את ההדמיה xyz-t זמן להתחיל את הגירוי בתדרים של 1, 4 או 20 הרץ. גירויים בבית 1, 4 או 20 הרץ (300 μs x 1 mA) מוחלים בסטריאטום מקומית על ידי המבודד Iso-Flex גירוי מופעלות על ידי גנרטור Master-8 הדופק (AMPI, ירושלים) באמצעות אלקטרודות דו קוטבית. כדי למזערוריאציה שלילת קוטביות של אתרי שחרור, השתמשנו פרוטוקול גירוי החלים 150% של עוצמת הגירוי המקסימלי נקבע על ידי voltammetry מחזורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנות ראוי לניתוח הדמיה. במעבדה שלנו, אנו משתמשים תמונה J (ויין Rosband, המכונים הלאומיים לבריאות, Rockville, MD) אישית בכתב תוכנה IDL (Research Systems, Boulder, CO) לכמת את הקרינה puncta והשינויים עם time3. </li></ol> Represenative תוצאות איור 1 מציג FFN511 טוען לתוך פרוסת striatal הושלמה. תמונות באמצעות נציג אובייקטיבי 10x ו 60x מוצגים תמונה 1. תיוג סלקטיבית של מסופי דופאמין יכול להיות destained ידי אמפטמין 20 מיקרומטר. איור 2 מראה destaining של תיוג FFN511 ידי KCl גבוהה. איור 3 מראה destaining של תיוג FFN511 על ידי גירוי חשמלי מקומי. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 FFN511 תוויות מסופי הדופאמין בקליפת המוח, striatal פרוסות לחיות חריפה (A) על ידי סימון FFN511 ב פרוסה חריפה קליפת המוח, striatal לחיות:.. תיוג בשפע בסטריאטום (STR), תיוג דלילה בקליפת המוח (CTX), ולא התווית corpus callosum (CC). בר סולם:. 100 מיקרומטר (ב) Destaining של FFN511 מ בסטריאטום ידי אמפטמין. לוחות שמאל: לפני אמפטמין, לוחות מימין: לאחר 20 דקות של אמפטמין 20 מיקרומטר. בר קנה מידה: 10 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Destaining של תיוג FFN511 ידי KCl גבוהה. תיוג FFN511 הוא destained בתוך היישום 2 דקות של 70 מ&quot;מ KCl ב ACSF. בר סולם: 10μm. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תדרים תלויי destaining של תיוג FFN511 בסטריאטום. (א) גירוי מקומי על הרץ 4 הביא destaining מן המסופים. גירוי החל t = 0. בר סולם: 5 מיקרומטר (ב) Destaining של FFN511 בבית הרץ 4 הוא Ca 2 + - ותדירות תלויי.. בקרות לא קיבלו גירוי (153 puncta מ 3 פרוסות). Destaining עם קדמיום כלוריד (200 מיקרומטר) היה זהה שולטת unstimulated (475 puncta מתוך 5 פרוסות). עקומות destaining עבור כל תדר גירוי היו בכושר ידי פונקציית הדעיכה יחיד מעריכי ואת מחצית החיים (t 1 / 2) ערכים מחושבים כמו τ x 0.693 (1 הרץ: 765 puncta מתוך 9 פרוסות, 4 Hz: 410 puncta מתוך 7 פרוסות, 20 הרץ: 416 puncta מ 6 פרוסות). נא עיין מיקרוסקופ וידאו מיקרוסקופיה 2-פוטון של destaining FFN511 במהלך exocytosis ב הכנה למוח striatal פרוסה.

<ol><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
<li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li>
<li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה לדמיין עצבית אופטית באמצעות תחליפי דופמין ניאון. FFN511 הוא הדור הראשון של FFNs פיתחנו. למרות שזה תוכנן על ידי מיקוד טרנספורטר העצבית שלפוחי אוקסידאז (VMAT2) שנושאת נוירוטרנסמיטרים אוקסידאז מן הציטופלסמה לתוך שלפוחית ​​סינפטית, ובמיוחד תוויות מסופי הדופמין בסטריאטום ו קטכולאמינים חזקה ו / או מסופי סרוטונין בקליפת המוח (כפי שמוצג המדע נייר), תקופת העמסה המתאים הוא קריטי עבור סגוליות מאז FFN511 הוא הידרופובי יחסית. מצאנו כי הדגירה של יותר מ 40 דקות תגרום מכתים ספציפי נרחב פרוסות striatal. סגוליות ניתן לקבוע בצורה ישירה על ידי destaining באמצעות ריכוז גבוה של KCl, שאמור לגרום לשחרור FFN בתוך שלפוחית ​​סינפטית תפקודית. חשיפה של הפרוסה על FFN511 עבור פחות מ 15 דקות תגרום אות ניאון חלשה בשל טעינה מספיקה של צבע של המסופים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים 100μM ADVASEP-7 להסיר את צבען חייב רקמת תאי. צעד זה אינו הכרחי, אבל אם זה מושמט, הפעם כשלון ב ACSF צריך להיות ממושך. לסיכום, בהתאם הכנה שבחרת, תצטרך לשנות את תקופת ריכוז טעינת לקבוע תיוג אופטימלית.

<table><tbody><tr><td>FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)</td><td>אוניברסיטת קולומביה - מעבדת דליבור סאמס (Dalibor Sames Lab)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADVASEP-7 </td><td>CyDex</td><td>AR-OA7-005</td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטה RC-27L Recording chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>מעמד 6-בבארים PELCO PrepEze</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>36157-1</td><td>עבור אינקובציית פרוסות</td></tr><tr><td>ממריץ פולסים Master-8 ומבודד גירויים Iso- Flex</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שחרור הדופמין ב מסופי presynaptic הפרט דמיינו עם ffns

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

מערכת העצבים המשדרת אותות בין הנוירונים באמצעות שחרור הנוירוטרנסמיטר במהלך איחוי שלפוחית ​​סינפטית. כדי לצפות ספיגת העצבי שחרור מסופי presynaptic הפרט ישירות, עיצבנו נוירוטרנסמיטורים שווא ניאון כמו מצעים עבור טרנספורטר שלפוחית ​​סינפטית אוקסידאז. באמצעות בדיקות אלה לשחרר תמונה הדופמין בסטריאטום, עשינו מספר תצפיות רלוונטי הפלסטיות הסינפטית. מצאנו כי חלק קטן של שלפוחית ​​סינפטית שחרור הנוירוטרנסמיטר לכל גירוי היה תלוי בתדירות הגירוי. נפרדים kinetically &quot;מילואים&quot; האוכלוסייה שלפוחית ​​סינפטית לא נצפתה בתנאים ניסיוניים. ההטרוגניות תדירות תלויי של מסופי presynaptic נחשף כי היה תלוי בחלקו על קולטני דופאמין D2, המציין מנגנון תדירות תלויי קידוד הבחירה presynaptic. הואי זאנג Gubernator ניקו G. תרמו באופן שווה על עבודה זו.

חדש אמצעים למדוד עצבית אופטית באמצעות תחליפי דופמין ניאון.

שחרור הדופמין ב מסופי Presynaptic הפרט דמיינו עם FFNs

מערכת העצבים מעבירה אותות בין נוירונים באמצעות שחרור מוליכים עצביים במהלך איחוי של שלפוחיות סינפטיות. כדי לצפות בספיגה של מוליכים עצביים ו...

הנוירוטרנסמיטר המדומה הפלואורסצנטי. FFN 511 הוא מונואמין פלואורסצנטי שיכול לשמש כסובסטרט עבור מוביל המונואמינים הסינפטי כאשר הוא מיושם על פרוסות מוח. FN 511 נספג על ידי שלפוחיות סינפטיות דופמינרגיות באמצעות מוביל המונואמינים, וניתן להשתמש בו כדי להדמיאן שחרור נוירוטרנסמיטרים ישירות מקצות פרה-סינפטיים של נוירונים מונואמיניים, כגון אלה שנמצאים ב-S stratum. שחרור נוירוטרנסמיטרים מהקצות נראה בפרוסה כהפחתה באותות פלואורסצנטיים נקודתיים.בסרטון זה, מוכנים פרוסותה של קליפת המוח (coronal slices) בעובי 250 µm באמצעות חותך רטט (vibratome), נצבעות ב-FFN 511 ומצולמות באמצעות מיקרוסקופ לייזר רב-פוטוני. מוצגים ניסויי גירוי החושפים הטרוגניות של שחרור iCal התלויה בתדר. שלום, אני HU מהמעבדה של David במחלקה לנוירולוגיה באוניברסיטת קולומביה.שלום, אני מינרווה גם מהמעבדה של Soldier. היום נראה לכם פרוצדורה לסימון של קצות דופמין בפרוסות מוח באמצעות מוליכים עצביים שגויים פלואורסצנטיים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור שחרור דופמין.אם כן, נתחיל. לפני הכנת פרוסות מוח רגילות (acute slices), יש להעשיר בחמצן את נוזל המוח המלאכותי (artificial cerebral spinal fluid - A CSF) ולקררו בקרח למשך 15 דקות לפחות לפני הוצאת המוח. במהלך הניתוח, יש לשמור על ה-A CSF קר מאוד ומעשיר בחמצן. הוצא את המוח השלם מהעכבר והצמד אותו למגש הוויברטום (vibrotome tray), הממוקם על הוויברטום, באמצעות דבק מהיר (crazy glue). הוצאת המוח והצמדתו חייבות להתבצע בתוך שתי דקות.מלאו את המגש ב-A CSF מחומצן ומקורר עם פרוסות מוחיות בחתך קורונלי ישר בעובי 250 micrometer בין plus 1.54 ל-plus 0.62. יתקבלו שלושה פרוסות, אותן ניתן לחתוך לשישה חצאי פרוסות באמצעות מחט. דגרו את הפרוסות המוחיות ב-A CSF מחומצן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות; בעוד הפרוסות המוחיות דוגרות,ב-A CSF מחומצן, הכין את תמיסת הטעינה של FFN 511 בריכוז 10 micromolar על ידי הוספת תמיסת סטוק של FFN 511 בריכוז 10 millimolar ל-A CSF. לאחר מכן, הכין תמיסה של A-D-V-A-S-E-P seven בריכוז מאה micromolar ב-A CSF. חמצן את שתי התמיסות למשך 15 דקות לפחות לפני הטעינה של כל אחת מהן לפרוסות. דגור כל פרוסת מוח עם תמיסת הטעינה של FFN 511 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, הסר את ה-di הקשור לרקמה החוץ-תאית על ידי הדגרה של הפרוסה הטעונה ב-100 µM advers, seven A CSF מחומצן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הפרוסות מוכנות כעת לדימות. צביעת FFN 511 תדומת בפרוסות באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזר מולטי-פוטוני מדגם prairie Ultima. הנח את הפרוסה הטעונה ב-FFN 511 בתא ההקלטה ובצע פרפוזיה של A CSF מחומצן בקצב זרימה של 1-2 mL/min. לאחר מכן, הנח נבל פלטינה עם מיתרי ניילון על גבי הפרוסה כדי למזער תנועה.במהלך הניסוי, כדי לצמצם עוד יותר את התנועה, יש לאפשר לפרוסות להתייצב בתא למשך 10 דקות לפחות לפני הדימות. יש להדמות ולאתר את ה-dorsal stri AUM באמצעות לומנסנציה בשדה בהיר תחת עדשת טבילה במים של 10x; יש להניח ולממקם את אלקטרודות הטונגסטן המפותלות דו-קוטביות באזור זה לביצוע ניסוי גירוי. אזור הדימות הפנוי נמצא בטווח של 300 micrometers.מיקמו את האזור זה במרכז תמונת שדה הראייה המסומנת ב-FFN 511 כ-Sal terminals, בין שני הקצוות של האלקטרודה הביפולרית המגרה, תחת עדשת מימיות (water immersion) בעוצמה של 63x. FFN 511 מעורר באורך גל של 760 nanometers באמצעות לייזר mi tai מבית spectral physics. פלואורסצנציה אופטימלית של Sal terminals נראית דרך מסנן band pass; צלמו תמונות בפורמט 12 bit עם אזורי עניין (regions of interest) של 75 by 75 µm ברזולוציה של 512 by 512 פיקסלים. תמונת דוגמה של Sal dopamine terminals המסומנים ב-FFN 511 מוצגת כאן.ניתן להסיר את סימון ה-FFN 511 באמצעות ריכוזים גבוהים של potassium chloride amphetamine sulfate או באמצעות גרייה חשמלית בניסוי להסרת סימון ב-potassium chloride; כאשר פתרון CSF עם ריכוז גבוה של potassium מוחל על פרוסת המוח, סימון ה-FFN 511 מוסר בתוך ארבע דקות. הקליטו תמונות XYZT כדי לעקוב אחר הסרת ה-FFN 511 לאורך זמן עבור הסרת סימון FFN 511 באמצעות גרייה חשמלית. השגיחו סדרת תמונות בקרה של ה-Zack לפני הגרייה למשך חמש דקות לפחות, כדי להבטיח תנועה מינימלית של הפרוסה והיעדר פוטו-بلیצ'ינג (photo bleaching) על ידי הלייזר בעקבות רכישת תמונות הבקרה.המשך את הדימות XYZT תוך תחילת הגירוי בתדרים של 1, 4 או 20 hertz; גירויים מופעלים באופן מקומי בסטריאטום באמצעות מבודד גירויים isof lex המופעל על ידי מחולל פולסים master eight באמצעות אלקטרודות בי-פולריות. סרטון זה מציג את ה-FFN 511 במהלך אקסוציטוזיס בתוך פרוסה של מוח SAL. בהכנה, כאשר טעינת ה-FFN 511 לתוך ה-SAL הושלמה, נצפו סימון עשיר בסטריאטום, סימון דליל בקורטקס ולא נצפה סימון ב-corpus callosum.ניתן להבחין בסימון הסלקטיבי של קצות הדופמין באמצעות ריכוז גבוה של פוטסיום כלוריד, כפי שמוצג בתמונות מייצגות אלו לפני הטיפול בפוטסיום כלוריד ושתי דקות לאחר יישום של 70 millimolar פוטסיום כלוריד. ניתן להשיג הפסקה של סימון FFN 511 ב-CSF גם באמצעות אמפתמין. ותמונה זו מראה את סימון ה-FFN 511 בסטריאטום לפני הטיפול באמפתמין.בעוד שתמונה זו מראה את הסטריאטום 20 דקות לאחר שחרור ב-20 micromolar amphetamine, שחרור של סימון FFN 511 באמצעות גרייה חשמלית מקומית מודגם בתמונות אלו, המראות סימון FFN 511 בסטריאטום לפני הגרייה, ובשניות ה-217 וה-514 לאחר תחילת הגרייה בתדר של ארבע hertz. גרף זה של עוצמת פלואורסצנציה מנורמלת לאורך זמן מראה כי שחרור של FFN 511 תלוי בסידן ובתדר; הביקרות, המיוצגות על ידי משולשים ריקים, לא קיבלו גרייה. השחרור בנוכחות cadmium chloride, המיוצג על ידי עיגולים ריקים, היה זהה לביקרות ללא גרייה.עקומות הדעיכה עבור כל תדר גרייה, המיוצגות על ידי העיגולים הצבעוניים, הותאמו לפונקציית דעיכה אקספוננציאלית אחת, וערכי זמן מחצית החיים חושבו כ-tau כפול 0.693. הרגע הצגנו לכם כיצד להטעין מוליך עצבי פלואורסצנטי של כוח (FFN) לתוך טרמינלים של דופמין בתוך פרוסה אקוטית, וכיצד לשחרר אותו באמצעות ריכוז גבוה של אשלגן ולעורר את הגרייה. זוהי השיטה הראשונה שפותחה כדי לבחון אופטית שחרור של מוליכים עצביים ברמה של טרמינלים סינפטיים בודדים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על חיתוכים בריאים מאוד ולהיות מודעים לזמן הטעינה, להבהרה של הרקע ולארטיפקטים של תנועה; חיתוכים המראים FFN five 11 טעינה טובה מאפשרים דימוי עד ארבע שעות לאחר הכנת החיתוך. זהו כל הדבר. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

dopamine-release-at-individual-presynaptic-terminals-visualized-with

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דו"ח זה מדגים טכניקה בידוד מכני של נוירונים בודדים קיימא שמירה boutons presynaptic המצורפת. נוירונים Vibrodissociated יש את היתרונות של ייצור מהיר, שליטה מעולה תרופתי ושיפור חלל מהדק ללא השפעה של תאים שכנים. שיטה זו יכולה לשמש עבור הדמיה של אלמנטים הסינפטי ו-clamp תיקון ההקלטה.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

טכניקת דימות פלואורסצנטי לחיות לכמת את חידוש והתגייסות של שלפוחית ​​סינפטית ספציפי (SV) בריכות במסופי העצבים המרכזית מתוארת. שני סיבובים של SV מיחזור מנוטרים על מסופי העצב אותו מתן הבקרה הפנימית.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

שימוש מהיר סריקה מחזורית voltammetry למדוד עורר חשמלית הדינמיקה דופמין presynaptic ב striatal פרוסות המוח.

דופמין Dynamics Presynaptic בתוך פרוסות המוח striatal עם Voltammetry סריקה מהירה מחזורי

לדגור על הפרוסה ב- aCSF המכיל מוליכים עצביים כוזבים פלואורסצנטיים או FFN.

הדמיה של הולכה עצבית באמצעות מוליכים עצביים כוזבים פלואורסצנטיים

סרטון זה מדגים השתלת אלקטרודות וצינוריות בחולדה מורדמת כדי למדוד שחרור דופמין בגרעין האקומבנס באמצעות פוטנציוסטט ועירוי תרופות לוויסות הפעילות הדופמינרגית באזור הטגמנטל הגחוני.

ניטור שחרור דופמין במודל חולדה באמצעות מניפולציה של קולטן נוירונים דופמינרגיים VTA

אנו מתארים את השימוש של צבעי FM styryl למחזור שלפוחית ​​הסינפטית תמונה בקצוות עצבים תפקודיים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק לעורר, אלא גם ספונטני ופעילות הסינפטית מיניאטורי. הפרוטוקול מרחיב את מגוון אירועים הסינפטי שניתן להעריך בצורה יעילה.

בחינה של Synaptic שלפוחיות מחזור באמצעות צבעי FM במהלך עורר, ספונטני, ופעילויות Synaptic מיניאטורות

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .

צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin

המטרה של פרוטוקול זה היא לתפעל ישירות קולטני אזור tegmental גחוני ללמוד את תרומתם לשחרור דופמין תת שנייה.

עירוי וגירוי משולבים עם וולטמטריה מחזורית סריקה מהירה (CIS-FSCV) כדי להעריך ויסות קולטן אזור טגמנטלי גחוני של דופמין פאזי

הצומת העצבי-שרירי של זחל דג הזברה הוא מודל אטרקטיבי לחקר הפיזיולוגיה הסינפטית. הוא מתאים לטכניקות ניסיוניות רבות, כולל אלקטרופיזיולוגיה והדמיה אופטית. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להדמיית שידור סינפטי באמצעות בדיקה מבוססת pHluorin תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף.

הדמיה חיה של מיחזור שלפוחית סינפטית בצומת העצבי-שרירי של דג זברה זחל מנותח

חקור שחרור דופמין בזמן אמת ממסופי presynaptic במוח עכברים באמצעות FFN 511. שיטת הדמיית הפלואורסצנציה החדשנית מאפשרת מדידה אופטית ישירה של שחרור נוירוטרנסמיטרים בתדירויות שונות.

שחרור הדופמין ב מסופי Presynaptic הפרט דמיינו עם FFNs

גלה סרטונים נוספים