שחרור הדופמין ב מסופי Presynaptic הפרט דמיינו עם FFNs
31 באוגוסט 2009
חדש אמצעים למדוד עצבית אופטית באמצעות תחליפי דופמין ניאון.
הנוירוטרנסמיטר המדומה הפלואורסצנטי. FFN 511 הוא מונואמין פלואורסצנטי שיכול לשמש כסובסטרט עבור מוביל המונואמינים הסינפטי כאשר הוא מיושם על פרוסות מוח. FN 511 נספג על ידי שלפוחיות סינפטיות דופמינרגיות באמצעות מוביל המונואמינים, וניתן להשתמש בו כדי להדמיאן שחרור נוירוטרנסמיטרים ישירות מקצות פרה-סינפטיים של נוירונים מונואמיניים, כגון אלה שנמצאים ב-S stratum. שחרור נוירוטרנסמיטרים מהקצות נראה בפרוסה כהפחתה באותות פלואורסצנטיים נקודתיים.
בסרטון זה, מוכנים פרוסותה של קליפת המוח (coronal slices) בעובי 250 µm באמצעות חותך רטט (vibratome), נצבעות ב-FFN 511 ומצולמות באמצעות מיקרוסקופ לייזר רב-פוטוני. מוצגים ניסויי גירוי החושפים הטרוגניות של שחרור iCal התלויה בתדר. שלום, אני HU מהמעבדה של David במחלקה לנוירולוגיה באוניברסיטת קולומביה.
שלום, אני מינרווה גם מהמעבדה של Soldier. היום נראה לכם פרוצדורה לסימון של קצות דופמין בפרוסות מוח באמצעות מוליכים עצביים שגויים פלואורסצנטיים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור שחרור דופמין.
אם כן, נתחיל. לפני הכנת פרוסות מוח רגילות (acute slices), יש להעשיר בחמצן את נוזל המוח המלאכותי (artificial cerebral spinal fluid - A CSF) ולקררו בקרח למשך 15 דקות לפחות לפני הוצאת המוח. במהלך הניתוח, יש לשמור על ה-A CSF קר מאוד ומעשיר בחמצן. הוצא את המוח השלם מהעכבר והצמד אותו למגש הוויברטום (vibrotome tray), הממוקם על הוויברטום, באמצעות דבק מהיר (crazy glue). הוצאת המוח והצמדתו חייבות להתבצע בתוך שתי דקות.
מלאו את המגש ב-A CSF מחומצן ומקורר עם פרוסות מוחיות בחתך קורונלי ישר בעובי 250 micrometer בין plus 1.54 ל-plus 0.62. יתקבלו שלושה פרוסות, אותן ניתן לחתוך לשישה חצאי פרוסות באמצעות מחט. דגרו את הפרוסות המוחיות ב-A CSF מחומצן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות; בעוד הפרוסות המוחיות דוגרות,
ב-A CSF מחומצן, הכין את תמיסת הטעינה של FFN 511 בריכוז 10 micromolar על ידי הוספת תמיסת סטוק של FFN 511 בריכוז 10 millimolar ל-A CSF. לאחר מכן, הכין תמיסה של A-D-V-A-S-E-P seven בריכוז מאה micromolar ב-A CSF. חמצן את שתי התמיסות למשך 15 דקות לפחות לפני הטעינה של כל אחת מהן לפרוסות. דגור כל פרוסת מוח עם תמיסת הטעינה של FFN 511 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
בשלב הבא, הסר את ה-di הקשור לרקמה החוץ-תאית על ידי הדגרה של הפרוסה הטעונה ב-100 µM advers, seven A CSF מחומצן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הפרוסות מוכנות כעת לדימות. צביעת FFN 511 תדומת בפרוסות באמצעות מיקרוסקופ סריקה לייזר מולטי-פוטוני מדגם prairie Ultima. הנח את הפרוסה הטעונה ב-FFN 511 בתא ההקלטה ובצע פרפוזיה של A CSF מחומצן בקצב זרימה של 1-2 mL/min. לאחר מכן, הנח נבל פלטינה עם מיתרי ניילון על גבי הפרוסה כדי למזער תנועה.
במהלך הניסוי, כדי לצמצם עוד יותר את התנועה, יש לאפשר לפרוסות להתייצב בתא למשך 10 דקות לפחות לפני הדימות. יש להדמות ולאתר את ה-dorsal stri AUM באמצעות לומנסנציה בשדה בהיר תחת עדשת טבילה במים של 10x; יש להניח ולממקם את אלקטרודות הטונגסטן המפותלות דו-קוטביות באזור זה לביצוע ניסוי גירוי. אזור הדימות הפנוי נמצא בטווח של 300 micrometers.
מיקמו את האזור זה במרכז תמונת שדה הראייה המסומנת ב-FFN 511 כ-Sal terminals, בין שני הקצוות של האלקטרודה הביפולרית המגרה, תחת עדשת מימיות (water immersion) בעוצמה של 63x. FFN 511 מעורר באורך גל של 760 nanometers באמצעות לייזר mi tai מבית spectral physics. פלואורסצנציה אופטימלית של Sal terminals נראית דרך מסנן band pass; צלמו תמונות בפורמט 12 bit עם אזורי עניין (regions of interest) של 75 by 75 µm ברזולוציה של 512 by 512 פיקסלים. תמונת דוגמה של Sal dopamine terminals המסומנים ב-FFN 511 מוצגת כאן.
ניתן להסיר את סימון ה-FFN 511 באמצעות ריכוזים גבוהים של potassium chloride amphetamine sulfate או באמצעות גרייה חשמלית בניסוי להסרת סימון ב-potassium chloride; כאשר פתרון CSF עם ריכוז גבוה של potassium מוחל על פרוסת המוח, סימון ה-FFN 511 מוסר בתוך ארבע דקות. הקליטו תמונות XYZT כדי לעקוב אחר הסרת ה-FFN 511 לאורך זמן עבור הסרת סימון FFN 511 באמצעות גרייה חשמלית. השגיחו סדרת תמונות בקרה של ה-Zack לפני הגרייה למשך חמש דקות לפחות, כדי להבטיח תנועה מינימלית של הפרוסה והיעדר פוטו-بلیצ'ינג (photo bleaching) על ידי הלייזר בעקבות רכישת תמונות הבקרה.
המשך את הדימות XYZT תוך תחילת הגירוי בתדרים של 1, 4 או 20 hertz; גירויים מופעלים באופן מקומי בסטריאטום באמצעות מבודד גירויים isof lex המופעל על ידי מחולל פולסים master eight באמצעות אלקטרודות בי-פולריות. סרטון זה מציג את ה-FFN 511 במהלך אקסוציטוזיס בתוך פרוסה של מוח SAL. בהכנה, כאשר טעינת ה-FFN 511 לתוך ה-SAL הושלמה, נצפו סימון עשיר בסטריאטום, סימון דליל בקורטקס ולא נצפה סימון ב-corpus callosum.
ניתן להבחין בסימון הסלקטיבי של קצות הדופמין באמצעות ריכוז גבוה של פוטסיום כלוריד, כפי שמוצג בתמונות מייצגות אלו לפני הטיפול בפוטסיום כלוריד ושתי דקות לאחר יישום של 70 millimolar פוטסיום כלוריד. ניתן להשיג הפסקה של סימון FFN 511 ב-CSF גם באמצעות אמפתמין. ותמונה זו מראה את סימון ה-FFN 511 בסטריאטום לפני הטיפול באמפתמין.
בעוד שתמונה זו מראה את הסטריאטום 20 דקות לאחר שחרור ב-20 micromolar amphetamine, שחרור של סימון FFN 511 באמצעות גרייה חשמלית מקומית מודגם בתמונות אלו, המראות סימון FFN 511 בסטריאטום לפני הגרייה, ובשניות ה-217 וה-514 לאחר תחילת הגרייה בתדר של ארבע hertz. גרף זה של עוצמת פלואורסצנציה מנורמלת לאורך זמן מראה כי שחרור של FFN 511 תלוי בסידן ובתדר; הביקרות, המיוצגות על ידי משולשים ריקים, לא קיבלו גרייה. השחרור בנוכחות cadmium chloride, המיוצג על ידי עיגולים ריקים, היה זהה לביקרות ללא גרייה.
עקומות הדעיכה עבור כל תדר גרייה, המיוצגות על ידי העיגולים הצבעוניים, הותאמו לפונקציית דעיכה אקספוננציאלית אחת, וערכי זמן מחצית החיים חושבו כ-tau כפול 0.693. הרגע הצגנו לכם כיצד להטעין מוליך עצבי פלואורסצנטי של כוח (FFN) לתוך טרמינלים של דופמין בתוך פרוסה אקוטית, וכיצד לשחרר אותו באמצעות ריכוז גבוה של אשלגן ולעורר את הגרייה. זוהי השיטה הראשונה שפותחה כדי לבחון אופטית שחרור של מוליכים עצביים ברמה של טרמינלים סינפטיים בודדים.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על חיתוכים בריאים מאוד ולהיות מודעים לזמן הטעינה, להבהרה של הרקע ולארטיפקטים של תנועה; חיתוכים המראים FFN five 11 טעינה טובה מאפשרים דימוי עד ארבע שעות לאחר הכנת החיתוך. זהו כל הדבר. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשנית למדידה אופטית של העברה עצבית באמצעות אנלוגים פלורסצנטיים של דופמין, ובייחוד FFN 511. הטכניקה מאפשרת ויזואליזציה ישירה של שחרור דופמין מטרמינלים פרה-סינפטיים בחתכי מוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- העברה עצבית
- דימיון פלואורסצנטי
רקע
- מוליכי עצב פלואורסצנטיים דמיים יכולים לחקות מוליכי עצב טבעיים.
- FFN 511 הוא מונואמין פלואורסצנטי שניתן לספיגה על ידי שלפוחיות סינפטיות דופמינרגיות.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי הדינמיקה של שחרור מוליכי עצב.
- הבנת שחרור הדופמין היא קריטית לחקר מצבים נוירולוגיים שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוצדורה לסימון קצות דופמין בחתכי מוח.
- ויזואליזציה וכימות של שחרור דופמין באמצעות FFN 511.
- חקירת שחרור דופמין התלוי בתדירות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת פרוסות מוח אקוטיות מעכברים.
- טעינת הפרוסות ב-FFN 511 ודגירה בנוזל חוט ששכיך מלאכותי מחומצן.
- דימוי באמצעות מיקרוסקופ סריקה בלייזר רב-פוטוני.
- ביצוע ניסויי גרייה לצפייה בדינמיקה של שחרור דופמין.
תוצאות עיקריות
- FFN 511 מסמן ביעילות טרמינליים דופמינרגיים בסטריאטום.
- שחרור של FFN 511 נצפה כהפחתה באותות הפלואורסצנציה.
- ניסויי עיכוב (detaining) חושפים שחרור של דופמין התלוי בתדירות.
- ריכוז גבוה של potassium chloride ואמפטמין יכולים להדיח את FFN 511 מהטרמינליים.
מסקנות
- השיטה מספקת אמצעי מהימן לחקר שחרור דופמין בזמן אמת.
- FFN 511 משמש ככלי בעל ערך לחקירת תמסורת עצבית.
- גישה זו עשויה להעמיק את הבנתנו לגבי איתות דופמינרגי במוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמיכים
ויזואליזציה ישירה של שחרור מוליכים עצביים בטרמינלים פרה-סינפטיים בודדים מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית בתיקוף מטרות דופמינרגיות. שיטה זו תומכת בביטחון חיזוי על ידי כימות דינמיקת שחרור תלוית-תדירות והטרוגניות באוכלוסיות של שלפוחיות סינפטיות. היא מספקת מידע לקבלת החלטות בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי קישור התפקוד הפרה-סינפטי לפרמטרי גירוי ולמודולציה של רצפטורים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת שחרור דופמין כפונקציה של תדר הגירוי.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של טרמינלים פרה-סינפטיים תוך שימוש ב-FFN 511 כתשתית עבור הטרנספורטר הוסיקולרי של מונואמינים.
- ערך חיזוי: חושף הגתרוגניות תלוית-תדר של טרמינלים פרה-סינפטיים המודעלים על ידי רצפטורים מסוג D2, ובכך מסייע בבחירת מטרה ובצמצום סיכונים של מסלולים.
סינון ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק קריאה כמותית של שחרור מוליכים עצביים באמצעות דעיכת פלואורסצנציה, המאפשרת סטנדרטיזציה של הבדיקה בין תנאי סטימולציה שונים.
- ערך תפעולי: תומך במדידה הדירה של קינטיקת השחרור באמצעות התאמה אקספוננציאלית אחת (single-exponential fitting) של עקומות הסרת הצבע של FFN 511.
- יכולת הרחבה (Scalability): תואם לדימוי רב-פוטוני בחתכים מוחיים חריפים, מה שמאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה לסריקת תרכובים השוואתית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מקשר בין דינמיקת השחרור הפרה-סינפטית למערכות הרלוונטיות למחלה על ידי הדגמת קידוד תדר התלוי בקולטן D2 בטרמינליים סטריאטליים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: שוללת אוכלוסיות של שלפוחיות רזרבה בעלות קינטיקה שונה בתנאים שנבדקו, ובכך מזקקת מודלים של מיחזור שלפוחיות והסתברות שחרור.
- ביטחון חיזוי: מאפשר התקדמות מותאמת סיכונים על ידי מתאם בין תדר הגירוי לבין חלק השחרור וההטרוגניות הטרמינלית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת מדידה ישירה ובזמן אמת של שחרור דופמין מטרמינלים פרה-סינפטיים, ובכך היא תומכת בבדיקת השערות ובהפחתת סיכונים ביולוגיים לפני זיהוי המולקולה המובילה (lead identification).
- ביולוגיה של הגילוי: בוחנת תפקוד פרה-סינפטי על ידי כימות פלג השחרור לגירוי ותלותו בתדירות הגירוי (1, 4, 20 Hz).
- סריקה: מספקת מערכות ביולוגיות מוכנות לבדיקה עם פרוטוקולים מאושרים של טעינת FFN 511 והסרת צבע למדידה עקבית של שחרור מוליכים עצביים.
- אנליזה: מייצרת משתנים תלויים כמותיים (עצימות פלואורסצנציה מנורמלת לאורך זמן, ערכי זמן מחצית חיים) המאפשרים השוואה של קינטיקת השחרור בין תנאים שונים ומניפולציות גנטיות או פרמקולוגיות.
- מחקר תרגומי: מקשרת פנוטיפים של שחרור פרה-סינפטי לוויסות של קולטני D2, ובכך תומכת בהתאמת סמנים ביולוגיים במסלולים דופמינרגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימוג רב-פעמית לחקר שחרור מוליכים עצביים במודלים של מחלות ובמחקרים של תיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנה מכניסטית לגבי הסבירות לשחרור פרה-סינפטי וקידוד תלוי-תדר, ובכך מפחית עמימות במודלים של סיגנלינג דופמינרגי.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות הכנה סטנדרטית של פרוסות, טעינה של FFN 511, בקרות הסרת צבע (destaining) ופרמטרים של דימיון מולטי-פוטוני.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי חשיפת הטרוגניות פרה-סינפטית ומודולציה של דינמיקת השחרור המתווכת על ידי קולטנים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם סיכון, המבוסס על תפקוד פרה-סינפטי מתוקף ויכולת ניבוי של השחרור.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנת פרוסות מוח חיות, במיקרוסקופיה רב-פוטונית ובטיפול בחומרי זיהוי פלואורסצנטיים.
- תלוי בגישה למיקרוסקופ סריקה רב-פוטוני עם עירור מתאים (760 nm) וסינון פליטה עבור FFN 511.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרמטרי הגירוי (תדירות, משך זמן, מיקום אלקטרודות) ובקרות להסרת צבע (KCl, אמפטמין, גירוי חשמלי) לאורך הניסויים.
- כולל שיקולי התאמה לאזורי מוח שונים או למודלים של מחלות שבהם צפיפות הטרמינלים והביטוי של הנשאים עשויים להשתנות.
- מוגבל על ידי פוטובליצ'ינג (הלבנה פוטונית) וארטיפקטים של תנועה, דבר המצריך תקופות ייצוב ושמירה על פרוסות בריאות למשך עד ארבע שעות לאחר ההכנה.
