המודל של טרשת עורקים Flow-induced מופרע על העורק הראשי עכבר ידי קשירת חלקי שיטה פשוטה של ​​בידוד RNA מן התרדמה האנדותל

סרטון זה מדגים ניתוח של קשירה חלקית של העורק הקרוטידי, שבו העורק הקרוטידי החיצוני, העורק הקרוטידי הפנימי והעורק העורפי נקשרים בעכבר תחת הרדמה, כדי להשרות תנאי זרימה מופרעים ופיתוח מהיר של אתרולקרוזיס בעקבותיהם. הצלחת הניתוח מאומתת באמצעות אולטרסאונד, לאחר מכן מפיקים את העורקים הקרוטידיים הקשורים והביקורתיים מהעכבר לאחר המתת חסד, ומחלצים RNA אנדותליאלי בדרגת טוהר גבוהה. שלום, שמי דאג נא, מהמעבדה של hon Jo במחלקה להנדסה ביו-רפואית ובחטיבת קרדיולוגיה ב-Georgia Tech ובאוניברסיטת Emory.

שלום, שמי אמיר רבן. אני גם מה-JO Lab. אני אדגים את אימות הליגציה באמצעות אולטרסאונד, ואני CHI, גם אני מה-JO Lab.

היום אדגים את הכנת ה-RNA הפנימי. נראה לכם הליך של קשירה חלקית של העורק הגרוני (carotid ligation), בדיקת אולטרסאונד, אימות של הקשירה ושיטה לבידוד RNA אינטימי. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של מאמץ גזירה (shear stress) על טרשת עורקים.

נתחיל בתהליך. לפני תחילת הפרוצדורה, יש לוודא את עומק ההרדמה שנוצרה על ידי ketamine ו-xylazine. בעכבר בן שמונה שבועות, יש לבצע זאת באמצעות צביטה בבהוות. מקמו את העכבר על במה כירורגית בתנוחה גחונית (supine), והדביקו את ארבע הכפות בעזרת סרט הדבקה לבמה, כאשר כפות הרגליים פונות כלפי מעלה.

לאחר מכן, הדביקו את כפות הרגליים האחוריות, כאשר כפות הרגליים פונות כלפי מטה. השתמשו בגזה כריפוד עבור צווארו של העכבר. לאחר מכן, מרחו כמות נדיבה של חומר להסרת שיער על צווארו של בעל החיים, בין הלסת התחתונה לעצם החזה.

עסו בעדינות את האזור עד להסרה מלאה של השערה. נקו את חומר הדיפילציה באמצעות מקלוני צמר גפן. לאחר מכן, מרחו כמות נדיבה של Betadine בעזרת מספריים קטנים וחדים.

בצעו חתך אנכי של ארבעה עד שישה מילימטרים במרכז צווארו של בעל החיים, תוך חיתוך העור והפסציה שמתחתיו. בעזרת פינצטת דיסקציה, הזיזו בעדינות את בלוטת התריס השמאלית מקו האמצע לכיוון שמאל של בעל החיים. בצעו דיסקציה של הרקמה באופן עמום באמצעות פינצטת דיסקציה.

לחשוף את העורק התקרותי המשותף הפועם. עקוב בזהירות אחר העורק התקרותי המשותף. אתר את נקודת הפיצול.

בצעו דיסקציה זהירה של ההסתעפות כדי לחשוף את המבנים הבאים: ארבעה ענפים דיסטליים של העורק הקרוטיד המשותף השמאלי – העורק הקרוטיד החיצוני, העורק הקרוטיד הפנימי, העורק העורפי (occipital artery) והעורק התירואידי העליון. כלי דם אלו, ובמיוחד העורק התירואידי העליון, עלולים להיות שבירים מאוד.

העבירו סט אחד של פינצטות מתחת לעורקי הת carotid החיצונייים, מעל העורקי הthyroid העליונים, ותפסו בעזרת זוג פינצטות אחר חתיכה באורך של one inch של תפר משי six oh. משכו בעדינות את התפר כדי להעבירו מתחת לעורקי. קשרו את העורקי הcarotid החיצונייים בחוזקה, תוך הימנעות מרקמות סובבות.

באמצעות אותה טכניקה, קשרו את העורקים הקרוטידיים הפנימיים והאוקסיפיטליים בעזרת קשר יחיד. לאחר אימות מיקום התפרים והבטחת הפתיחות של העורק התיראואידי העליון באמצעות בדיקה ויזואלית, החזירו את בלוטת הפרוטיד למקומה, קרבו את העור וסגרו אותו באמצעות מלקחי רקמות.

בדרך כלל 30 עד 60 דקות. לאחר מכן ניתן להעביר את העכברים לאזור הדיור הרגיל שלהם. הניחו מעט מזון בתחתית הכלוב, שכן העכברים עשויים לחוש אי-נוחות בעת ניסיון להגיע למזון במהלך היום הראשון.

יש להביא מנה בודדת של buprenorphine למחרת להקלה על הכאב, יום אחד לאחר הליגציה. הכין את בעל החיים המורדם ב-isoflurane לבדיקת אולטרסאונד על ידי הנחתו על משטח ההדמיה כאשר בצד הבטן פונה כלפי מעלה.

הדביקו את הזרועות והרגליים לחיישן ה-ECG. מרחו ג'ל אולטרסאונד על צוואר החיה. יש לנטר את טמפרטורת הגוף של החיה לאורך כל הפרוצדורה.

הפעילו את המחשב ואת תוכנת הדמיה. בחרו את המשתמש ואת התא המפיק (echo probe) המתאימים. הגדירו את האולטרסאונד למצב דבורה (bee mode).

לאחר מכן, כאשר כפתור הפרוב פונה לעבר אפו של העכבר, הורד את הפרוב על צווארו של העכבר עד לקבלת תמונה. הזז את במת הפרוב ימינה ושמאלה עד שניתן יהיה לזהות את הקנה (trachea). לאחר מכן, אתר את העורק התהומי המשותף השמאלי (left common carotid artery) והטה את במת ההדמיה כך שייווצר זווית בין מישור ההדמיה לבין העורק התהומי.

העבירו את המכשיר לאולטרסאונד ממצב B למצב Doppler wave pulse תוך השארת המתמר במרכז העורק הקרוטיד השائع השמאלי. השתמשו בכפתור תיקון הזווית כדי להתאים את הזווית כך שקו תיקון הזווית יהיה מקבילי לעורק הקרוטיד השائع. צלמו תמונה על ידי לחיצה על כפתור שמירת הפריים (frame store).

פרופיל המהירות של הדם בעורק הסג'ניד המשותף יתועד. צפויה היפוך של פרופיל המהירות במהלך הדיאסטולה. חזור על השלבים הבאים בעורק הסג'ניד המשותף הימני לצורך השוואה.

המהירות תהיה גבוהה יותר ולא תיראה היפוך בעורק התרדמה המשותף הימני. לאחר קבלת תמונות מספקות, כבה את ההרדמה ונגב את ג'ל האולטרסאונד מהעכבר. שחרר את העכבר מרצועות ההדבקה.

הניחו את החיה בתא התאוששות מחומם. התאוששות מאיסופלורן שנשאף מתרחשת בדרך כלל תוך פחות מחמש דקות. הדביקו את כפות הרגליים של עכבר שהורדמה באמצעות פחמן דו-חמצני לנייר סופג בעזרת מספריים.

גזרו את עור העכבר מהבטן ועד לחלק העליון של בית החזה. לאחר מכן, בעזרת מספריים חדות ופינצטה, פתחו את דופן הבטן מתחת לכלוב הצלעות. הרימו את עצם השטרנום וגזרו את הסרעפת.

הסיר את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב. לאחר מכן, חתוך את הווריד של ה-CVA, והשתמש בערכת פרפוזיה מסוג "butterfly" כדי לבצע פרפוזיית לחץ למשך שתיים עד שלוש דקות עם תמיסת סליין נורמלית המכילה 10 units per milliliter הפרין דרך החדר השמאלי, עד שהריאות והכבד יהפכו לחיוורות. לאחר פרפוזיית הסליין, חתוך את עור הצוואר והסר את כל השומן, השרירים והרקמות החיבוריות עד לחשיפת העורקים הקרוטידיים.

כעת מקמו את העכבר תחת מיקרוסקופ דיסקציה ובצעו חור נקבי בעזרת מחט gauge 29 מיד מתחת לאתרי הליגציה בעורק התומוג'ני (carotid) השמאלי עבור הפרפוזיה השנייה. בצעו שוב פרפוזיה בלחץ למשך כדקה דרך החדר השמאלי, תוך וידוא כי העורק התומוג'ני השמאלי מופזן היטב לאחר הפרפוזיה השנייה. השתמשו בפינצטה בעלת חוד דק ובמספרי קפיץ קטנים כדי להסיר בזהירות את רקמות ה-peri advent הסובבות את העורקים התומוג'ניים.

יש להיזהר לא למעוך או למתוח את העורקים הקרוטידיים במהלך שלב ניקוי זה, כעת בין קשת האורטה לנקודות הליגציה מעל התפתול הקרוטידי. חתכו את העורק הקרוטידי השמאלי בין נקודת הפיסוע של העורק התת-בקרבוי הימני לבין התפתול הקרוטידי. חתכו את העורק הקרוטידי הימני.

העבירו את העורקים הקרוטידיים לצלחת תרבית של 35 מילימטר המכילה HBSS קר מאוד. הסירו בזהירות את כל רקמת ה-peri adventitial שנותרה. הכניסו מזרק אינסולין עם מחט בנפח 29 gauge לקצה אחד של עורק קרוטידי, ואחזו בעורק ובקצה המחט באמצעות פינצטה.

במהירות ובזהירות. שטפו כל עורק קרטיד (carotid) עם 150 µL של תמיסת ליזיס cazo, ואספו את התמיסה לשפופרת של 1.5 mL המסומנת כ-intima eit. לבסוף, שטפו כל עורק קרטיד פעם אחת ב-HBSS.

לאחר מכן, העבירו את הדגימה למסורת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המסומנת כ-media plus adventitia וסגרו אותה. הקפיאו את הדגימה בחנקן נוזלי. ניתן להפיק RNA מהדגימות הקפואות באמצעות gin's.

ערכה קטנה מסוג Micro RZ. בדיקת אולטרסאונד לעכבר בוצעה יום אחד לאחר ליגציה חלקית של העורק הקרוטיד השמאלי כפי שמוצג בדמות זו; ליגציה חלקית מוצלחת מפחיתה את מהירות זרימת הדם והופכת את כיוון הזרימה בעורק הקרוטיד המשותף השמאלי במהלך הדיאסטולה. ליגציה חלקית בעכברי APOE knockout בתזונה עשירה בשומן גורמת לאתרוסקלרוזיס משמעותי בעורק הקרוטיד המשותף השמאלי, אך לא בעורק הקרוטיד הימני הנגדי תוך שבועיים. האתרוסקלרוזיס מוצג באמצעות צביעת Oil Red O לליפידים וצביעת Hematoxylin נגדית לגרהינים.

RNA שנאסף מהאינטימה של העורק התרדי (carotid intima) מכיל גנים המסמנים תאי אנדותל כגון pcam 1 ומסמן לתאי שריר חלק מדיאליים. גנים כגון alpha SMA אינם נמצאים ב-RNA שנאסף משאר העורק המסומן כ-m plus A (מדיה פלוס אדוונטיציה), שם נמצא מסמן לשריר חלק בעוד שסימן האנדותל אינו נמצא. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע ליגציה חלקית של העורק התרדי.

השתמש באולטרסאונד כדי לאמת את הליגציה וכן בשיטה לבידוד RNA מהאינטימה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חיוני לזהות כראוי את הענפים של העורק המשותף ולוודא שעורק התריס העליון נותר פתוח בעוד ששאר הענפים נקשרים היטב בליגציה. חשוב לאמת את תוצאת הליגציה באמצעות אולטרסאונד במהלך התהליך; בהכנה פשוטה, הקפד שצנתר ה-iLet השטוף לא יבוא במגע עם אף חלק אחר של העורק מלבד הלומן. עם זאת, תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.