Name: PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: למד את שיטת PAR-CLIP לזיהוי אתרי קישור של חלבוני RNA ברמת ה-transcriptome באמצעות אנלוגים נוקלאוסידיים פוטוריאקטיביים וקרוס-לינק UV. השיטה מאפשרת למדענים לחקור אינטראקציות RNA-חלבון בקנה מידה גנומי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי במעבדה Tuschl לדיונים מועילים. MH נתמך על ידי Akademischer דויטשר Austauschdienst (DAAD). עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית גרנט # 3100A0 114,001 ל-MZ: TT הוא חוקר HHMI, ולעבוד במעבדה שלו נתמך על ידי NIH מענקים GM073047 ו MH08442 וקרן סטאר.

פרוטוקול להלן מתאר את הליך PAR-קליפ HEK293 תאים להביע הדגל / HA-tagged IGF2BP1 על אינדוקציה עם דוקסיציקלין. נשתמש נוגדן אנטי דגל immunoprecipitation. PAR-Clip יעבוד עם כל שורת תאים להביע רמות לגילוי של אנדוגני, לא מתוייגת חלבון RNA מחייב (RBP) של עניין אם נוגדן יעיל immunoprecipitation זמין. הרחבת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 תאים במדיום הגידול. אנו ממליצים להשתמש בין 100-400 x 10 6 תאים (כ 10-40 ס"מ תא 15 צלחות תרבות) כנקודת מוצא. לגדל אותם כ 80% confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 14 שעות לפני crosslinking להוסיף) 4 thiouridine לריכוז סופי של 100 מיקרומטר (1:1000 v / v של 1 מ 4-thiouridine פתרון המלאי) ישירות אל המדיום תרבית תאים ו ב) להשרות ביטוי של דגל / HA מתויג IGF2BP1 על ידי תוספת של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של דוקסיציקלין (1:10,000 v / v פתרון דוקסיציקלין 10 מ"ג / מ"ל ​​המלאי). הערה: במקום 4-thiouridine ניתן להשתמש גם 100 מיקרומטר של thioguanosine-6. </li></ol> UV-Crosslinking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים פעם אחת עם 10 מ"ל קר כקרח PBS לכל צלחת ולהסיר PBS לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום הצלחות על מגש עם קרח מקרינים חשפו אור 0.15 J / cm 2 של 365 ננומטר UV ב Stratalinker 2400 (Stratagene) או מכשיר דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרדו את התאים עם שוטר גומי 1 מ"ל PBS לכל העברה צלחת, עד 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה ולאסוף ידי צנטריפוגה XG ב 500 דקות 5 ב 4 ° C ו להתעלמות supernatant. 100 x 10 6 HEK293 תאים (10 צלחות 15 ס"מ) תניב כ. 1 מ"ל של תא גלולה רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) אם ברצונך להמשיך ישירות עם תמוגה התא, הלם להקפיא את התא גלולה בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C. כדורי Cell יכול להיות מאוחסן במשך 12 חודשים לפחות. </li></ol> תא תמוגה ו RNaseT1 לעכל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התא גלולה של תאים crosslinked ב 3 כרכים של חיץ NP40 1x תמוגה ו לדגור על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא lysate נקה ידי צנטריפוגה ב XG 13,000 עבור 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את lysate נוספת היא על ידי סינון דרך ממברנה 0.2 מיקרומטר מזרק מסנן (Acrodisc מל או שווה ערך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף RNase T1 (Fermentas, 10,000 U / μl) לריכוז סופי של 1 U / μl ו דגירה באמבט מים במשך 15 דקות על 22 ° C. תגובה Cool לאחר מכן במשך 5 דקות על הקרח לפני שתמשיך. </li></ol> Immunoprecipitation והתאוששות של שברי היעד crosslinked RNA שימוש ב מפריד מגנטי פעל לפי ההנחיות ברחבי הכנת המדגם כדי למנוע חרוזים מגנטיים מהתייבשות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל את החרוזים על דוכן מגנטי עבור 1 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את חיץ הצינור תוך הצינור הוא על מפריד מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי הצינור, להסירו מפריד מגנטיים, ועל resuspend את החרוזים. אתה יכול resuspend את החרוזים על ידי מצליף את הצינור בעזרת האצבע או להשתמש vortexer להגדיר 5 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בקצרה לאסוף כל כך חרוזים עשויים להישאר בכובע הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1 עד 4 כנדרש. </li></ol> הכנת חרוזים מגנטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 10 μl של Dynabeads חלקיקי חלבון G מגנטית (Invitrogen) לכל מ"ל lysate תא (עבור ניסוי טיפוסי יש כ. 40 50 μl של חרוזים) לצינור מ"ל 1.5 microfuge. שטפו פעמיים עם חרוזים מ"ל 1 של חיץ ציטרט, פוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בהיקף של פעמיים חיץ ציטרט, פוספט יחסית לנפח המקורי של השעיה חרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.25 מיקרוגרם של נוגדנים חד שבטיים אנטי הדגל M2 (Sigma) לכל מ"ל ההשעיה ו לדגור על גלגל מסתובב במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעמיים מ"ל 1 של חיץ ציטרט, פוספט להסיר נוגדן מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חרוזים בהיקף של פעמיים חיץ ציטרט, פוספט יחסית לנפח המקורי של השעיה חרוז. </li></ol> Immunoprecipitation (IP), השני העיכול RNase T1 ו dephosphorylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של נוגדנים מצומדות חרוזים מוכן טרי מגנטי לכל מ"ל של lysate חלקית RNase T1 תא מטופלים דגירה של 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל על גלגל מסתובב במשך שעות 1 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף חרוזים מגנטיים על אספן החלקיקים המגנטיים של 15 ו -50 צינורות צנטריפוגה מ"ל (Invitrogen) ולהעביר צינורות microfuge 1.5 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים 3 פעמים מ"ל 1 של חיץ לשטוף IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף RNaseT1 (Fermentas, 10,000 U / μl) לריכוז סופי של U 100 / μl ו דגירה ההשעיה חרוז באמבט מים במשך 15 דקות על 22 ° C. לאחר מכן מצננים על הקרחבמשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים 3 פעמים מ"ל 1 של חיץ גבוה מלח לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend בנפח 1 של חיץ dephosphorylation </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף phosphatase מעיים עגל אלקליין (CIAP, חוד) לריכוז סופי של 0.5 U / μl, ו דגירה ההשעיה על 10 דקות בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעמיים מ"ל 1 של חיץ לשטוף phosphatase </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים פעמיים חיץ polynucleotide קינאז (PNK) ללא DTT (ריכוז DTT הכרחי התגובה האנזימטית גבוה מספיק כדי לגרום נזק חרוזים מגנטיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend בכרך אחד חרוז המקורי של PNK חיץ </li></ol> Radiolabeling קטעי RNA crosslinked לחלבונים immunoprecipitated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי השעיית חרוז שתואר לעיל, להוסיף Υ-32-P-ATP לריכוז סופי של PNK μCi / μl 0.5 ו-T4 (חוד) עד 1 U / μl בכרך אחד חרוז המקורי. דגירה ההשעיה למשך 30 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הלא רדיואקטיבי ATP לקבל ריכוז סופי של 100 מיקרומטר ו דגירה של 5 דקות אחר על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את חרוזים מגנטיים 5 פעמים עם 800 μl של PNK חיץ ללא DTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים μl 70 של חיץ SDS-PAGE הטעינה. </li></ol> SDS-PAGE ו electroelution של RNA-חלבון מתחמי crosslinked מן פרוסות ג'ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על השעיית radiolabeled 5 דקות בתוך גוש חום 95 מעלות צלזיוס עד לפגל ולשחרר את RBP immunoprecipitated עם RNA crosslinked ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חרוזים מגנטיים על מפריד ולהעביר את supernatant אל צינור נקי מ"ל 1.5 microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 40 μl של supernatant לכל היטב Novex Bis-טריס 4-12% (Invitrogen) ג'ל precast polyacrylamide ולהפעיל את ג'ל 55 דקות ב 200 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את תא ג'ל ולפרק את הג'ל, והשאיר אותו רכוב על צלחת אחת. כדי להקל על יישור של הג'ל על תדפיס הנייר phosphorimager, אנו ממליצים על השתלת שלוש חתיכות זעירות ג'ל רדיואקטיבי סימטרית על שלושה מתוך ארבעת הפינות של הג'ל. חלקים רדיואקטיביים ג'ל ניתן שנאספו ג'לים אשר שימשו בעבר כדי לטהר oligonucleotides סינתטי radiolabeled. עטפו את ג'ל סרט פלסטי (למשל ניילון נצמד), כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הג'ל למסך phosphorimager אטומים עבור h 1 ולדמיין על phosphorimager. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הג'ל על גבי התדפיס phosphorimager באמצעות חתיכות ג'ל מושתל להתמצאות. חותכים את רצועות המתאימים בגודלם הצפוי של RBP (IGF2BP1, כ. 75 KDA) והעברה Tube D-Tube Midi Dialyzer ולהוסיף 800 חיץ μl 1x SDS פועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroelute crosslinked RNA-RBP מורכבים 1x SDS ריצה חוצץ ב V 100 ל 2 ח נכרת מן הג'ל ו electroeluted ב D-Tube Dialyzer Midi (Novagen) במאגר 800 SDS μl פועל על פי ההוראות של היצרן. </li></ol> Proteinase העיכול K <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של הצפת 2x K proteinase ביחס electroeluate, ואחריו תוספת של proteinase K (Roche) לריכוז סופי של 1.2 מ"ג / מ"ל. דגירה למשך 30 דקות ב 55 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזר את הרנ"א על ​​ידי חומצי פנול / כלורופורם / רשות העתיקות החילוץ (25:24:1, pH 4.0) ואחריו החילוץ כלורופורם. הוסף 1 μl של גליקוגן (10 מ"ג / מ"ל ​​המלאי) לזרז את הרנ"א על ​​ידי הוספת 3 כרכים של אתנול. ממיסים את גלולה במים μl 10.5. </li></ol> ספריית הכנה cDNA וסדר עמוק קח את הרנ"א התאושש באמצעות פרוטוקול סטנדרטי ספריית cDNA הכנה תיאר במקור עבור שיבוט של RNAs הרגולציה קטן 19. הצעד הראשון, קשירת מתאם '3, בוצע כפי שתואר על סולם של 20 μl 10.5 באמצעות μl של ה-RNA התאושש. השתמש רצף Solexa מתאם מערכות תיאר. בהתאם לכמות של רנ"א התאושש, 5'-מתאם-3'-מתאם מוצרים ללא מוסיף עשוי להתגלות אחרי הגברה של cDNA להקות נוספות כמו PCR. במקרים כאלה, בלו המוצר PCR יותר של גודל הצפויה NuSieve 3% נקודת התכה נמוכה agarose ג'ל, elute המוצר PCR מן חתיכות ג'ל באמצעות ערכת GelElute (Qiagen) ורצף באמצעות טכנולוגיית Solexa. אחת Solexa רצף לרוץ בדרך כלל מאפשר רצף בין 6 ו - 10,000,000 נכתב כי הם מספיק לכיסוי רחב transcriptome של אתרי הקישור של חלבונים RNA מחייב. Bioinformatic ניתוח ניתוח bioinformatic זהירות של רצף קורא צריך לעשות כדי להשיג תובנות משמעותיות לתוך האתרים RNA ומחייבת את RBP שנבדקו, כגון אלמנט ההכרה RNA, באזורים מחייב המועדפת RBP יש (exonic לעומת intronic, קידוד רצף לעומת מתורגמים רצף). רצף קורא צריך להיות מתואם מול מסדי נתונים הגנום EST. אנחנו בדרך כלל להשתמש קורא mapping ייחודי בגנום עם עד הכניסה one אי התאמה, או מחיקה לבנות אשכולות של רצף נכתב כי אז יכול להיות מנותח נוספת. תדירות של מוטציות מאפיין את רצף באשכולות קורא, T למעברים C בעת שימוש 4-SU ו-G על מעברים בעת שימוש 6-SG, מעידים על רצפים crosslinked בהצלחה. מניסיוננו RNAs uncrosslinked שכותרתו עם 4-SU להראות מוטציה רקע שיעור של 20%. שיעור זה עולה ל כ. 50-80% על crosslinking. תיאור מפורט של ניתוח bioinformatic ניתן למצוא חומר משלים לפרסום על ידי Hafner et al. 18 אופציונלי שלבים קביעת רמות שילוב של 4-RNA thiouridine לתוך מסך RNA בודד הכולל מקו ביציבות התא המבטא את RBP עניין לאחר גידול בינוני בתוספת 100 מיקרומטר 4SU 16 שעות לפני הקציר. כמו שליטה, תאים הקציר גדל ללא תוספת 4SU. RNA בודד הכולל על ידי תוספת של 3 כרכים של מגיב Trizol (Sigma) כדי לשטוף את כדורי תא ההנחיות של היצרן. בהמשך היה לטהר RNA סך באמצעות Qiagen RNeasy על פי פרוטוקול של היצרן. כדי למנוע חמצון של 4SU במהלך בידוד RNA וניתוח, להוסיף 0.1 מ"מ dithiothreitol (DTT) של מאגרים לרחוץ צעדים האנזימטית הבאים. תקציר ו-RNA סך dephosphorylated כדי נוקלאוזידים יחיד לניתוח HPLC כפי שתואר קודם לכן 20. בקצרה, בנפח 30 μl, דגירה 40 מיקרוגרם של מטוהרים RNA סה"כ היו 16 שעות ב 37 ° C עם phosphatase U 0.4 אלקליין חיידקי (וורטינגטון ביוכימיים) ו - 0.09 U ארס הנחש phosphodiesterase (וורטינגטון ביוכימיים). כסטנדרט התייחסות, להשתמש RNA 4SU שכותרתו סינתטיים, (אנחנו standardly להשתמש CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) וגם נושא זה כדי להשלים עיכול אנזימטי. הפרד את תערובות כתוצאה של ribonucleosides ידי HPLC על גילוי Supelco C18 (סיליקה מלוכדות החלקיקים שלב 5 מיקרומטר, 250 x 4.6 מ"מ) טור שלב הפוכה (Bellefonte הרשות הפלסטינית, ארה"ב). מאגרים HPLC הם 0.1 M TEAA ב אצטוניטריל 3% (א) ו אצטוניטריל 90% במים (B). השתמש שיפוע isocratic: 0 B% במשך 15 דקות, 0-10-B% עבור 20 דקות, 10-100-B% למשך 30 דקות. החלת 5% ב 100 דקות לשטוף מיושם בין פועל כדי לנקות את הטור HPLC. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="איור 1"> איור 1 (פאנל מימין) מראה תוצאה נציג של קליפ-PAR הופיע עם שורות תאים להביע את הדגל / HA-tagged IGF2BP1 עם 4-SU ו - 6-SG. ראוי לציין, כי יעילות crosslinking של 6-SG עבור IGF2BP1 נמוך יותר יעילות crosslinking עבור 4-SU. Crosslinking יעילות נמוכה תגרום רקע גבוהה יותר של רצפים נגזר שברי RNAs הסלולר בשפע ולכן כדאי לשקול קנה המידה את הניסוי בעת שימוש נוקלאוזידים photoreactive פחות יעיל. הפאנל השמאלי של איור 1 מציג השוואה של שימוש שונה אנלוגים uridine photoreactive שיכול לשמש פוטנציאל עבור קליפ-PAR לעומת crosslinking המסורתית UV 254 ננומטר. האינטנסיביות של הלהקה רדיואקטיבי באורך הנכון נותן לך רעיון טוב אם הניסוי PAR-Clip עבד ויש לך מבודדים רנ"א מספיק לבצע דרך קטן RNA רצף פרוטוקול (צעד אחר צעד תיאור להכנת ספריית cDNA של קטן רצף RNAs ניתן למצוא 19). תדירות של מוטציות אופייני קורא רצף, T למעברים C בעת שימוש 4-SU ו-G על מעברים בעת שימוש 6-SG, מעידים על רצפים crosslinked בהצלחה. מניסיוננו RNAs uncrosslinked שכותרתו עם 4-SU להראות מוטציה רקע שיעור של 20%. שיעור זה עולה ל כ. 50-80% על crosslinking.

<ol><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat. Rev. Genet. 8 (7), 533-533 (2007).</li>
<li>Tenenbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 97 (26), 14085-14085 (2000).</li>
<li>Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+mRNAs+associated+with+the+translational+regulator+PUMILIO+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of mRNAs associated with the translational regulator PUMILIO in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 103 (12), 4487-4487 (2006).</li>
<li>Lopez de Silanes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 101 (9), 2987-2987 (2004).</li>
<li>Greenberg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+light-induced+crosslinking+of+mRNA+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet light-induced crosslinking of mRNA to proteins.</a> Nucl. Acids Res. 6 (2), 715-715 (1979).</li>
<li>Wagenmakers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+of+mRNA+to+proteins+by+irradiation+of+intact+cells+with+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cross-linking of mRNA to proteins by irradiation of intact cells with ultraviolet light.</a> Eur. J. Biochem. 112 (2), 323-323 (1980).</li>
<li>Mayrand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+nuclear+ribonucleoprotein%3A+identification+of+proteins+in+contact+with+poly%28A%29%2B+heterogeneous+nuclear+RNA+in+living+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of nuclear ribonucleoprotein: identification of proteins in contact with poly(A)+ heterogeneous nuclear RNA in living HeLa cells.</a> The Journal of Cell Biology. 90 (2), 380-380 (1981).</li>
<li>Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+heterogeneous+nuclear+RNA-protein+complexes+in+vivo+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of heterogeneous nuclear RNA-protein complexes in vivo with monoclonal antibodies.</a> Mol. Cell. Biol. 4 (6), 1104-11 (1984).</li>
<li>Adam, S. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+proteins+associated+with+mRNA+and+hnRNA+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus proteins associated with mRNA and hnRNA in infected HeLa cells.</a> J. Virol. 61 (10), 3276-3276 (1987).</li>
<li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1212 (2003).</li>
<li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-464 (2008).</li>
<li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (2), 130-130 (2009).</li>
<li>Sanford, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+factor+SFRS1+recognizes+a+functionally+diverse+landscape+of+RNA+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Splicing factor SFRS1 recognizes a functionally diverse landscape of RNA transcripts.</a> Genome Res. 19 (3), 381-381 (2009).</li>
<li>Granneman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+binding+sites+on+U3+snoRNA+and+pre-rRNA+by+UV+cross-linking+and+high-throughput+analysis+of+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. , (2009).</li>
<li>Guil, S., Caceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+RNA-binding+protein+hnRNP+A1+is+required+for+processing+of+miR-18a%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifunctional RNA-binding protein hnRNP A1 is required for processing of miR-18a.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (7), 591-591 (2007).</li>
<li>Chi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-479 (2009).</li>
<li>Zisoulis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+discovery+of+endogenous+Argonaute+binding+sites+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive discovery of endogenous Argonaute binding sites in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. , (2010).</li>
<li>Hafner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. , (2010).</li>
<li>Hafner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microRNAs+and+other+small+regulatory+RNAs+using+cDNA+library+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of microRNAs and other small regulatory RNAs using cDNA library sequencing.</a> Methods. 44 (1), 3-3 (2008).</li>
<li>Andrus, A., Kuimelis, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+composition+analysis+of+nucleosides+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Nucleic+Acid+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Base composition analysis of nucleosides using HPLC.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. Chapter 10 (Unit 10.6), (2001).</li>
</ol>

TT הוא יועץ ממייסדי מדעי כדי פרמצבטיקה Alnylam ויועץ רגולוס Therapeutics.

Buffers ו ריאגנטים מדיום גידול תאים HEK293 <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DMEM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ&quot;מ L-גלוטמין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 U / ml פניצילין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 U / ml סטרפטומיצין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​hygromycin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​blasticidin </li></ul> 4-thiouridine פתרון מניות (1 ז) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 260.27 מ&quot;ג 4-thiouridine </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ל DMSO </li></ul> Doxycyclin המניות (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ&quot;ג doxycyclin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ל DMSO </li></ul> 1x NP40 חיץ תמוגה הכינו מלאי של חיץ 5x ללא DTT ו מעכבי פרוטאז. הוסף DTT ו מעכבי פרוטאז ישירות לפני הניסוי. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEPES 50 מ&quot;מ, ה-pH 7.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 150 מ&quot;מ KCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 mM EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM NAF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5% (V / V) NP40 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 mM DTT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכב להשלים EDTA ללא קוקטייל פרוטאז (Roche) </li></ul> ציטראט פוספט-חיץ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4.7 גר &#39;/ ליטר חומצת לימון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 9.2 גר &#39;/ ל Na 2 HPO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pH 5.0 </li></ul> ה-IP לשטוף חיץ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 300 mM KCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.05% (v / v) NP40 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 mM DTT (להוסיף ישירות לפני הניסוי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכב להשלים EDTA ללא קוקטייל פרוטאז (Roche) (להוסיף ישירות לפני הניסוי) </li></ul> High-מלח לשטוף חיץ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 mM KCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.05% (v / v) NP40 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 mM DTT (להוסיף ישירות לפני הניסוי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכב להשלים EDTA ללא קוקטייל פרוטאז (Roche) (להוסיף ישירות לפני הניסוי) </li></ul> Dephosphorylation חיץ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 mM NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM MgCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM DTT </li></ul> Phosphatase חיץ לשטוף <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;מ EGTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5% (V / V) NP40 </li></ul> קינאז Polynucleotide (PNK) ללא חיץ DTT <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 mM NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM MgCl 2 </li></ul> PNK חיץ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 mM NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM MgCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;מ DTT </li></ul> SDS PAGE חיץ העמסה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גליצרול 10% (V / V) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 6.8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 mM EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% SDS (w / v) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;מ DTT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1% כחול bromophenol </li></ul> 2x proteinase K חיץ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 150 mM NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12.5 mM EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% (w / v) SDS </li></ul>

par-clip - שיטה לזהות transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים rna הכבילה

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

תעתיקי רנ&quot;א כפופים לרגולציה שלאחר תעתיק הגן על ידי אינטראקציה עם מאות RNA מחייב חלבונים (RBPs) ו microRNA המכילים קומפלקסים ribonucleoprotein (miRNPs), אשר באים לידי ביטוי לעתים קרובות סוג תא dependently. כדי להבין כיצד יחסי הגומלין הללו RNA מחייב גורמים משפיעים על ויסות תעתיקי אדם, מפות ברזולוציה גבוהה של חלבון in vivo-RNA אינטראקציות הכרחיים 1. שילוב של גישות גנטיים ביוכימיים חישוביים מיושמים בדרך כלל לזהות RNA-RBP או RNA-RNP אינטראקציות. פרופיל microarray של RNAs הקשורים RBPs immunopurified (RIP-Chip) 2 מגדיר מטרות ברמה transcriptome, אבל היישום שלה מוגבל אפיון של אינטראקציות יציב kinetically ורק במקרים נדירים 3,4 מאפשר לזהות את מרכיב ההכרה RBP (RRE ) בתוך RNA היעד ארוך. עוד יעד ישיר RBP המידע באתר מתקבל על ידי שילוב של crosslinking UV vivo 5,6 עם immunoprecipitation 7-9 ואחריו הבידוד של crosslinked קטעי RNA ו רצפי cDNA (קליפ) 10. CLIP היה להשתמש בו כדי לזהות מטרות של מספר RBPs 11-17. עם זאת, CLIP הוא מוגבל על ידי היעילות הנמוכה של crosslinking UV 254 ננומטר RNA-חלבון, את המיקום של crosslink אינו לזיהוי בקלות בתוך שברי crosslinked רצף, ולכן קשה להפריד UV-crosslinked פלחי יעד RNA מרקע שאינו crosslinked RNA שברי נוכחת גם במדגם. פיתחנו גישה חזקה מבוססי תאים crosslinking לקבוע ברזולוציה גבוהה transcriptome רחב של אתרי הקישור RBPs ו miRNPs הסלולר שאנחנו המונח PAR-Clip (Photoactivatable-Ribonucleoside משופרת Crosslinking ו immunoprecipitation) (ראה איור. 1A עבור מתאר של השיטה). השיטה מסתמכת על שילוב של אנלוגים ribonucleoside photoreactive, כגון 4-thiouridine (4-SU) ו - 6-thioguanosine (6-SG) לתוך המתהווה תעתיקי רנ&quot;א על ​​ידי תאים חיים. הקרנה של תאים על ידי אור UV של 365 ננומטר גורמת crosslinking יעיל של nucleoside שכותרתו RNAs photoreactive הסלולר RBPs אינטראקציה. Immunoprecipitation של RBP ריבית מלווה הבידוד של RNA crosslinked ו coimmunoprecipitated. RNA בודד מומר ספריית cDNA ו רצף עמוק באמצעות טכנולוגיית Solexa. אחד המאפיינים של ספריות cDNA שהוכן על ידי Clip-PAR היא כי מיקום מדויק של crosslinking ניתן לזהות על ידי מוטציות המתגוררים רצף cDNA. בעת שימוש 4-SU, רצפים crosslinked thymidine המעבר cytidine, ואילו באמצעות 6-SG תוצאות guanosine כדי אדנוזין מוטציות. הנוכחות של מוטציות ברצפי crosslinked מאפשרת להפריד אותם מהרקע של רצפי נגזר RNAs הסלולר בשפע. יישום השיטה למספר מגוונים חלבונים RNA מחייב דווח Hafner et al. 18

תעתיקי רנ&quot;א כפופים תקנה posttranscriptional נרחב כי הוא מתווך על ידי מספר רב של טרנס משחק RNA מחייב חלבונים (RBPs). כאן אנו מציגים שיטה להכליל לזהות במדויק בקנה מידה רחב transcriptome האתרים RNA מחייב של RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את אתרי הקישור הרחבים של הטרנסקריפטום של חלבונים קושרי RNA או RVPs. זה מושג על ידי שימוש ראשון באנלוגים של נוקלאוזידים פוטו-ריאקטיביים לתיוג in vivo של תעתיקים מתהווים. השלב השני של ההליך הוא הצלבת חלבונים קושרי RNA ו-RNA על ידי אור UV של 365 ננומטר.השלב השלישי של ההליך הוא לזרז את החלבון קושר ה-RNA שנחקר ולשחזר את הקישור הצולב ל-RNA. השלב האחרון של ההליך הוא המרת ה-RNA לספריית CD NA ורצף עמוק. בסופו של דבר ניתן להשיג תוצאות המציגות אתרי קשירה רחבים של טרנסקריפטום של ה-RVPs ומאפשרות את ההגדרה של אלמנט זיהוי ה-RNA והעדפות הכריכה שלו.היי, שמי מרקוס הופנר מהמעבדה של Tom SEL באוניברסיטת רוקפלר בניו יורק. היום נציג שיטה הנקראת par lip או צלע אנלוגית נוקלאוזיד ניתנת לצילום, קישור צולב משופר ומשקעים חיסוניים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לזהות על טרנסקריפטום לפי אתרי הקישור שלו של חלבונים קושרי RNA ומוטיבים והעדפות הקישור שלהם.אוקיי, אז בואו נתחיל. in vivo קישור צולב UV מתחיל במכסה זרימה למינר. בפרוטוקול זה נשתמש ב-IGF מתויג שני תאי BP אחד כמודל לדוגמה בטכניקה סטרילית.הרחב HEK 2 93 תאים המבטאים ביציבות דגל HA מתויג IGF שני BP אחד בשליטה של מדכא Tet במדיום תרבית תאים HEK 2 93 בין 100 ל -400 פעמים 10 לתאים השישיים ולגדל אותם לכ -80% שטף משותף. 14 שעות לפני הקישור הצולב, התאים קיבלו את אנלוגי הריבוזיד הפוטו-ריאקטיבי עבור תיאו אורידין או עבור SU ישירות למדיום תרבית התא. לחלופין, ניתן להשתמש בשישה גיני או שישה SG לאחר הוספת ביטוי הריבוזיד הפוטו-ריאקטיבי של הדגל HA המתויג IGF שני BP אחד על ידי הוספת תאי דוקסיציקלין מודגרים לאחר לילה בחממת התאים.לאחר מכן, שפכו את אמצעי הגידול. לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת עם 10 מיליליטר מלח פוספט קר כקרח לכל צלחת. לאחר מכן הסר את ה- PBS לחלוטין על ידי סילוק.הניחו את הצלחות החשופות על מגש עם קרח והקרינו אותן באור UV של 365 ננומטר ב-Straddle Link 2, 400 UV crosslinker או שווה ערך לאחר קרינת UV, גרדו את התאים עם שוטר גומי במיליליטר אחד של PBS לכל צלחת. העבירו את התאים לצינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלך את שם העל ושמור על גלולת התא.בשלב זה, ניתן להקפיא כדורי תאים בחנקן נוזלי ולאחסן במינוס 80 למשך 12 חודשים לפחות. כדי להמשיך בהליך יש להשעות את הגלולה בשלושה נפחים של מאגר ליזה X NP 40 אחד, ולדגור על קרח למשך 10 דקות. נקה את הליזאט של התא על ידי צנטריפוגה ב -13, 000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה, נקה את הליזאט עוד יותר על ידי סינון דרך מסנן מזרק ממברנה של חמישה מיקרון. לבסוף, הוסיפו RNA T 1 לריכוז סופי של יחידה אחת למיקרוליטר ודגרו באמבט מים בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, מצננים את התגובה על קרח למשך חמש דקות.בעקבות קישור צולב UV in vivo. הכן את החרוזים המגנטיים למשקעים חיסוניים. העבר 10 מיקרוליטר של חרוזי דינה חלבון G חלקיקים מגנטיים לכל מיל אחד של ליזאט תאים לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.לאחר מכן הנח את הצינור המכיל את החרוזים על מעמד מגנטי למשך דקה עד שתיים. הסר את הסופרנטנט והוסף מיליליטר אחד של מאגר פוספט ציטראט לצינור כשהוא על המפריד המגנטי. לאחר מכן, כסו את הצינור ומערבלו את הדגימה כדי להשעות מחדש את החרוזים.צנטריפוגה לזמן קצר כדי לאסוף את כל החרוזים שנותרו במכסה הצינור. חזור על שטיפה זו עם מיליליטר נוסף של מאגר פוספט ציטראט. לאחר החזרת הכביסה, השעו את החרוזים ואת מאגר הפוספט הציטראט בנפח של פי שניים מהנפח המקורי של תרחיף הסלק.לאחר מכן הוסף 0.25 מיליגרם של אנטי-דגל M שני נוגדנים חד שבטיים לכל מיליליטר אחד של תרחיף פעימה. דגרו את המתלה על גלגל מסתובב למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, שטפו את החרוזים פעמיים במיליליטר אחד של מאגר פוספט ציטראט כפי שתואר קודם לכן, שטיפה זו משמשת להסרת כל נוגדן לא קשור לאחר הכביסה Resus, השעיית החרוזים ומאגר הפוספט ציטראט כמו לפני ארבע. כדי להתחיל במשקעים חיסוניים, הוסף את החרוזים המגנטיים המצומדים הטריים שהוכנו ל-RNAs T ליזאט תאים שטופלו באחד.מעבירים את התערובת לצינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר ומסובבים במשך שעה בחום של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, אספו את החרוזים המגנטיים, השליכו את חרוזי ההשעיה הסופרנטנטים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת IP והעבירו אותם לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. שטפו את החרוזים כמתואר קודם פעמיים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת IP.לאחר הכביסה הסופית, יש להשעות את החרוזים בנפח החרוזים המקורי של מאגר שטיפת IP. לאחר מכן הוסף RNAT אחד לריכוז סופי של 100 יחידות למיקרוליטר. דגרו את מתלה החרוזים באמבט מים של 22 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.לאחר מכן יש לקרר את המתלה על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו את החרוזים שלוש פעמים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת מלח גבוה. לאחר מכן השעו מחדש את החרוזים בנפח חרוזים מקורי אחד של מאגר זרחון.הוסף פוספטאז אלקליין במעי העגל לריכוז סופי של 0.5 יחידות למיקרוליטר ודגר את התרחיף למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שטפו את החרוזים פעמיים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת פוספטאז ולאחר מכן פעמיים נוספות במאגר פולינוקלאוטיד קינאז או PNK ללא DTT. לבסוף השעו מחדש את החרוזים בנפח חרוזים מקורי אחד של מאגר PNK.כדי להתחיל בתיוג רדיו של RNA צולב. הוסף גמא 32 PATP ו-T ארבע PNK לנפח חרוז מקורי אחד של מתלה החרוזים הטרי שהוכן. דגרו את המתלה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הוסף TP לא רדיואקטיבי למתלה ודגר אותו למשך חמש דקות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את החרוזים המגנטיים חמש פעמים עם 800 מיקרוליטר של מאגר PNK ללא DTT. לבסוף, השעו מחדש את החרוזים ב -70 מיקרוליטר של דף SDS.מאגר טעינה דוגר על תרחיף תווית הרדיו למשך חמש דקות בבלוק חום ב-95 מעלות צלזיוס כדי לפרק ולשחרר את חלבוני ה-RNA המשקעים החיסונית עם ה-RNA המקושר. לאחר מכן הסר את החרוזים המגנטיים על המפריד והעביר את הסופר נטין לצינור מיקרו צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר טען 40 מיקרוליטר של הסודה לבאר של נובוקס ביס טריס ארבעה עד 12% ג'ל פולי אקרילאמיד טרומי והפעל את הג'ל למשך 55 דקות ב-200 וולט. לאחר שהג'ל נגמר, פרק את תא הג'ל ופרק את הצלחות, והשאיר את הג'ל מותקן על צלחת אחת כדי להקל על יישור הג'ל לתדפיס נייר הדמיית הפוספו.השתל שלוש חתיכות ג'ל רדיואקטיביות זעירות בצורה אסימטרית בפינות הג'ל. עטפו את הג'ל בסרט פלסטיק כגון ניילון סרן כדי למנוע זיהום. חשוף את הג'ל למסך הדמיית פוספו ריק למשך שעה אחת והוא על הדמיית פוספו.לאחר מכן, יישר את הג'ל על גבי תדפיס הדמיית הפוספו באמצעות חתיכות הג'ל המושתלות להתמצאות. גזרו את הרצועות התואמות את הגודל הצפוי של חלבון קושר ה-RNA או RBP. העבירו את הרצועות לצינור MIDI של דיאליזר dtu והוסיפו 800 מיקרוליטר של אלקטרו אלקטרו אלקטור מאגר XSDS אחד.קומפלקס R-N-A-R-B-P צולב ב-100 וולט למשך שעתיים לפי הוראות היצרן. לאחר הפליטה החשמלית. הוסף מאגר חלבון K ופרוטאינאז K דגר על התמיסה למשך 30 דקות בחום של 55 מעלות צלזיוס.שחזר את ה-RNA על ידי מיצוי אלכוהול איזואמיל פנול חומצי כלורופורם, ולאחר מכן מיצוי כלורופורם. לאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של גליקוגן וזרזו את ה-RNA על ידי הוספת שלושה נפחים של אתנול. לבסוף ממיסים את הגלולה המתקבלת ב -10.5 מיקרוליטר מים.לאחר שחזור ה-RNA, נשא אותו דרך פרוטוקול הכנת ספריית CDNA סטנדרטי ובצע ניתוח ביואינפורמטי זהיר של קריאות הרצף. תוצאות מייצגות עבור קליפ par שבוצע עם HK 2 93 תאים המבטאים דגל H ha מתויג IGF שני BP אחד מוצגות עם האנלוגים הנוקליאוזידים הפוטו-ריאקטיביים ארבעה SU ושישה SG יעילות הצלבה של הריבוזיד הפוטו-ריאקטיבי החלופי שש SG בדרך כלל נמוכה יותר מאשר עבור ארבעה su. יעילות הקישור הצולב הנמוכה יותר עשויה לגרום לרקע גבוה יותר של רצפים שמקורם בשברים של RNA סלולרי בשפע, ולכן יש להשתמש בתאים רבים יותר לניסוי.אנלוגים שונים של אורידין פוטו-ריאקטיביים מושווים לקישור צולב או קליפ UV 2 54 ננומטר מסורתי כפי שניתן לראות כאן. לקישור צולב של חלבון RNA UV 2 54 ננומטר יש יעילות צולבת מוגבלת. עוצמת הפס הרדיואקטיבי בגודל המתאים מצביעה על האם ניסוי קליפ ה-par עבד והאם בודד מספיק RNA כדי לבצע פרוטוקול ריצוף RNA קטן.תדירות המוטציות האופייניות בקריאות הרצף לאחר ניתוח ביואינפורמטי מעידות על רצפים צולבים בהצלחה. מוטציות אלו הן מעברי T שני C בעת שימוש בארבעה מעברי SU ו-G שני A בעת שימוש בהצלחה. ז. המאפיין המגדיר של שפת הפארק הוא האפשרות לגזור את מיקום הקישור הצולב על ידי ניקוד עבור מוטציה אופיינית השוכנת בספריות CD NA שהוכנו מה-RNA המשוחזרים.זה מאפשר הפרדה קלה של האות הנגזר מ-RNA קשורים במיוחד, מהרעש של רצפים שמקורם בשברים מבודדים של RNA סלולרי בשפע. אז הראינו לכם היום כיצד לבודד מקטעי RNA, המזוהים במיוחד על ידי חלבונים קושרי RNA. בעת ביצוע הליך זה.חשוב לעבוד ללא RNA. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים.

par-clip-method-to-identify-transcriptome-wide-binding-sites-rna

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

הסידור המרחבי של חלבונים RNA מחייב על תעתיק הוא הקובע המפתח של תקנה שלאחר תעתיק. לכן, פיתחנו הפרט נוקלאוטיד UV ברזולוציה crosslinking ו immunoprecipitation (iCLIP) המאפשר מיפוי מדויק גנום רחב של אתרי הקישור של חלבון-RNA מחייב.

iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

פרוטוקול מפורט להחלת לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome הלכידה (CARIC) האסטרטגיה כדי לזהות חלבונים איגוד כדי שני קידוד ו noncoding RNAs מוצג.

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

בשיטה זו, אנו מכמת את הזיקה המחייב של מאגד כריכת RNA (rbps) כדי קנצוני ואתרי כריכה שאינם קנצוני באמצעות שיטה פשוטה, לחיות, העיתונאי בתאי חיידקי. השיטת היסוד מבוססת על דיכוי של גן עיתונאי.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

הספציפיות לרצף היא קריטית. לתקנות הגנים חלבונים רגולטוריות המכירים רצפים ספציפיים חשובים עבור רגולציה גנטית. הגדרת אתרי קשירה פונקציונליים עבור חלבונים כאלה היא בעיה ביולוגית מאתגרת. גישה איטראטיבית לזיהוי של אתר מחייב עבור חלבון של איגוד RNA מתוארת כאן וישימה לכל החלבונים מבוססי RNA.

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

כאן אנו מציגים פרוטוקול קליפ-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq עם טיהור דגל-ביוטין טנדם כדי לקבוע את מטרות RNA של חלבונים מחייבים RNA (RBPs) בתאים יונקים.

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת במבחנה לחשיפה, כימות ואימות של אינטראקטורים חלבוניים של רצפי RNA ספציפיים, תוך שימוש בתמצית חלבון כוללת מתאים אנושיים, חרוזי סטרפטווידין המצופים ב-RNA ביוטינילציה וניתוח ספקטרומטריית מסות.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

למד את שיטת PAR-CLIP לזיהוי אתרי קישור של חלבוני RNA ברמת ה-transcriptome באמצעות אנלוגים נוקלאוסידיים פוטוריאקטיביים וקרוס-לינק UV. השיטה מאפשרת למדענים לחקור אינטראקציות RNA-חלבון בקנה מידה גנומי.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

גלה סרטונים נוספים