PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את אתרי הקישור הרחבים של הטרנסקריפטום של חלבונים קושרי RNA או RVPs. זה מושג על ידי שימוש ראשון באנלוגים של נוקלאוזידים פוטו-ריאקטיביים לתיוג in vivo של תעתיקים מתהווים. השלב השני של ההליך הוא הצלבת חלבונים קושרי RNA ו-RNA על ידי אור UV של 365 ננומטר.

השלב השלישי של ההליך הוא לזרז את החלבון קושר ה-RNA שנחקר ולשחזר את הקישור הצולב ל-RNA. השלב האחרון של ההליך הוא המרת ה-RNA לספריית CD NA ורצף עמוק. בסופו של דבר ניתן להשיג תוצאות המציגות אתרי קשירה רחבים של טרנסקריפטום של ה-RVPs ומאפשרות את ההגדרה של אלמנט זיהוי ה-RNA והעדפות הכריכה שלו.

היי, שמי מרקוס הופנר מהמעבדה של Tom SEL באוניברסיטת רוקפלר בניו יורק. היום נציג שיטה הנקראת par lip או צלע אנלוגית נוקלאוזיד ניתנת לצילום, קישור צולב משופר ומשקעים חיסוניים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לזהות על טרנסקריפטום לפי אתרי הקישור שלו של חלבונים קושרי RNA ומוטיבים והעדפות הקישור שלהם.

אוקיי, אז בואו נתחיל. in vivo קישור צולב UV מתחיל במכסה זרימה למינר. בפרוטוקול זה נשתמש ב-IGF מתויג שני תאי BP אחד כמודל לדוגמה בטכניקה סטרילית.

הרחב HEK 2 93 תאים המבטאים ביציבות דגל HA מתויג IGF שני BP אחד בשליטה של מדכא Tet במדיום תרבית תאים HEK 2 93 בין 100 ל -400 פעמים 10 לתאים השישיים ולגדל אותם לכ -80% שטף משותף. 14 שעות לפני הקישור הצולב, התאים קיבלו את אנלוגי הריבוזיד הפוטו-ריאקטיבי עבור תיאו אורידין או עבור SU ישירות למדיום תרבית התא. לחלופין, ניתן להשתמש בשישה גיני או שישה SG לאחר הוספת ביטוי הריבוזיד הפוטו-ריאקטיבי של הדגל HA המתויג IGF שני BP אחד על ידי הוספת תאי דוקסיציקלין מודגרים לאחר לילה בחממת התאים.

לאחר מכן, שפכו את אמצעי הגידול. לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת עם 10 מיליליטר מלח פוספט קר כקרח לכל צלחת. לאחר מכן הסר את ה- PBS לחלוטין על ידי סילוק.

הניחו את הצלחות החשופות על מגש עם קרח והקרינו אותן באור UV של 365 ננומטר ב-Straddle Link 2, 400 UV crosslinker או שווה ערך לאחר קרינת UV, גרדו את התאים עם שוטר גומי במיליליטר אחד של PBS לכל צלחת. העבירו את התאים לצינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלך את שם העל ושמור על גלולת התא.

בשלב זה, ניתן להקפיא כדורי תאים בחנקן נוזלי ולאחסן במינוס 80 למשך 12 חודשים לפחות. כדי להמשיך בהליך יש להשעות את הגלולה בשלושה נפחים של מאגר ליזה X NP 40 אחד, ולדגור על קרח למשך 10 דקות. נקה את הליזאט של התא על ידי צנטריפוגה ב -13, 000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה, נקה את הליזאט עוד יותר על ידי סינון דרך מסנן מזרק ממברנה של חמישה מיקרון. לבסוף, הוסיפו RNA T 1 לריכוז סופי של יחידה אחת למיקרוליטר ודגרו באמבט מים בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, מצננים את התגובה על קרח למשך חמש דקות.

בעקבות קישור צולב UV in vivo. הכן את החרוזים המגנטיים למשקעים חיסוניים. העבר 10 מיקרוליטר של חרוזי דינה חלבון G חלקיקים מגנטיים לכל מיל אחד של ליזאט תאים לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן הנח את הצינור המכיל את החרוזים על מעמד מגנטי למשך דקה עד שתיים. הסר את הסופרנטנט והוסף מיליליטר אחד של מאגר פוספט ציטראט לצינור כשהוא על המפריד המגנטי. לאחר מכן, כסו את הצינור ומערבלו את הדגימה כדי להשעות מחדש את החרוזים.

צנטריפוגה לזמן קצר כדי לאסוף את כל החרוזים שנותרו במכסה הצינור. חזור על שטיפה זו עם מיליליטר נוסף של מאגר פוספט ציטראט. לאחר החזרת הכביסה, השעו את החרוזים ואת מאגר הפוספט הציטראט בנפח של פי שניים מהנפח המקורי של תרחיף הסלק.

לאחר מכן הוסף 0.25 מיליגרם של אנטי-דגל M שני נוגדנים חד שבטיים לכל מיליליטר אחד של תרחיף פעימה. דגרו את המתלה על גלגל מסתובב למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, שטפו את החרוזים פעמיים במיליליטר אחד של מאגר פוספט ציטראט כפי שתואר קודם לכן, שטיפה זו משמשת להסרת כל נוגדן לא קשור לאחר הכביסה Resus, השעיית החרוזים ומאגר הפוספט ציטראט כמו לפני ארבע. כדי להתחיל במשקעים חיסוניים, הוסף את החרוזים המגנטיים המצומדים הטריים שהוכנו ל-RNAs T ליזאט תאים שטופלו

מעבירים את התערובת לצינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר ומסובבים במשך שעה בחום של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, אספו את החרוזים המגנטיים, השליכו את חרוזי ההשעיה הסופרנטנטים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת IP והעבירו אותם לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. שטפו את החרוזים כמתואר קודם פעמיים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת IP.

לאחר הכביסה הסופית, יש להשעות את החרוזים בנפח החרוזים המקורי של מאגר שטיפת IP. לאחר מכן הוסף RNAT אחד לריכוז סופי של 100 יחידות למיקרוליטר. דגרו את מתלה החרוזים באמבט מים של 22 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן יש לקרר את המתלה על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו את החרוזים שלוש פעמים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת מלח גבוה. לאחר מכן השעו מחדש את החרוזים בנפח חרוזים מקורי אחד של מאגר זרחון.

הוסף פוספטאז אלקליין במעי העגל לריכוז סופי של 0.5 יחידות למיקרוליטר ודגר את התרחיף למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שטפו את החרוזים פעמיים במיליליטר אחד של מאגר שטיפת פוספטאז ולאחר מכן פעמיים נוספות במאגר פולינוקלאוטיד קינאז או PNK ללא DTT. לבסוף השעו מחדש את החרוזים בנפח חרוזים מקורי אחד של מאגר PNK.

כדי להתחיל בתיוג רדיו של RNA צולב. הוסף גמא 32 PATP ו-T ארבע PNK לנפח חרוז מקורי אחד של מתלה החרוזים הטרי שהוכן. דגרו את המתלה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הוסף TP לא רדיואקטיבי למתלה ודגר אותו למשך חמש דקות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את החרוזים המגנטיים חמש פעמים עם 800 מיקרוליטר של מאגר PNK ללא DTT. לבסוף, השעו מחדש את החרוזים ב -70 מיקרוליטר של דף SDS.

מאגר טעינה דוגר על תרחיף תווית הרדיו למשך חמש דקות בבלוק חום ב-95 מעלות צלזיוס כדי לפרק ולשחרר את חלבוני ה-RNA המשקעים החיסונית עם ה-RNA המקושר. לאחר מכן הסר את החרוזים המגנטיים על המפריד והעביר את הסופר נטין לצינור מיקרו צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר טען 40 מיקרוליטר של הסודה לבאר של נובוקס ביס טריס ארבעה עד 12% ג'ל פולי אקרילאמיד טרומי והפעל את הג'ל למשך 55 דקות ב-200 וולט. לאחר שהג'ל נגמר, פרק את תא הג'ל ופרק את הצלחות, והשאיר את הג'ל מותקן על צלחת אחת כדי להקל על יישור הג'ל לתדפיס נייר הדמיית הפוספו.

השתל שלוש חתיכות ג'ל רדיואקטיביות זעירות בצורה אסימטרית בפינות הג'ל. עטפו את הג'ל בסרט פלסטיק כגון ניילון סרן כדי למנוע זיהום. חשוף את הג'ל למסך הדמיית פוספו ריק למשך שעה אחת והוא על הדמיית פוספו.

לאחר מכן, יישר את הג'ל על גבי תדפיס הדמיית הפוספו באמצעות חתיכות הג'ל המושתלות להתמצאות. גזרו את הרצועות התואמות את הגודל הצפוי של חלבון קושר ה-RNA או RBP. העבירו את הרצועות לצינור MIDI של דיאליזר dtu והוסיפו 800 מיקרוליטר של אלקטרו אלקטרו אלקטור מאגר XSDS אחד.

קומפלקס R-N-A-R-B-P צולב ב-100 וולט למשך שעתיים לפי הוראות היצרן. לאחר הפליטה החשמלית. הוסף מאגר חלבון K ופרוטאינאז K דגר על התמיסה למשך 30 דקות בחום של 55 מעלות צלזיוס.

שחזר את ה-RNA על ידי מיצוי אלכוהול איזואמיל פנול חומצי כלורופורם, ולאחר מכן מיצוי כלורופורם. לאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של גליקוגן וזרזו את ה-RNA על ידי הוספת שלושה נפחים של אתנול. לבסוף ממיסים את הגלולה המתקבלת ב -10.5 מיקרוליטר מים.

לאחר שחזור ה-RNA, נשא אותו דרך פרוטוקול הכנת ספריית CDNA סטנדרטי ובצע ניתוח ביואינפורמטי זהיר של קריאות הרצף. תוצאות מייצגות עבור קליפ par שבוצע עם HK 2 93 תאים המבטאים דגל H ha מתויג IGF שני BP אחד מוצגות עם האנלוגים הנוקליאוזידים הפוטו-ריאקטיביים ארבעה SU ושישה SG יעילות הצלבה של הריבוזיד הפוטו-ריאקטיבי החלופי שש SG בדרך כלל נמוכה יותר מאשר עבור ארבעה su. יעילות הקישור הצולב הנמוכה יותר עשויה לגרום לרקע גבוה יותר של רצפים שמקורם בשברים של RNA סלולרי בשפע, ולכן יש להשתמש בתאים רבים יותר לניסוי.

אנלוגים שונים של אורידין פוטו-ריאקטיביים מושווים לקישור צולב או קליפ UV 2 54 ננומטר מסורתי כפי שניתן לראות כאן. לקישור צולב של חלבון RNA UV 2 54 ננומטר יש יעילות צולבת מוגבלת. עוצמת הפס הרדיואקטיבי בגודל המתאים מצביעה על האם ניסוי קליפ ה-par עבד והאם בודד מספיק RNA כדי לבצע פרוטוקול ריצוף RNA קטן.

תדירות המוטציות האופייניות בקריאות הרצף לאחר ניתוח ביואינפורמטי מעידות על רצפים צולבים בהצלחה. מוטציות אלו הן מעברי T שני C בעת שימוש בארבעה מעברי SU ו-G שני A בעת שימוש בהצלחה. ז. המאפיין המגדיר של שפת הפארק הוא האפשרות לגזור את מיקום הקישור הצולב על ידי ניקוד עבור מוטציה אופיינית השוכנת בספריות CD NA שהוכנו מה-RNA המשוחזרים.

זה מאפשר הפרדה קלה של האות הנגזר מ-RNA קשורים במיוחד, מהרעש של רצפים שמקורם בשברים מבודדים של RNA סלולרי בשפע. אז הראינו לכם היום כיצד לבודד מקטעי RNA, המזוהים במיוחד על ידי חלבונים קושרי RNA. בעת ביצוע הליך זה.

חשוב לעבוד ללא RNA. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים.