איתור Immunofluorescent של שני אנלוגים Thymidine (CldU ו IdU) ברקמה ראשי
7 בדצמבר 2010
יש לנו נגזרת אסטרטגיה לזהות התאגדות של אנלוגים רציפים thymidine (CldU ו IdU) לתוך רקמות של עכברים בוגרים לכמת שני סיבובים רצופים של חלוקת התא. אסטרטגיה זו שימושית כדי לזהות מחזור התא של חיים ארוכים רקמות, שינוי בשעור, או מעבר, הגברה תאים.
שלום וברוכים הבאים לפרוטוקול הצביעה Calor D-U-I-D-U. היום הסרטון שלנו יתחיל בשלב השלישי: רהידרציה, חדירה ושחזור אנטיגנים. התחילו על ידי העמסת ה슬יידים שלכם לתוך הנשא.
לאחר טעינת השקופיות, הניחו אותן באמבט של xylene למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו אותן לאמבט xylene שני, שוב למשך חמש דקות.
המשיכו ברהידרציה (rehydration) של הנסליכים על ידי העברתם לתמיסות אתנול, החל מתמיסה של 100% ועד לתמיסה של 50%. השלימו את תהליך הרהידרציה של הנסליכים על ידי הנחתם למשך חמש דקות ב-1XPBS כדי להחדיר חומרים לממברנות התאים (permeabilization). טבלו את הנסליכים בתמיסת Triton X בריכוז 0.2% למשך חמש דקות. הכינו את הנסליכים לשחזור אנטיגן של רקמות באמצעות מיקרוגל על ידי הנחתם בביקר זכוכית עם נפח מספיק של באפר נתרן ציטראט בריכוז 0.01 molar, כך שהתמיסה תכסה את הנסליכים בגובה של חמישה סנטימטרים מעל פני השטח שלהם.
כדי לפצות על איבוד עקב אידוי, חמם את השקופיות במיקרוגל עד שהתמיס רותח. פעולה זו אמורה להימשך כ-3 עד 10 דקות בהספק מלא. ודא שהשקופיות רותחות.
הפחית את הספק המיקרוגל לבין 10% ל-80% והמשך להרתיח באיטיות את השקופיות למשך 20 דקות נוספות. לאחר ההרתחה, הנח את הכוס הכוללת את השקופיות על משטח העבודה כדי לאפשר להן להתקרר באיטיות במשך כשעתיים, עד שיגיעו לטמפרטורת החדר. ודא שהשקופיות נמצאות בטמפרטורת החדר.
טבול את השקופיות ב-1.5 חומצה כלורית טבעית למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. הוצא את השקופיות מחומצה הכלורית והנח אותן למשך חמש דקות בשטיפה של 1X PBS. לאחר מכן בצע שטיפה שנייה ב-1X PBS.
הוציאו את השקופיות מתמיס ה-one XPBS באמצעות עט שעווה חוסם נוזלי. סמנו במעגל כל נתח רקמה והחזירו את השקופית אל ה-PBS. הכינו תא דגירה לח על ידי הנחת מגבת נייר רטובה בתחתית של מכל אטום לאוויר.
הכינו תמיסת חסימה של 10% docking serum המדוללת ב-one XPBS. חשוב לכסות לחלוטין כל נתח רקמה בתמיסה, עבור נתחי רקמה שגודלם הטיפוסי הוא כ-1 על ידי 1.5 סנטימטרים. נפח של 50 µL של תמיסת חסימה הוא מספיק.
הכינו את הנוגדן הראשוני ל-IDU על ידי דילול אנטיסרום של עכבר נגד BRDU בסרום חמור בריכוז 5%. הוסיפו בריכוז של 1:250. טפטפו את התמיסה הראשונית על כל אחד מחתכי השקופית.
הניחו את השקופיות במקרר בטמפרטורה של 4°C. עבור דגירה למשך לילה, הכינו תמיסת שטיפה בעלת מחומרות גבוהה. TBST יעיל למטרה זו.
סידור השקופיות גב אל גב. העבירו את השקופיות לכ- 35 עד 40 milliliters של תמיסת TBST. הניחו את המבחנות באינקובטור לתרביות חיידקים עם ניעור בטמפרטורה של 37 °C.
השאר אותם לנער למשך 20 דקות ב-225 RPM. כעת העמס את השקופיות לתוך נשא. הנח את השקופיות ב-XPBS אחד לשטיפה ב-PBS למשך חמש דקות.
לאחר מכן תבוצע שטיפה שנייה ב-XPBS למשך חמש דקות. הכין את תמיסת הנוגדן הראשוני ל-CLDU על ידי דילול של rat anti BRDU בסרום חמור בריכוז 5%. הוסף ריכוז של 1:250, הנח את השקופיות על נייר סופג ולאחר מכן סמן אותן בעט שעווה.
השתמשו בפיפט כדי לכסות כל נתח רקמה בתמיסת CLDU ראשונית. השתמשו בכ-50 µL תמיסה כדי להבטיח שכל נתח רקמה מכוסה לחלוטין. הניחו את השקופיות במקרר בטמפרטורה של 4 °C לדגירה למשך לילה.
הניחו את השקופיות בנשא ולאחר מכן העבירו אותן לשטיפה ראשונה ב-1X PBS למשך חמש דקות. העבירו את השקופיות לשטיפה שנייה ב-1X PBS למשך חמש דקות. הכינו נוגדנים שניים על ידי דילול של נוגדני CY2 donkey anti-RAD ו-PS5 donkey anti-muse ב-5% Donkey serum. DPI ישמש גם לצביעת גרעין; כסו לחלוטין את חיתוכי הרקמה בנוגדנים השניים.
50 µL תמיסות אמורים להספיק כדי לכסות לחלוטין את הרקמה שלך. הנח את תא ההידרטציה במקום חשוך בטמפרטורת החדר לדגירה של שעה אחת. הנח את השקופיות בנשא ולאחר מכן העבר אותן לשטיפה אחת ב-XPBS למשך חמש דקות.
הנח את הנסקיות לשטיפה שנייה ב-XPBS למשך חמש דקות. הסר עודפי תמיסת PBS באמצעות נייר סופג. לאחר מכן, קח Prolonged Gold anti-fade mounting media והנח טיפה קטנה ממנו על כל נתח רקמה.
קחו זכוכית כיסוי והניחו אותה בעדינות על גבי נתחי הסלייד. השתמשו בנייר סופג כמשקולת כדי לדחוס החוצה בועות אוויר עודפות שייתכן ונלכדו בין נתחי הסלייד לזכוכית הכיסוי. לבסוף, השתמשו בקצה פיפטה כדי לדחוף החוצה בועות אוויר עודפות שייתכן שנותרו. דמיינו את הרקמה המבוקשת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במקור אור בעל אנרגיה גבוהה ובערוצי פלואורסצנציה מרובים לצורך כימות התוצאות.
התחילו בספירת מספר התאים החיוביים ל-Dabi. ספרו את מספר התאים החיוביים ל-CLDU באמצעות תמונת שני הערוצים של ה-SI. ספרו את מספר התאים החיוביים ל-IDU באמצעות תמונת חמשת הערוצים של ה-SCI.
לבסוף, ספרו תאים המסומנים באופן חיובי כפול על ידי מעבר בין קובץ התמונה של ערוץ SCI two לזה של ערוץ SCI five.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לזיהוי שילוב רצפי של אנלוגים של תימידין (CldU ו-IdU) ברקמות של עכברים בוגרים, המאפשרת כימות של שני סבבים רצופים של חלוקת תאים. טכניקה זו בעלת ערך למחקר של תחלופת תאים ברקמות בעלות אורך חיים רב, טרנספורמציה אונקוגנית ותאים עם הגברה מעברית (transit-amplifying cells).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
רקע
- אנלוגים של תימידין משמשים לסימון תאים המתחלקים.
- הבנת חלוקת התאים היא חיונית לחקר התחדשות רקמות.
- תחלופה תאית היא חשובה הן בפיזיולוגיה תקינה והן במצבי מחלה.
- סימון רצופי יכול לספק תובנות לגבי הדינמיקה של אוכלוסיות תאים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לכימות חלוקת תאים ברקמות.
- הערכת ההשלכות של תחלופת תאים בהקשרים ביולוגיים שונים.
- העמקת ההבנה של תהליכים אונקוגניים באמצעות ניתוח חלוקת תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שילוב סדרתי של CldU ו-IdU ברקמות עכבר.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לוויזואליזציה של תאים מסומנים.
- כימות של תאים חיוביים ל-DAB, CldU ו-IdU.
- שימוש בנוגדנים ספציפיים לזיהוי אנלוגים של תימידן.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של חלוקה תאית עקיפה בדגימות רקמה.
- ניתוח כמותי של קצבי תחלופה של תאים.
- זיהוי של סמנים פוטנציאליים לטרנספורמציה אונקוגנית.
- תובנות על התנהגותן של תאים במצב הגברה (transit-amplifying cells).
מסקנות
- השיטה שפותחה מספקת גישה חסונה לחקר חלוקת תאים.
- הממצאים תורמים להבנת הדינמיקה של רקמות במצב בריאות ומחלה.
- ניתן להחיל טכניקה זו על תחומי מחקר שונים, כולל אונקולוגיה ורפואה רגנרטיבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות מדויק של חלוקת תאים עקבית מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית בתהליך תיקוף המטרה (target validation) על ידי הבהרת הדינמיקה הפרוליפרטיבית במערכות הרלוונטיות למחלה. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים על ידי הבחנה בין תגובות פרוליפרטיביות חולפות לכאלה מתמשכות, ובכך מספקת מידע לזיהוי מועמדים מובילים (lead identification) ולתיעוד ותעדוף של תיקי פיתוח. התאימות של השיטה לרקמות ארוכות חיים משפרת את גילוי הביומארקרים תרגומיים באונקולוגיה וברפואה רגנרטיבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידה של שני סבבי חלוקה תאיים עוקבים ברקמה ראשונית.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות ויזואליזציה ישירה של קינטיקת התרבות במודלים של מחלות.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי כימות שיעורי תחלופה תאית, המנחים את רמת הביטחון במטרה ואת ויסות המסלול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף להערכת תרכובות בהמשך התהליך באמצעות פרוטוקולי צביעה אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים.
- פלט כמותי: הפקת ספירות מדידות של תאים חיוביים ל-DAB, CldU ו-IdU לצורך נקודות קצה ניתנות לשחזור בסריקות.
- قابליות להרחבה: אופטימיזציה למתן מינונים נמוכים של אנלוגים של תימידין דרך מי השתייה, המאפשרת מחקרי מינון כרוניים במודלים פרה-קליניים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: יישום לזיהוי טרנספורמציה אונקוגנית ולהערכת תרומתם של תאי הגברה מעבריים (transit-amplifying cells) לצמיחת הרקמה.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי אספקת נתוני פרוליפרציה כמותיים במגוון סוגי רקמות.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק בסיס לאסטרטגיות קידום על ידי הבהרה אם הצמיחה שנצפתה נובעת מפעילות של תאי גזע או מהתרחבות של תאי הגברה מעבריים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד ליעילות פרה-קלינית, ומספקת מדדי התרבות התומכים בהחלטות go/no-go בכל שלב.
- ביולוגיית גילוי: תומך בבדיקת השערות באמצעות כימות סינתזת DNA סדרתית בתגובה להפרעות פקטוריאלגיות או גנטיות.
- סריקה: מספק חתכי רקמה מוכנים לבדיקה עם זיהוי סטנדרטי של שילוב אנלוגים של תימידין לצורך סריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה של מדדי פרוליפרציה בין תנאים שונים באמצעות הפרדה של ערוצים פלורסצנטיים וכימות תאים כפולי-חיוביים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לתיקוף פרה-קליני על ידי מעקב אחר דינמיקת שושלת תאים ברקמות הרלוונטיות למחלות אנוש.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר למחקרי פרוליפרציה אורךיים במגוון תחומים טיפוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות על ידי אספקת ראיות ישירות להיסטוריית חלוקת התאים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות זרימות עבודה סטנדרטיות של חדירות (permeabilization), שחזור אנטיגן וצביעה אימונוהיסטוכימית מרובת סמנים (multiplex immunostaining).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות בהתבסס על פוטנציאל פרוליפרטיבי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי הבחנה בין השפעות טיפוליות על מדורי תאי גזע לעומת תאי פרוגניטור.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונוהיסטוכימיה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית לזיהוי מולטיפלקס.
- תלוי בגישה לתשתיות לשחזור אנטיגן (מיקרוגל, בופר ציטרט) וביכולות לדגימה רצפית של נוגדנים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של פרוטוקולי חסימה, שטיפה והרכבה כדי למזער השפעות של סדרות (batch effects).
- התאמה בין מערכות מודל שונות דורשת תיקוף של ספציפיות הנוגדנים וחדירות הרקמה בכל הקשר.
- מגבלות מעשיות כוללות הסתרה פוטנציאלית של האפיטופ והצורך באופטימיזציה של לוחות זמני מינון של אנלוגים כדי למנוע רעילות.
