נוהל הנדסה ריאות
March 8th, 2011
פיתחנו מטריצה ריאות decellularized תאיים ו bioreactor הרומן biomimetic שניתן להשתמש בהם כדי לייצר רקמת הריאה תפקודית. על ידי זריעת תאים לתוך המטריצה ו culturing ב bioreactor, אנו מייצרים רקמה מדגים חילוף הגזים יעיל כאשר מושתלים in vivo לתקופות קצרות של זמן.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר רקמת ריאה בתרבית הניתנת להשוואה מורפולוגית ופיזיולוגית לרקמת ריאה מקומית. זה מושג על ידי קצירת הלב והריאות מחולדה בוגרת. השלב הבא הוא קנולציה של עורק הריאה וקנה הנשימה ולחבר את הריאות הקנולריות לביו-ריאקטור לצורך דה-סלולריזציה.
לאחר דה-סלולריזציה ושטיפה, הריאה מועברת לביו-ריאקטור תרבית סטרילי ומוכנה לישיבה. השלב האחרון בהליך הוא לזרוע את התא הרצוי של הריאה עם אוכלוסיית תאים מוכנה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את המטריצה החוץ-תאית המאוכלסת מחדש ביעילות בתאים המבטאים סמני ריאות ספציפיים לאזור באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות לתרבית תאי ריאה במבחנה הוא שהתאים שומרים על פנוטיפים מובחנים לפרק זמן ממושך, כך שניתן לחקור אותם במשך מספר שבועות במצע תלת מימדי שמקורו ביולוגית. לצורך דה-סלולריזציה, הריאות מחוברות למכסה הביוריאקטור דרך צינורית כלי הדם, והכובע מחובר למנגנון הדסלולריזציה. בקבוק הזכוכית מעל הריאות מוחזק במקומו על ידי מעמד טבעות ומהדק מחובר.
בשלב זה, ניתן להסיר חומר סלולרי כדי לייצר פיגום מטריצה חוץ-תאי, אותו ניתן לאכלס מחדש בחומר סלולרי. הרכבת הביוריאקטור לזריעה ותרבית של רקמת ריאה מהונדסת מוצגת בתרשים זה. מחבר נעילת הפיתוי של צינורית קנה הנשימה מתחבר ללולאת נשימה בין מאגר קנה הנשימה לתא הראשי.
לולאת הנשימה כוללת שני שסתומים חד כיווניים. מיקומים כך שהמדיום עוקב אחר נתיב שונה לתוך הריאה והחוצה ממנה. מאגר קטן משולב באופן זמני בקו הזלוף לזריעה של תאי אנדותל.
משאבה פועמת משמשת להעברת תאים מהמאגר לתא כלי הדם של הריאה. זלוף כלי דם מסופק באמצעות משאבת רולר. המדיום מוזרם לעורק הריאה דרך הצינורית המחוברת, זורם דרך כלי הדם של הריאה והחוצה מווריד הריאה ישירות לתוך הביוריאקטור הראשי שבו נמשך המדיום לזילוף.
אפיתל ריאתי יושב על ידי הזרקה בלולאת הנשימה. החדר הראשי המכיל את הריאה ומאגר קנה הנשימה משמשים לתרבית ריאות לטווח ארוך. כאשר הריאות חולצו והעורק וקנה הנשימה מחוללים כהלכה, הריאות הטריות שחולצו אמורות להחזיק אוויר מבלי לדלוף.
ניתן לאמת זאת על ידי ניפוחם באוויר כשהם שקועים בנוזל. לא אמורות להיות בועות המעידות על דליפות אוויר. כדי להתחיל את הפרוטוקול, הריאות מנופחות עם PBS המכיל צד נתרן ניטרופרס עד שהריאות מלאות אך לא מנופחות יתר על המידה מכסים מיד את צינורית קנה הנשימה כך שהריאות נשארות מנופחות.
לאחר מכן, יש לחלחל את הריאות עם PBS ו- SNP למשך 15 דקות לפחות ב -15 מילימטר כספית. לאחר מכן, הסר את הפקק מצינורית קנה הנשימה כדי לאפשר לריאות להתרוקן. המשך בזלוף עם PBS ו-SNP למשך 15 עד 30 דקות במידת הצורך.
מלאו PBS ו-SNP כדי להבטיח שלחץ השפע נשמר ב-10 עד 15 מילימטרים של כספית. כדי להתחיל בהליך של דה-סלולריזציה ארוכה, מכסה הביוריאקטור מחובר למנגנון הדסלולריזציה. ואז הריאות מחוברות לכובע.
באמצעות חיבורי נעילת הפיתוי המקושרים לצינורית בצורת YS, צינורית עורק הריאה צריכה להתחבר לקו הזלוף וצינורית קנה הנשימה צריכה לצוף בחופשיות. כדי להבטיח דה-סלולריזציה מלאה של הרקמה, חיוני להרחיק אוויר מהמערכת. השסתומים החד-כיווניים בצינורית העורקים וקנה הנשימה עוזרים לנקות בועות אוויר בצינור על ידי מתן אפשרות לזרימה הפוכה בצינור.
לכן, אפשר להסיר בועות אוויר באמצעות מזרק, ודא שכל הקווים נקיים מאוויר. התחל זלוף עם תמיסת דה-סלולריזציה. מועשר בתמיסת דה-סלולריזציה.
עד ש-500 מיליליטר של תמיסה חדרו דרך הריאות, הלחץ האופטימלי הוא פחות מ-15 מילימטרים של כספית. זה בדרך כלל ידרוש 2.5 שעות. קצבי הזרימה בדרך כלל איטיים מאוד בהתחלה וגדלים במהירות במהלך השעה השנייה לכמיליליטר לדקה או יותר.
במהלך הזלוף שהוסר מעת לעת, השתמש בנוזל דה-סלולריזציה מהביו-ריאקטור תוך הקפדה על שאריות מספיק נוזלים כדי לתמוך בצינורית הריאה וקנה הנשימה. לאחר השלמת הזלוף עם נוזל הדה-סלולריזציה, העבירו את הריאות והביו-ריאקטור למכסה המנוע של תרבית רקמות. כדי להתחיל בשטיפת איברים, הסר את צנצנת ה-500 מיליליטר המכילה את נוזל הדסלולריזציה והחלף אותה בצנצנת סטרילית המכילה עד ליטר אחד של PBS סטרילי.
השתמש ביניקת ואקום או במזרק כדי להבטיח שהקווים נקיים מאוויר החדרת PBS דרך כלי הדם ב-10 עד 15 מילימטרים של כספית באותו אופן. באשר לדה-סלולריזציה, שימוש בטכניקות סטריליות מסיר מעת לעת פסולת PBS מהביו-ריאקטור ומחליף או ממלא מחדש את צנצנת ה-PBS. עם PBS טרי וסטרילי המשיכו לשטוף עד שלפחות 2.5 ליטר PBS סטרילי חלחלו לריאות.
זה בדרך כלל ייקח יומיים מתחילת תהליך הדה-סלולריזציה עם השלמת השטיפה. העבירו את הריאות למערכת ביו-ריאקטור סטרילית חדשה המכילה PBS טרי בתוספת 10% FBS בתוספת 10% סטרפטוקוקוס עט מבטיחים שגם כל לולאת הזלוף וגם כל קווי דרכי הנשימה מלאים בנוזל. מכאן ואילך תשמש משאבה פועמת להזרמת הריאות במהירות של חמישה מילימטרים לדקה.
עקר את פיגום המטריצה החוץ-תאית של הריאות על ידי זלוף לילה עם PBS המכיל 10% FBS ו-10% סטרפטומיצין פניצילין. לאחר השלמת שלב זה, העבירו את הריאות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה או עד לאיזון הטמפרטורה. כהכנה לטיפול בבן נאס, השלב הבא הוא טיפול בריאות בבן נאס.
כדי להסיר שאריות DNA לכל ריאה, מלאו תחילה מזרק אחד של 10 מיליליטר במאגר Ben Nase Prewarm בלבד, ומזרק אחד של 10 מיליליטר עם 90 יחידות למיליליטר. בן נאס מדולל במאגר בן נאס. הפסק זלוף של הריאות.
לאחר מכן נפחו את דרכי הנשימה עם בופר בן נאס תוך הימנעות מהזרקת אוויר לריאות. אפשר לריאה להתרוקן למשך דקה אחת. לאחר מכן נפחו את הריאה בתמיסת בן נאס.
שוב, להיזהר לא להכניס אוויר לריאה לאחר ניפוח עם בן נאס. אפשר לריאות לשבת ללא זלוף או אוורור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. בתום השעה המשיכו את הזלוף עם PBS בתוספת 10% FBS 10% פניצילין סטרפטומיצין שכבר נמצא בביו-ריאקטור, והמשיכו את הזלוף למשך הלילה למחרת.
לאחר שטיפה ועיקור ניתן להכין את פיגום המטריצה החוץ-תאי הארוך לאכלוס מחדש של תאים. החלף את הבנזו P-B-S-F-B-S תמיסה בתרבית של 250 מיליליטר. פרפו בינוני למשך שעה לפחות לפני הכנסת התאים והחלף במדיום תרבית טרי ישירות לפני זריעת התאים.
ניתן להשתמש במקורות תאים רבים לנסיגת איברים. כאן יודגמו מקומות ישיבה עם אוכלוסיית תאי אפיתל. ראשית, הכינו מזרק המכיל 15 מיליליטר של תרחיף תאים של אוכלוסיית תאי האפיתל הרצויה.
לאחר מכן, מלאו את מאגר דרכי הנשימה ב-80 מיליליטר של מדיום תרבית וודאו שכל קווי האוורור נקיים מאוויר. לאחר מכן הנח את הביוריאקטור בחממת תרבית רקמות של 37 מעלות צלזיוס וחבר את משאבת המזרק לאוורור. זרע את התאים לריאות באמצעות בולוס מהיר יחיד על ידי הזרקת תרחיף התאים של 15 מיליליטר לתוך צינורית קנה הנשימה.
ודא שמסנני האוויר בביו-ריאקטור הראשי מכוסים. לאחר מכן התחל מיד נשימה איטית אחת באמצעות משאבת המזרק כדי להוציא 60 מיליליטר אוויר מהביו-ריאקטור הראשי בשלושה מיליליטר לדקה. זה יימשך כ-20 דקות.
A מאפשר לריאות לשבת באופן סטטי במשך כ-18 שעות לאחר מכן. התחל זלוף כלי דם איטי במהירות של כ-0.5 מיליליטר לדקה. במהלך תרבית איברים, הזלוף מבוצע בדרך כלל במהירות של 1 עד 3 מיליליטר לדקה.
באמצעות משאבת רולר במהלך תרבית אפיתל, האוורור מסופק בדרך כלל בקצב רציף של נשימה אחת לדקה ונפח גאות של חמישה עד 10 מיליליטר. באמצעות משאבת מזרק האוויר נשלף באופן מחזורי ומוזרק לתוך הביוריאקטור כדי להשפיע על הנשימה על ידי חילופין בין לחץ שלילי ללחץ אטמוספרי בתוך החדר הראשי. בשל הצורך לשמור על הביוריאקטור אטום במהלך האוורור, יש להשהות את האוורור מדי יום ולהחליף את האוויר בתא הראשי.
בנוסף, יש להחליף את המדיום בערך כל שלושה עד ארבעה ימים. במהלך התרבית, יש להחליף כמחצית מהנפח הכולל בכל פעם על ידי תרבית אפיתל ריאתי ואנדותל כלי דם. בתוך הפיגום המותקן בביו-ריאקטור, אנו מסוגלים לייצר רקמת ריאה המסוגלת להשתתף בחילופי גזים למרווחי זמן קצרים.
כתם המט, טואין ואואין סטנדרטי של ריאת חולדה ילידית מוצג כאן להשוואה עם כתם H ו-E של ריאת חולדה נטולת תאים. המטריצה החוץ-תאית הסופית צריכה להיות נטולת חומרים סלולריים לחלוטין ולשמור על המאפיינים הגסים, המיקרוסקופיים והאולטרה-מבניים של הריאה הילידית. כתם h ו- e יאפשר הדמיה של כל שארית DNA, הדבקה לפיגום כתוצאה מחוסר תאים או שטיפה בתנאים אופטימליים לזריעת תאים ותרבית ריאה לאחר מכן.
והביו-ריאקטור אמור להניב תאים מפוזרים היטב בכל חמש האונות של הריאה ואמור לספק כיסוי של כ-70% מפיגום המטריצה החוץ-תאית. תמונות אלה משוות ריאות ילידיות לריאה מאוכלסת מחדש כאשר הן מוכתמות על ידי אימונופלואורסצנטיות. עבור סמני ריאות מרכזיים, אוכלוסיית התאים המתורבתים חיובית לחלבון המפריש תאי קלרה חלבון מפריש C ואקוופורין חמש.
הסמנים המעניינים מוצגים באדום והגרעינים המוכתמים ב-DAPI מופיעים בכחול בכל הפאנלים. לאחר שליטה בהליך זה מהסרת תאים לנסיגה, ניתן לבצע תוך ארבעה עד חמישה ימים אם מבוצע כראוי.
סקירה
מחקר זה מציג שיטה לייצור רקמת ריאות תפקודית באמצעות מטריצה חוץ-תאית של ריאות מנוקות מתאים וביו-כור ביומטי מחקה חדש. הגישה מאפשרת חילוף גזים יעיל כאשר הרקמה המהונדסת מושתלת ב-vivo.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- רפואה התחדשותית
- הנדסת רקמות
- חומרים ביולוגיים
רקע
- הסרת תאים מסירה חומר תאי מהריאות כדי ליצור מסגרת.
- שמירה על פנוטיפים מובחנים של תאי ריאות חיונית למחקרים ארוכי טווח.
- שיטות קיימות לעיתים קרובות נכשלות בשימור המבנה הטבעי של הרקמה.
- טכניקה זו נועדה להתגבר על מגבלות של תרבות תאי ריאות מסורתית in vitro.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה לייצור רקמת ריאות המדמה את המורפולוגיה והפונקציה הטבעית של הריאות.
- לשפר את האורך החיים והפונקציונליות של תאי ריאות מתורבתים.
- להקל על מחקר ביולוגיה של הריאות בסביבה תלת-ממדית.
שיטות ששימשו
- קצירת ריאות מחולדות בוגרות והחדרת קנולה לעורק הריאתי ולקנה הנשימה.
- חיבור ריאות לביו-כור להסרת תאים וזריעת תאים עוקבת.
- שימוש במיקרוסקופיה אימונופלואורוסצנטית להערכת התיישבות מחודשת של תאים וביטוי מרקרים.
- שמירה על תנאים סטריליים לאורך כל תהליכי הסרת התאים והתרבות.
תוצאות עיקריות
- המטריצה החוץ-תאית שהוסרה מתאים אוכלסה בהצלחה מחדש בתאי ריאות.
- התאים שמרו על פנוטיפים מובחנים לתקופות ממושכות.
- הוכח חילוף גזים יעיל in vivo לאחר השתלה.
- הגדרת הביו-כור אפשרה עירוי מבוקר ותרבות לטווח ארוך.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה מבטיחה להנדסת רקמת ריאות תפקודית.
- יש לה פוטנציאל ליישום ברפואה התחדשותית ובמחקר מחלות ריאות.
- מחקרים עתידיים עשויים לחקור את הכדאיות והפונקציונליות לטווח ארוך של הרקמה המהונדסת.
