Name: נוהל הנדסה ריאות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: למד שיטה להנדסת ריאות פונקציונליות באמצעות מטריצה חוץ-תאית מופרדת מתאים וביוריאקטור ביומימטי חדשני. השיטה מאפשרת חילוף גזים אפקטיבי לאחר השתלה בחי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים Maegan ב Colehour לעזרה בפיתוח bioreactor. מחקרים אלו מומנו על ידי אוניברסיטת ייל מחלקת הרדמה ועל ידי NIH מענק HL 098,220 (כדי LEN). THP נתמך על ידי NIH T32 GM007171.

<ol><li>American Lung Association. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lung+Disease+Data%22">Lung Disease Data</a>. , (2008).</li>
<li>Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+for+the+Long+Term+Culture+of+Lung+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue.</a> Cell Transplant. , (2010).</li>
<li>Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+surface+tension+induced+epithelial+cell+damage+in+a+model+of+pulmonary+airway+reopening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening.</a> J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).</li>
<li>Petersen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Engineerined+Lungs+for+in+Vivo+Implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329, 538-5341 (2010).</li>
<li>Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat Med. 16, 927-9233 (2010).</li>
<li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).</li>
<li>Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+alveolus-like+structure+from+alveolar+type+II+epithelial+cells+in+three-dimensional+collagen+gel+matrix+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture.</a> Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).</li>
<li>Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+remodeling+by+dynamic+strain+in+a+three-dimensional+tissue-engineered+human+airway+wall+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Respiratory+Cell+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model.</a> American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).</li>
<li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-enginered+lung%3A+an+in+vivo+and+in+vitro+comparison+of+polyglycolic+acid+and+pluronic+F-127+hydrogel%2Fsomatic+lung+progenitor+cell+constructs+to+support+tissue+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth.</a> Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).</li>
<li>Price, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Decellularized+Lung+Bioreactor+System+for+Bioengineering+the+Lung%3A+The+Matrix+Reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded.</a> Tissue Eng Part A. , (2010).</li>
<li>Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differentiation+of+alveolar+type+II+epithelial+cells+in+vitro%3A+effects+of+cell+shape%2C+cell-matrix+interactions+and+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions.</a> Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).</li>
<li>Cortiella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng Part A. , (2010).</li>
</ol>

LEN מחזיק המניות Humacyte, חברה רפואה רגנרטיבית. Humacyte לא קרן המחקרים הללו, וגם לא השפיע על עיצוב, פרשנות, או דיווח של כל הניסויים או בשיטות המתוארות. המחברים (LEN, THP, EAC) ואת אוניברסיטת ייל הגישו בקשה לפטנט הקשורים להנדסת רקמות של הריאות.

ההיבטים הקריטיים ביותר של המערכת המוצגת כאן כוללת תחזוקה של עקרות, ומעקב קרוב לחצי להחיל המיטה כלי דם לאורך כל התהליך של הכנת זריעת הפיגום ו culturing הריאה אוכלס מחדש. עקרות מתוחזק על ידי מיטב מעוקר כל החומרים לפני השימוש, על ידי הרכבה הריאה במערכת סגורה זמן קצר לאחר explant והימנעות הפרה שלאחר מכן המכשול הזה. אחרי מטריקס decellularized כבר השטיפה והועברו bioreactor סטרילית לתרבות, כובע סיליקון חותמות אחרות קשרים לא צריך להיות מופרע או להסירו. כדי לשמור על הלחצים לבדוק, תזרים מונע על ידי כוח הכבידה עדיפה במידת האפשר. כאשר המשאבה נדרש recirculation של נוזל, החל לאחר שטיפה עם PBS והמשך במהלך התרבות, אנו ממליצים ישירות מדידת הלחץ לפני נוזל מזין את עורק הריאה עם מתמר הלחץ. עוצמת הלחץ המופעל לא יעלה על 15 מ&quot;מ כספית. הריאות Recellularized יכול להיות מתורבת לפרקי זמן, בדרך כלל החל 4 ימים עד 3 שבועות. זלוף דם מושגת בדרך כלל 1-3 דקות מ&quot;ל / במהלך התרבות האנדותל, תוך אוורור מיושם בדרך כלל במהלך התרבות אפיתל בקצב נשימה 1 / min. בתקופות תרבות משולב, אוורור זלוף בו זמנית מתאים. אוורור יכול להתבצע עם בינוני או נוזל או אוויר. במהלך העשורים האחרונים, כמה קבוצות עשו עבודה הנדסת רקמות חשוב להראות את הכדאיות של הבחנה אפיתל הריאות במבחנה של שכפול כמה היבטים של הריאות microanatomy 7,8,9, 10. עם זאת, עד לאחרונה, אף 4,5 אלה ניסיונות מהנדס רקמת הריאה הניבו איבר להשתלה כי הצליחה לשמור על הפרדה בין הדם לתאים בדרכי הנשימה וזה יכול להשתתף חילוף הגזים. לכן, אם כי השיטות שתוארו הן רק צעד ראשון לקראת המטרה ארוכת הטווח של יצירת רקמת הריאה פונקציונלי, עבודה זו היא צעד מעודד לקראת אפשרות של הגדלת כמות רקמת הריאה זמינים להשתלה. יתר על כן, עבודה זו מרחיב העבודה שנעשתה על ידי אוט et al. ו Uygun ועמיתיו 11,12, הוכחת היעילות של מטריצה ​​תאיים decellularized כמו פיגום להנדסת רקמות תלת ממדי מבנים מורכבים ותמיכה הצמיחה וההישרדות של סוגים שונים של תאים . עבודה זו היא משמעותית גם עבור תרומתה בארסנל של התא הנשימה ביולוגים מולקולריים. על ידי מתן ייחודי, תלת מימדי סביבה יכול גם לספק גירוי מכני מתאים, וזה לא לשתף את הסיכון הנלווה של בידול דה מהיר כי אחד עשוי להיתקל בהן בעת מכרסם culturing אפיתל במעבדה עם שיטות מסורתיות יותר 13, מדענים יכולים להשתמש המערכת שלנו כדי לקבל תובנה חדשה אינטראקציות תא תא ותא-matrix כי תפקיד התמיינות תאים ותפקוד. ידע זה עשוי להיות חזק במיוחד אם משתמשים בו כמנוף להנחות את גורלו של אוכלוסיות תאים שונות גזע, כקבוצה של Cortiella הוכיחה במחקרים הראשונית 14.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> המתה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> הפרין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן nitroprusside </td><td> Fluka </td><td> 71778 </td><td></td></tr><tr><td> Euthasol פתרון המתת חסד </td><td> Virbac AH </td><td> 710101 </td><td> 390 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון pentobarbital מניות נתרן צריך להיות מדולל כראוי לניהול IP </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell פתרון </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> בחורים </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB01915 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT בייקר </td><td> 3722-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Bioreactor רכיבי </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 480 מ&quot;ל צנצנת </td><td> קול בן הזוג </td><td> EW-3460560 </td><td></td></tr><tr><td> פקק סיליקון, גודל 14 </td><td> קול בן הזוג </td><td> EW-06298-26 </td><td></td></tr><tr><td> Y-מחברים </td><td> קול בן הזוג </td><td> ED-30614-08 </td><td> משמש cannulae בעורקים קנה הנשימה </td></tr><tr><td> צינורות סיליקון </td><td> Masterflex </td><td> 96420-14; 16 </td><td> L / S 14, 16 </td></tr><tr><td> לחץ Transducers </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX-212 </td><td></td></tr><tr><td> שסתום כוון אחד </td><td> קול בן הזוג </td><td> EW-98553-20 </td><td> אחד דרך שסתום </td></tr><tr><td> 4-way והברזים למיניהם </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 594WSC </td><td></td></tr><tr><td> מזרק מסנן </td><td> קול בן הזוג </td><td> 2915-08 </td><td> PTFE, 0.2μm </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell ואת המנגנונים שטיפה (תוספות bioreactor) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 מ&quot;ל ו - 1000 בקבוקי זכוכית </td><td> קורנינג </td><td> 1395-500;-1L </td><td> משמש decell ושטיפה על ידי כוח הכבידה </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Benzonase טיפול </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> טריס-HCl </td><td> האמריקאי Bioanalytical </td><td> AB14043 </td><td> 1M, pH 8.0 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> JT בייקר </td><td> 2444-01 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase nuclease </td><td> סיגמא </td><td> E1014 </td><td> Endonuclease השתמשו כדי להסיר שאריות DNA של מטריקס </td></tr></tbody></table>

נוהל הנדסה ריאות

Procedure for Lung Engineering

רקמת הריאה, כולל סרטן ריאות ומחלות ריאה כרוניות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית, במצטבר חשבון עבור חלק 280,000 מקרי מוות בשנה, מחלת ריאות חסימתית כרונית היא כיום הגורם המוביל הרביעי של מוות בארצות הברית 1. תרומה תמותה זה היא העובדה כי הריאות אינן בדרך כלל לתקן או לחדש מעבר לרמה, מיקרוסקופיים הסלולר. לכן, רקמת הריאה כי הוא נפגע על ידי ניוון או דלקת, או רקמת הריאה היא כריתה כירורגית אינו מוחלף תפקודית in vivo. כדי לחקור האם רקמת הריאה יכול להיות שנוצר במבחנה, התייחסנו הריאות מפני חולדות הבוגרת באמצעות הליך זה מסיר רכיבים סלולריים לייצר acellular תאי ריאה מטריצה ​​הפיגום. פיגום זו שומרת על מבנים הסתעפות ההיררכי של דרכי הנשימה כלי הדם, כמו גם קרום מרתף שלם ברובו, המהווה קולגן IV, laminin ו פיברונקטין. הפיגום הוא רכוב bioreactor שנועד לחקות היבטים קריטיים של ריאה פיזיולוגיה, כגון אוורור בלחץ שלילי זלוף וסקולרית pulsatile. על ידי אפיתל culturing ריאתי האנדותל בכלי הדם בתוך הפיגום bioreactor רכוב, אנו מסוגלים לייצר רקמת הריאה כי ניתן להשוות phenotypically אל רקמת הריאה מקומיים כי הוא מסוגל להשתתף בחילופי גז מרווחי זמן קצר (45-120 דקות). תוצאות אלו מעודדות, וסבורים כי Repopulation של הריאות מטריצה ​​היא אסטרטגיה מעשית עבור התחדשות ריאות. אפשרות זו מהווה הזדמנות לא רק לפעול למען הגדלת ההיצע של רקמת הריאות להשתלה, אלא גם ללמוד התא הנשימה ביולוגיה מולקולרית במבחנה לפרקי זמן ארוכים יותר ב microenvironment מדויק יותר מאשר היה אפשרי בעבר.

פיתחנו מטריצה ​​ריאות decellularized תאיים ו bioreactor הרומן biomimetic שניתן להשתמש בהם כדי לייצר רקמת הריאה תפקודית. על ידי זריעת תאים לתוך המטריצה ​​ו culturing ב bioreactor, אנו מייצרים רקמה מדגים חילוף הגזים יעיל כאשר מושתלים in vivo לתקופות קצרות של זמן.

רקמות ריאה, כולל סרטן הריאה ומחלות ריאה כרוניות כגון מחלה ריאתית חסימה כרונית (COPD), מהוות יחד כ-280,000 מקרי מוות...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק בתרבית רקמת ריאה שדומה מבחינה מורפולוגית ופיזיולוגית לרקמת ריאה טבעית. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הוצאת הלב והריאות מחולדה בוגרת. השלב הבא הוא ביצוע קניולציה לעורק הריאתי ולשוואו (trachea), וחיבור הריאות שעברו קניולציה לביוראקטור לצורך דסלולריזציה.לאחר דקלולריזציה ושטיפה, הריאה מועברת לביוראקטור סטרילי לתרבית ומוכנה להזרעת תאים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הזרעת אוכלוסיית תאים מוכנה למדור הרצוי בריאה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי המטריצה החוץ-תאית שעברה דקלולריזציה התאוכלסה ביעילות בתאים המבטאים סממנים ריאתיים ספציפיים אזוריים, כפי שניתן לראות במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לתרבית תאי ריאה in vitro הוא שהתאים שומרים על פנוטיפים מובחנים למשך תקופה ממושכת, כך שניתן לחקור אותם במשך מספר שבועות בסובסטרט תלת-ממדי ממקור ביולוגי. לצורך דה-צלולריזציה, הריאות מחוברות למכסה הביוריאקטור באמצעות קנולה וסקולרית, והמכסה מחובר למכשור הדה-צלולריזציה. הבקבוק מזכוכית שמעל הריאות מוחזק במקומו על ידי מעמד טבעות ותפס המחוברת אליו.בשלב זה, ניתן להסיר את החומר התאי כדי להפיק פיגום של מטריצה חוץ-תאית, שניתן לאכלס מחדש בחומר תאי. הרכבת הביוראקטור לזריעה וטיפוח של רקמת ריאה מהונדסת מוצגת בדיאגרמה זו. מחבר ה-lure lock של הקנולה הקנהית מתחבר למעגל נשימה שבין מאגר הקנה לבין התא הראשי.לולאת הנשימה כוללת שני שסתומים חד-כיווניים. מיקומם מאפשר למדיום לעקוב אחר נתיבים שונים בכניסתו ובצאתו מהריאה. מאגר קטן משולב זמנית בקו הפרפוזיה לצורך זריעה של תאי אנדותל.משאבה פולסטילית משמשת להעברת תאים מהמאגר למדור הכלי הדם של הריאה. פרפוזיה של כלי הדם מתבצעת באמצעות משאבת גלילים. מצע מופנה לתוך העורק הריאתי דרך הקנולה המחוברת, זורם דרך כלי הדם של הריאה ויוצא מהוריד הריאתי ישירות לתוך הביוריאקטור הראשי, ממנו נשאב המצע לצורך הפרפוזיה.את האפיתל הריאתי ממקמים על ידי הזרקה בתוך לולאת הנשימה. התא הראשי המכיל את הריאה וממאגר הקנה משמשים לתרבית ריאה לטווח ארוך. כאשר הריאות הוצאו והעורק והקנה קנתרו בצורה נכונה, הריאות שהוצאו זה עתה צריכות להחזיק אוויר ללא דליפות.ניתן לוודא זאת על ידי ניפוחם באוויר בזמן שהם טבולים בנוזל. לא אמורות להופיע בועות המעידות על דליפות אוויר. כדי להתחיל בפרוטוקול, מנפחים את הריאות ב-PBS המכיל sodium nitropress side עד שהריאות מלאות אך לא מנופחות יתר על המידה, ולאחר מכן סוגרים מיד את הקנולה הקנה כך שהריאות יישארו מנופחות.בשלב הבא, בצעו פרפוזיה לריאות עם PBS ו-SNP למשך 15 דקות לפחות בלחץ של 15 millimeters of mercury. לאחר מכן, הסירו את הפקק מקנולת הקנה כדי לאפשר לריאות להתרוקן מאוויר. המשיכו בפרפוזיה עם PBS ו-SNP למשך 15 עד 30 דקות במידת הצורך.מלאו מחדש את ה-PBS וה-SNP כדי להבטיח שלחץ הפרפוזיה נשמר בטווח של 10 עד 15 מילימטרים של כספית. כדי להתחיל בתהליך דה-צלולריזציה ממושכת, מחברים את מכסה הביוריאקטור למערכת הדה-צלולריזציה. לאחר מכן מחברים את הריאות למכסה.באמצעות חיבורי ה-lure lock המחוברים לקנולה בצורת Y, יש לחבר את קנולת העורק הריאתי לקו הפרפוזיה ואת הקנולה הקנהית להשאיר לצוף באופן חופשי. כדי להבטיח דצלוולריזציה מלאה של הרקמה, קריטי למנוע חדירת אוויר למערכת. השסתומים החד-כיווניים בקנולה העורקית ובקנולה הקנהית מסייעים בפינוי בועות אוויר מהצינוריות על ידי מתמטרת זרימה הפוכה בצינוריות.לפיכך, יש לאפשר להוציא בועות אוויר באמצעות מזרק, ולהבטיח שכל הקווים נקיים מאוויר. התחל בפרפוזיה עם תמיסת דה-צלולריזציה. בצע פרפוזיה עם תמיסת דה-צלולריזציה.עד ש-500 milliliters של תמיסה יזרימו דרך הריאות, הלחץ האופטימלי הוא פחות מ-15 millimeters of mercury. פעולה זו תדרוש בדרך כלל 2.5 שעות. קצבי הזרימה הם בדרך כלל איטיים מאוד בתחילה, ועולים במהירות במהלך השעה השנייה לכ-one milliliter per minute או יותר.במהלך הפרפוזיה, הסר באופן תקופתי את נוזל הדסלולריזציה המשומש מהביוריאקטור, תוך הבטחה שנותרה כמות נוזל מספקת לתמיכה בריאה ובקנולה של הקנה. עם סיום הפרפוזיה בנוזל הדסלולריזציה, העבר את הריאות ואת הביוריאקטור למכבסת תרביות רקמה. כדי להתחיל את שטיפת האיבר, הסר את צנצנת ה-500 milliliter המכילה את נוזל הדסלולריזציה והחלף אותה בצנצנת סטרילית המכילה עד ליטר אחד של PBS סטרילי.השתמשו בשאיבה בוואקום או במזרק כדי לוודא שהקוים נקיים מאוויר, והזרימו PBS דרך כלי הדם בלחץ של 10 עד 15 millimeters of mercury באותו האופן. בדומה לתהליך הדה-צלולריזציה, הסִירו מעת לעת את ה-PBS המשומש מהביוראקטור באמצעות טכניקות סטריליות, והחליפו או מלאו מחדש את צנצנת ה-PBS. המשיכו בשטיפה עם PBS סטרילי וטרי עד ש-2.5 liters לפחות של PBS סטרילי יעברו בריפרוזיה דרך הריאות.שלב זה יארך בדרך כלל יומיים מתחילת תהליך הדה-צלולריזציה ועד לסיום השטיפה. העבירו את הריאות למערכת ביו-ראקטור סטרילית חדשה המכילה PBS טרי בתוספת 10%FBS ו-10%Pen strep, וודאו שגם לולאת הפרפוזיה כולה וגם כל קווי דרכי הנשימה מלאים בנוזל. מעתה ואילך, ייעשה שימוש במשאבה פולסטילית כדי לבצע פרפוזיה לריאות בקצב של 5 millimeters per minute.סטריליזציה של פיגום המטריקס החוץ-תאי של הריאה תבוצע על ידי פרפוזיה למשך לילה עם PBS המכיל 10%FBS ו-10% penicillin streptomycin. לאחר השלמת שלב זה, העבירו את הריאות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך שעה אחת או עד להשגת שיווי משקל טרמי. כהכנה לטיפול ב-Ben Nase, השלב הבא הוא טיפול של הריאות ב-Ben Nase.כדי להסיר שאריות DNA מכל ריאה, מלאו תחילה מזרק אחד של 10 milliliter בבפר Ben Nase Prewarm בלבד, ומזרק אחד של 10 milliliter ב-90 units per milliliter של Ben Nase המדולל בבפר Ben Nase. הפסיקו את הפרפוזיה של הריאות.לאחר מכן, נפחו את דרכי הנשימה באמצעות בופר Ben Nase תוך הימנעות מהזרקת אוויר אל תוך הריאה. המתינו דקה אחת עד שהריאה תתרוקן מהאוויר. לאחר מכן, נפחו את הריאה באמצעות תמיסת Ben Nase.שוב, יש להיזהר לא להחדיר אוויר לריאה לאחר הניפוח באמצעות Ben Nase. יש להניח לריאות ללא פרפוזיה או אוורור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת. בתום השעה, יש לחדש את הפרפוזיה עם ה-PBS בתוספת 10%FBS ו-10%penicillin streptomycin שכבר נמצא בביוריאקטור, ולהמשיך בפרפוזיה לאורך הלילה ועד ליום המחרת.לאחר שטיפה ועיקור, ניתן להכין את פיגום המטריצה החוץ-תאית הארוך לאוכלוסייה תאית מחודשת. החלף את תמיסת ה-P-B-S-F-B-S benzo ב-250 milliliters של מצע תרבית. בצע פרפוזיה למשך שעה אחת לפחות לפני הכנסת התאים, והחלף למצע תרבית טרי רגע לפני זריעת התאים.ניתן להשתמש במקורות תאים רבים לצורך בנייה מחדש של איברים. כאן, תודגם בנייה באמצעות אוכלוסיית תאי אפיתל. ראשית, הכין מזרק המכיל 15 milliliters של תגסוס תאים של אוכלוסיית תאי האפיתל הרצויה.בשלב הבא, מלאו את מאגר דרכי הנשימה ב-80 milliliters של תמיסת תרבית וודאו שכל קווי האוורור נקיים מאוויר. לאחר מכן, הניחו את הביוראקטור בתוך אינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וחברו את משאבת המזרק לצורך אוורור. זרקו את התאים לתוך הריאות באמצעות בולוס מהיר בחד-פעמי, על ידי הזרקת 15 milliliter של תרחיף התאים לתוך הקנולה הקנהית.יש לוודא שמסנני האוויר בביוריאקטור הראשי אטומים. לאחר מכן, יש להתחיל מיד "נשימה" איטית בודדת באמצעות משאבת מזרק כדי לשאוב 60 milliliters של אוויר מהביוריאקטור הראשי בקצב של שלושה milliliters לדקה. פעולה זו תימשך כ-20 דקות.לאחר מכן, יש להניח לריאות להישאר במצב סטטי למשך כ-18 שעות. התחל בפרפוזיה וסקולרית איטית בקצב של כ-0.5 milliliters per minute. במהלך תרבית איברים, הפרפוזיה מבוצעת בדרך כלל בקצב של one to three milliliters per minute.בשימוש במשאבה גלגלית במהלך תרבית אפיתליאלית, האוורור מסופק בדרך כלל בקצב רציף של נשימה אחת לדקה ובנפח נשימתי של 5 עד 10 milliliters. בשימוש במשאבת מזרק, אוויר נשאב ומוזרק באופן מחזורי לתוך הביוריאקטור כדי לדמות נשימה על ידי החלפה בין לחץ שלילי ללחץ אטמוספרי בתוך התא הראשי. בשל הצורך לשמור על אטימות של הביוריאקטור במהלך האוורור, יש להפסיק את האוורור מדי יום ולהחליף את האוויר בתא הראשי.בנוסף, יש להחליף את המצע בערך כל שלושה עד ארבעה ימים. במהלך התרבית, יש להחליף בערך מחצית מהנפח הכולל בכל פעם על ידי תרבית של אפיתל ריאתי ואנדותל וסקולרי. באמצעות הפיגום המותקן בביוראקטור, אנו מסוגלים לייצר רקמת ריאה המסוגלת להשתתף בחילוף גזים לפרקי זמן קצרים.צביעת המטוקסילן, אאוזין והמטוקסילן (H&amp;E) סטנדרטית של ריאת חולדה טבעית מוצגת כאן לצורך השוואה עם צביעת H&amp;E של ריאת חולדה שעברה דה-צלולריזציה. המטריצה החוץ-תאית הסופית לאחר הדה-צלולריזציה צריכה להיות נטולת חומרי תא לחלוטין ולשמור על המאפיינים המקרוסקופיים, המיקרוסקופיים והאולטרה-סטרוקטורליים של ריאה טבעית. צביעת ה-H&amp;E תאפשר ויזואליזציה של כל שארית DNA הדבקה לפיגום כתוצאה מדה-צלולריזציה או שטיפה לא מספיקים, דבר החיוני להשגת תנאים אופטימליים לזריעת תאים ולתרבית עוקבת של הריאה.הביוריאקטור אמור להניב תאים המפוזרים היטב בכל חמשת האונות של הריאה, ולספק כיסוי של כ-70% של פיגום המטריקס החוץ-תאי. תמונות אלו משוות בין ריאה טבעית לריאה שעברה אוכלוסייה מחדש כאשר הן נצבעו באימונופלואורסצנציה. עבור סממנים מרכזיים של הריאה, אוכלוסיית התאים המגודלת היא חיובית לחלבון הפרשה של תאי Clara (secretory protein C) ול-Aquaporin five.הסמנים הרלוונטיים מוצגים באדום והגרעינים שצבעו ב-DAPI מוצגים בכחול בכל הפנלים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע הליך זה, מדציליולריזציה ועד להסרה, תוך ארבעה עד חמישה ימים אם הוא מבוצע כראוי.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כריתת ריאות בעכבר היא מודל נפוץ לצמיחת ריאות מפצה. ניתן להשתמש בהליך זה בשילוב עם מעקב אחר שושלת או מודלים של עכברים טרנסגניים כדי להבהיר את המנגנונים הבסיסיים.

עכבר דגם ריאה של פיצוי ריאות צמיחה

אזור פני השטח הפנימי של הריאות (ISA) הוא קריטריון קריטי להערכת מורפולוגיה ריאות ופיזיולוגיה במחלות ריאה ו-התחדשות שנגרם על ידי פציעה. אנו מתארים כאן שיטה סטנדרטית שיכולה למזער את הטיה המדידה עבור השב"כ הן ריאות pneumonectomy ריאות מודלים השתלת עכבר פרוטה.

שיטה מתוקננת למדידת שטח הפנים של הריאות הפנימיות באמצעות דלקת ריאות של עכבר והשתלת תותב

אנו מציגים תפוקה גבוהה, בשיטת במבחנה לכימות תצהיר ריאתי אזורי ברמת האונה באמצעות CT סריקה נגזר, מודלים של ריאות מודפסות 3D עם פרופילי זרימת אוויר מתכווננת.

הערכת תצהיר ריאתי אזורי באמצעות דגמי ריאות מודפסים תלת-ממדיים ספציפיים למטופל

פרוטוקול זה מתאר מודל חזירי צעיר של השתלת ריאה שמאלית אורתוטופית המיועד לשימוש במחקר ESLP. דגש נעשה על טכניקות הרדמה וכירורגיה, כמו גם צעדים קריטיים ופתרון בעיות.

השתלה אורתוטופית ריאה שמאלית במודל חזיר צעיר עבור ESLP

מאמר זה מתאר מודל חזירי של זילוח ריאות בלחץ שלילי ex situ , כולל רכש, התקשרות וניהול בפלטפורמה בהתאמה אישית. הדגש נעשה על טכניקות הרדמה וכירורגיות, כמו גם פתרון בעיות.

אוורור לחץ שלילי נורממי זילוח ריאות Ex Situ : הערכת תפקוד הריאות וחילוף החומרים

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות בקנה מידה קטן הניתנות לשחזור, על-ידי אכלוס מחדש של פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה מדויקת עם תאי אפיתל מסוג 2, פיברובלסטים ותאי אנדותל.

רקמות ריאה מהונדסות שהוכנו מפרוסות ריאה נטולות תאים

הפרוטוקול מתאר ביוריאקטור התומך בהדמיה המאפשר הסרה סלקטיבית של האפיתל האנדוגני מקנה הנשימה של החולדה והתפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על פני השטח של לומן, ולאחר מכן תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של מבנה רקמת התא.

ביוריאקטור מונחה הדמיה ליצירת רקמת נתיב אוויר מהונדסת ביולוגית

ריאות Ex vivo שימושיות עבור מגוון ניסויים לאיסוף נתונים פיזיולוגיים תוך התעלמות מהמשתנים המבלבלים של ניסויי in vivo. הגדרות מסחריות הן לעתים קרובות יקרות ומוגבלות בסוגי הנתונים שהן יכולות לאסוף. אנו מתארים שיטה לבניית מערך מודולרי לחלוטין, הניתן להתאמה לעיצובי לימוד שונים.

תכנון ויישום של מודל זילוח ריאות Rat Ex Vivo

מאמר זה מתאר כיצד ליצור ריאות עכבר מהונדסות ביולוגית באמצעות שיטות דה-סלולריזציה ורה-סלולריזציה. הוא גם מפרט השתלת ריאות אורתוטופית לאחר מכן.

השתלת ריאות מהונדסות ביולוגית באמצעות ריאות עכבר נטולות תאים ותאי אנדותל אנושיים ראשוניים

פרוטוקול זה מתאר טכניקה משופרת להשתלת ריאה שמאלית אורתוטופית בחולדות, תוך התמקדות בהפחתת קושי תפעולי ושיפור שיעורי ההישרדות.

השתלת ריאה שמאלית אורתוטופית בחולדות

פרוטוקול זה מציג מודל זלוף ריאות ex-vivo של חולדה המשלב חשיפה חולפת למתח תרמי מכויל, ומקדם מנגנוני הגנה אנדוגניים לשיפוץ טיפולי של שתלי ריאות פגומים. הגישה ניתנת להרחבה ולשחזור ותומכת בפיתוח טיפולים לא תרופתיים לשיפור הצלחת השתלת ריאות.

התניה מוקדמת תרמית במהלך זלוף ריאות ex-vivo לשיקום שתלי ריאה פגומים לפני ההשתלה

למד שיטה להנדסת ריאות פונקציונליות באמצעות מטריצה חוץ-תאית מופרדת מתאים וביוריאקטור ביומימטי חדשני. השיטה מאפשרת חילוף גזים אפקטיבי לאחר השתלה בחי.

נוהל הנדסה ריאות

גלה סרטונים נוספים