ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

המטרה הכללית של הליך זה היא להעריך את יכולת תיקון הממברנה הן בבעל החיים והן בתאים מבודדים. סיבי שריר שלד מבודדים נאספים ומוקפים במצע המכיל את הצבע FM 1 43. לאחר מכן, נעשה שימוש בלייזר UV כדי להקרין ולפגוע בחלק מממברנת התא כדי לאפשר את כניסת הצבע לתא.

תאים מבודדים עוברים טרנספקציה עם DNA פלסמי המבטא GFP MG 53, אשר ימוקם בממברנה הפלזמית ובציטוזול של התא. לאחר מכן, קצה של מיקרו-אלקטרודה מוחדר לממברנה של C two C 12 כדי לגרום לנזק. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות טרנסלוקציה של GFP MG 53 לאתר הפגיעה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שהיא נדרשת לשליטה בטכניקות של חדירת מיקרו-אלקטורודה ובידוד סיבי שריר. את הפרוצדורה יעגילו ד"ר Lin, מנהל המעבדה שלנו, ד"ר Wazu, עמית פוסט-דוקטורט, Matt Orange, סטודנט לתואר מתקדם, וד"ר Shaza, פרופסורית למחקר במחלקתנו. לתחילת העבודה, הניחו מגש או משטח מעבדה כחול מתחת להליכה כדי לאסוף פסולת מהבעלי החיים במהלך הניסוי.

בשלב הבא, הגדירו את זווית משטח מסוע הריצה. בחלק ממסועי הריצה קיים מנגנון מובנה לכיוון השיפוע, בעוד שבמסועים אחרים יש להגביה את המסוע באמצעים אחרים. בדרך כלל נעשה שימוש במשטח שטוח או בזווית של שבע עד 15 מעלות במורד או בעלייה.

הסגילו את העכברים על ידי הנחתם על מסילת הריצה כאשר הרשת החשמלית כבויה ומנוע הנעת הרצועה פועל, אך ללא תנועה, למשך 15 דקות. לאחר תקופת ההסגילה, הפעילו את הרשת החשמלית המעודדת. התחילו את מסילת הריצה במהירות ראשונית של כחמישה מטרים לדקה. הגדילו את המהירות במטר אחד עד שניים לדקה בכל דקה, ואפשרו לבעל החיים תקופת חימום של חמש דקות.

חזור על תקופת חימום זו מדי יום במשך שלושה עד 10 ימים כדי להגביר את רמת הציות במהלך הבדיקה. כדי לבצע תרגיל תשישות אקוטי, הגבר את מהירות מסוע הריצה לאורך זמן עד להשגת מהירות מקסימלית, ועקוב אחר סימני תשישות.

בעל חיים נחשב לתשוש כאשר הוא מבלה יותר מחצי מהזמן מחוץ למסוע או חמישה שניות רצופות על הרשת. הוציאו את העכבר התשוש ורשמו את זמן הריצה הכולל. אימון סיבולת.

פרוטוקולי ריצה מתחילים באותו הליך חימום. עם זאת, המהירות המקסימלית היא בדרך כלל נמוכה יותר וזמני הריצה עשויים להיות ארוכים למדי. החזירו את העכברים לכלובים שלהם לאחר הבדיקה ונקו את מסוע הריצה ב-70% ethanol.

בודד את השכבה השטחית של שריר ה-flexor digitorum brevis מכף הרגל לצורך ניתוח נוסף. ראשית, חתוך את עור כף הרגל במקוון (median line), תוך הקפדה שלא לפגוע בשריר שמתחתיו. לאחר מכן, בצע חתכים אופקיים והסר את העור.

זהו את הגיד הלבן והשטוח של שריר ה-FDB המחובר לעצם העקב (calcaneus). השתמשו בפינצטה כדי להפריד ולאחר מכן לחתוך את הגיד בקרבת אתר ההיצמדות. משכו את הגיד למעלה בעדינות תוך כדי חיתוך של כל רקמה חיבורית.

אתר את המקום שבו הגידים הדיסטליים מתפצלים לאצבעות הבודדות. חתוך את הגידים בנקודת חיבורם לשכבת השריר העמוקה יותר והסר את ה-FDB. העבר את צרור שריר ה-FDB לתוך מיליליטר אחד של תמיסת קולגנאז שחוממה מראש ל-37 °C.

הדביקו את המבחנה באופן אופקי על שייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37 °C ונערערו במהירות של 200 RPM למשך 65 דקות. עיכול מספיק יזוהה על ידי מראה פריך וצבע חיוור. גזרו את קצהו של טיפ פיפט של 1 mL כדי לאפשר למקבץ המעוכל לעבור דרכו.

העבירו בקלות את הצרור לשפופרת צנטריפוגה המכילה כ-600 microliters של 2.5. Calcium tyro. הפכו בעדינות את השפופרת כדי לנער את הסיבים המשוחררים מהצרור.

בשלב הבא, גזרו את קצהו של טיפ פ pipette של 30 µL כך שהקוטר יהיה קטן רק במעט מאלומה השרירית. השתמשו בטיפ זה כדי לשאוב את האלומה לתוך הפיפט ואז דחפו אותה חזרה אל תוך התמיסה. חזרו על תהליך זה עד שמרבית הסיבים יופרדו מהאלומה.

ערבבו את הסיבים המופרדים על ידי סיבוב עדין של המבחנה. הסירו את הכמות הרצויה והניחו אותה על מנתה עם תחתית זכוכית מסוג delta T. שמרו את הסיבים שנותרו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך כשש שעות לשימוש ובדיקות נוספות.

השאירו את הצלחת ללא הפרעה למשך חמש דקות. פעולה זו מאפשרת לסיבים להיקשר לתחתית הזכוכית של הצלחת. הניחו את הצלחת בעלת תחתית הזכוכית על מיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בלייזר UV.

בחן את הסיבים תחת מיקרוסקופ פאזה בהגדלה הגדולה מ-100x כדי לוודא נוכחות של תבנית פסיים נורמלית ומבנה של מוט ישר. הוסף צבעי styro perineum מסוג FM 1 43 או FM 4 64 לתמיסה עד לריכוז סופי של 2.5 micromolar. כוון את הסיב בזווית של 45 מעלות מהפינה השמאלית העליונה של שדה הראייה לפינה הימנית התחתונה כדי לגרום לנזק.

הקרינו שטח של חמישה על חמישה פיקסלים של ממבנה הפלזמה. באמצעות לייזר UV המוגדר להספק מרבי למשך חמש שניות, על האזור המוקרן לפצל את ממבנה הפלזמה כך שחלק מחמשת על חמשת הריבוע יהיה בתוך הסיב והיתרה תהיה מחוץ לסיב; צלמו תמונות של חדירת הצבע אל הסיב במרווחי זמן של חמש שניות כל פעם למשך עד חמש דקות. ניתן להקרין רק שלושה סיבים למנה, שכן הצבע הפלואורסצנטי יעבור בסופו של דבר אנדוציטוזה אל תוך הסיב ויסבך כל ניתוח נתונים.

לאחר שימוש בשלושה סיבים, יש להכין צלחת חדשה. באמצעות תוכנת ניתוח, חשבו את השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה בשטח של כ-200 square microns לצורך השוואה בין הסיבים. עבור כל פריים, יש לבצע את החישוב הבא: delta F חלקי F zero, כאשר F zero הוא ממוצע הפלואורסצנציה של אזור העניין (region of interest) בפריים הראשון שנלכד, ו-delta F הוא השינוי בפלואורסצנציה בכל פריים עוקב.

השתמשו בשיטות סטנדרטיות כדי להוביל לתאים DNA פלסמידי המבטא GFP MG 53. לאחר מכן, הכינו את המיקרו-פיפטים. מקמו קפילרית Pyrex על מיקרו-פיפט.

ביצוע מתיחה ומשיכה על ידי תוכנית מוגדרת מראש. חבר את המיקרו-פיפט למניפולטור מיקרוסקופי תלת-צירי בתרבית. את המדיה מסירים מכלי ה-delta T ומחליפים בבופר calcium tyro בריכוז 2.5 millimolar.

הנח את הצלחת המכילה תאים שעברו טרנספקציה על מיקרוסקופ קונפוקאלי סורק בלייזר עם עדשת שיקוע בשמן של 40 x 1.3 NA. 유נח נזק חד (acute) לתאים חיים על ידי החדרת המיקרו-פיפטה לממברנת התא ולאחר מכן נסיגה מהירה של המיקרו-פיפטה מהתא. אסוף תמונות עוקבות של תאים חיים במרווח של 1.54 שניות לכל פריים עבור הפרעת הממברנה המושרה על ידי טרופונין.

בצעו PERFU של 0.005% troponin בקצב של כמיליליטר אחד לדקה ישירות מעל התא המצולם. ניתן להשתמש בהליכון כדי למדוד ירידה ביכולת הריצה. לעכברי ה-MG 53 knockout המוצגים כאן יש יכולת ריצה מופחתת עקב נזק לשריר השלד.

היקף הנזק הנגרם על ידי לייזר UV תלוי ביכולת תיקון הממברנה של הסיב הנצפה. כאן מוצג סיב לפני פגיעה בעכבר נורמלי. תמונה זו צולמה 200 שניות מאוחר יותר ומראה פגיעה קלה.

סיב שריר המופק מעכברי knockout של MG 53, בעלי יכולת פגועה לתיקון ממברנה, יראה כניסת צבע משמעותית יותר לאחר פגיעה. להלן דוגמה לשפופרת שריר (myotube) מסוג C2C12 שעברה טרנספקציה של GFP MG 53 ואינה פגועה. החץ בתמונה זו מצביע על וסיקולות המכילות GFP MG 53 הנעות לעבר אתרי הפגיעה.

בדוגמה זו, נעשה שימוש בספונין כדי לפגוע בממברנת הפלזמה. שימו לב לתעתוע של GFP MG 53 מהציטוזול לממברנת התא לאחר הפגיעה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבודד סיבי שריר איכותיים עם ממברנות סרקופלזמיות חלקות ותבניות פסיים ברורות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תבואו לידי הבנה טובה של האופן שבו מעריכים את יכולת תיקון הממברנה של שריר ואת תרביות התאים.