Name: ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: חקור מנגנוני תיקון קרום תא מודרכי MG53 בסיבי שריר שלד מבודדים ובתאים תרבתיים. השיטה משתמשת בלייזר UV ובמיקרואלקטרודות להדמיית שיקום הפלזמה לקידום מחקר ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הליכון ריצה עבור חשיפת היקף לפגיעה בשרירים במודלים של עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבעו את הזווית של פני הליכון לשימוש במהלך פרוטוקול הריצה. באופן כללי, ברמה שטוחה או זווית בין 7 ° ו 15 DEGREES ° בירידה או בעלייה משמש. הליכונים יש במנגנון נפרד כדי להתאים את שיפוע בעוד שאחרים דורשים הליכון להיות גבוהות באמצעים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על מגש או משטח המעבדה כחול מתחת ההליכון לפני שהכניס את בעלי החיים ההליכון לאסוף כל פסולת בעלי החיים במהלך פרוטוקול הריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני עכברים ריצה צריך להיות acclimated לסביבה של ההליכון. זו כוללת הצבת חיות הליכון למשך 15 דקות עם רשת החשמל לסירוגין את המנוע כונן חגורה על חגורה אבל לא נעים (כלומר עם מהירות להגדיר 0 m / s). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל לרשת החשמל מוטיבציה. עוצמת ותדירות הפולסים משמש בדרך כלל ניתן לשלוט על הליכונים אלא משתנה מיצרן אחד למשנהו. בדרך כלל, העוצמה המקסימלית אינו נדרש להניע העכברים לרוץ זמן בתדירות גבוהה (לפחות פעם אחת כל שתי שניות) יהיה לשפר את התאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את החגורה הליכון להתחיל את הפרוטוקול פועל. המהירות ההתחלתית של כ 5 מטר / דקה אמור לשמש במשך תקופה חימום עבור העכברים. המהירות של ההליכון יכול להיות מואץ באיטיות, בדרך כלל על ידי הוספת 1-2 מטר / דקה עבור כל דקה לאחר תחילתו של ההליכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היענות של בעלי חיים ברוב הפרוטוקולים ניתן לשפר על ידי ביצוע סדרה של ריצות קצרות (5 דקות) במהירות לחמם במשך 3 עד 10 ימים לפני הריצה הניסוי מתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרגיל תשישות חריפה בדרך כלל כרוך להגדיל את המהירות של ההליכון עם הזמן עד למהירות המרבית (בדרך כלל &lt;30 מ '/ מ') מושגת ומתוחזק עד העכברים להראות סימני תשישות. קריטריונים לשיפוט תשישות להשתנות, אך בדרך כלל כוללים עכבר לבלות יותר ממחצית הזמן על רשת החשמל או 5 שניות רצופות על רשת החשמל מבלי לחזור אל פני השטח הליכון. לאחר עכבר הפרט הוא מותש אותו ניתן להסיר ההליכון ואת הזמן הכולל של ריצה ניתן להקליט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי הזווית של ההליכון יכול לשמש בניסויים ריצה חריפה להגדיל את עומס התרגיל (עם זווית בעלייה), או לגרום להתכווצויות אקסצנטרי נזק (עם זווית ירידה) כי לקרוע את הקרומים sarcolemmal של סיבי שריר 1. אוונס כחול צבע יהיה ניתן להזריק לתוך החיות לפני נהלים כאלה לשימוש לצבוע היסטולוגית לזהות סיבי השריר שניזוקו 2,3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אימון סיבולת ריצה פרוטוקולים לספק עומס תרגיל החיה על פני תקופה ממושכת (עד חודשים) על מנת לייצר עיצוב מחדש של השריר או מערכת הלב וכלי הדם. חימום הליך זהה לעיל (שלב 1.5) אולם את המהירות המרבית היא בדרך כלל נמוכה יותר פעמים לרוץ יכול להיות ארוך למדי (&gt; 1 שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת ריצה העכברים ניתן להחזיר את הכלובים. הליכונים בדרך כלל להיות מלוכלך למדי ואילו העכברים פועלות, בעיקר על פרוטוקולים ארוך. יש צורך לנקות את ההליכון, בדרך כלל עם תרסיס אתנול 70%, לאחר כל שימוש. </li></ol> 2. Assay Ex Vivo של קיבולת ממברנה תיקון של סיבי שריר מבודדים בעקבות-UV לייזר נזק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את השכבה השטחית של השריר digitorum מכופף (FDB) brevis מרגל העכבר. ראשית, לחתוך את עור לפתוח את היחידה על קו החציון תוך הקפדה לא לפגוע בשרירים מתחת, ולאחר מכן לבצע חתכים אופקיים להסיר את העור. הגיד הלבן השטוח של שריר FDB (בגיד הפרוקסימלי) ניתן לראות מחוברת עצם calcaneus. בבוטות להפריד את גיד ידי מלקחיים לנתק את גיד קרוב לאתר של הקובץ המצורף, לתפוס את הגיד בחינם על ידי מלקחיים ומושכים אותו בעדינות כדי להפריד את FDB מן הרקמות הסובבות תוך צמצום כל רקמות החיבור שנותרו מחוברים. כאשר אדם רואה סניף גידים דיסטלי של ספרות הפרט FDB ניתן להסיר על ידי חיתוך שבו הגידים האלה להתחבר בשכבה עמוקה יותר של השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את צרור שריר FDB ב 1 מ"ל של תמיסת collagenase מראש לחמם 37 מעלות צלזיוס צינור 1.5 Eppendorf מ"ל, קלטת את הצינורית אוריינטציה אופקית 37 ° C מסלולית שייקר ולנער בסל"ד 200 דקות 65. הטיימס של דגירה יכול להיות מותאם על מנת להבטיח עיכול מספיק, אשר מסומן על ידי מראה בלוי צבע חיוור של השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר את צרור FDB מעוכל לתוך צינור 1.5 צנטריפוגה μl המכיל ~ 600 μl של Tyrode 2.5 + Ca 2 באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל עם סיום חתך בעל קוטר מספיק כדי לאפשר את צרור מתעכל בקלות לעבור ללא הפרעה. בעדינות להעיף את הצינור כדי לנער את סיבי משוחרר מן הצרור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור טיפ 30 פיפטה μL כך דiameter רק במעט יותר מאשר צרור השריר (בין 15-20 מיקרומטר קוטר) השתמש pipettor כדי למשוך בעדינות את הצרור אל פיפטה ואז לדחוף אותו בחזרה לתוך התמיסה.. חזור על תהליך זה עד רוב הסיבים הם משויך מן הצרור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי סיבים משויך בעדינות מפנה את הצינור, לקחת סכום הרצוי ושחרר על צלחת זכוכית התחתונה דלתא טי. נפח לטעון תשתנה בהתאם יעילות הבידוד ומספר סיבי שימושי כי יש צורך בצלחת עבור פרוטוקול מסוים. הסיבים הנותרים ניתן לאחסן את הצינור על 4 מעלות צלזיוס למשך כ 6 שעות מחקרים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר את המנה לשבת באין מפריע במשך 5 דקות. זה מאפשר הסיבים לדבוק תחתית הזכוכית של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת זכוכית על תחתית מיקרוסקופיה confocal מצויד לייזר UV. שים לב סיבים תחת מיקרוסקופ שלב בהגדלה&gt; 100x כדי לבדוק נוכחות של דפוס striation נורמלי מוט ישר, כמו הצורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף FM1-43-64 או FM4 צבעים styrylpyridinium 4 הפתרון לריכוז סופי של 2.5 מיקרומטר 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגרום נזק למצב סיבים אותו בחלון הדמיה כך הסיב מכוונת בזווית 45 ° מן בפינה השמאלית העליונה של שדה הראייה בצד ימין למטה (איור 1). מקרינים שטח 5x5 פיקסלים (כ 0.9μmx0.9μm) של קרום הפלזמה באמצעות לייזר UV (80 mW או יותר, 351/364 ננומטר) מוגדר כוח מרבי למשך 5 שניות. האזור מוקרן צריך לפצל את הממברנה הפלסמטית, כלומר, מחצית תיבת 5x5 צריך להיות בתוך הסיב, והשאר צריך להיות מחוץ סיבים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות של כניסה לתוך צבע הסיב במרווחים של 5 שניות כל אחד לתקופה של עד 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.8 עבור לא יותר מ 3 סיבים לכל מאכל, כמו צבע פלואורסצנטי תהיה בסופו של דבר endocytosed לתוך סיב ו לסבך כל ניתוח הנתונים. לאחר 3 סיבי מאכל חדש צריך להיות מוכן משלב 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים על ידי חישוב השינוי בעוצמת הקרינה (ΔF / F 0) בין כל מסגרת שנתפסו כדי למדוד את כמות כניסת לצבוע. זה דורש למדוד את הקרינה בשטח ממוצע של כ 200 מיקרומטר 2 באמצעות תוכנת ניתוח כגון ImageJ זמין בפומבי (http://rsbweb.nih.gov/ij/). לשם השוואה בין הסיבים, החישוב הבא צריך להיעשות עבור כל מסגרת: ΔF / F 0, 0 כאשר F הוא אומר הקרינה באזור של עניין במסגרת כבש ראשון (t = 0; לפני הפציעה), וכן הוא ΔF השינוי הקרינה של כל מסגרת הבאים (FF 0). </li></ol> 3. חיים הדמיה תא Confocal כדי לפקח על תהליך דינמי של תיקון קרום התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipettes נעשו פיירקס נימים. נימי הושם על חולץ micropipette ומשך לפי תוכנית שנקבעה מראש (חום = 695; משוך = 50; לוול ךיב .= 55; זמן = 250). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipette צורפה micromanipulator 3 ציר (xyz). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם transfected עם פלסמיד דנ"א באמצעות שיטות נורמלי על צלחת זכוכית התחתונה דלתא טי. התקשורת צריכה להיות עברה 2.5mm Ca 2 + חיץ Tyrode לפני ניסויים להתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות זכוכית המכיל תאים transfected הונחו על לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal עם 40X אובייקטיבי שמן 1.3NA טבילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נזק חמור לחיות תאים בוצעה על ידי הוספת micropipette לתוך קרום התא, ואז מהר לחזור micropipette מחוץ לתא 3,6. ברציפות תמונות תא חי התקבלו בהפרש של 1.54 s / מסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay שיבוש saponin המושרה קרום, saponin 0.005% (Sigma) ב 2.5mm Ca 2 + חיץ Tyrode היה perfused ידי מערכת אישית התאספו הכבידה זרימה זלוף 7. שיעור זלוף הוא כ 1 / ml דקות ועל קצה זלוף צריך להיות ממוקם ישירות מעל התא להיות הדמיה. </li></ol> 4. נציג תוצאות: הסרט מייצג של ריצה על הליכון העכבר יכול להתבצע במהלך הצילומים. הסרט יהיה להדגים את היכולת לרוץ מופחת של mg53-/ - בעכברים עקב פגיעה בשריר השלד. היקף הנזק שנגרם על ידי פרוטוקול-UV לייזר הנזק כמפורט לעיל תלוי ביכולת לתקן קרום של סיבים ניתחו. יכולת זו מושפעת גנוטיפ של העכבר שממנו סיב בודד, בתנאים תאיים, וכל שינויים בביטוי החלבונים (transfection או זיהום). סיבים נורמלי סוג בר יאפשר קלה עד בינונית כניסה צבען (איור 2 א). סיבי שריר נגזר mg53-/ - עכברים עם יכולת להתפשר תיקון קרום יציג כניסה משמעותית יותר של צבע לתוך הסיב (איור 2b). תוצאות אופייניות של טרנסלוקציה פציעה להראות microelectrode של MG53 המכילים vesicles לאתר פציעה. איור 3 א ו 3 ב מראים GFP-MG53 transfected C2C12 myotubes נפגע על ידי החדרת micropipette לתוך קרום התא. בתא לפני נזק micropipette, GFP-MG53 ממוקם על הממברנה פלזמה וגם בציטופלסמה 3. בעקבות החדירה micropipette, GFP-MG53 שלפוחית ​​המכילה נעו לעבר אתרי נזק (כפי שצוין על ידי ראש חץ). איור 3c מראה GFP-MG53 transfected C2C12 myoblasts שטופלו של 0.005% saponin, חומר ניקוי שיכולים permeabilize הממברנה הפלסמטית. לאחר טיפול saponin, GFP-MG53 translocated מ cytosol אל קרום התא. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> Weisleder, et al. באיור 1. סיבים יישור האזור הגדרה פציעה. אוריינטציה תקין של סיבי שריר מבודדים בתוך שדה הראייה ואת ההגדרה של האזור הראו פגיעה. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> Weisleder, et al. איור 2. נזק לייזר UV של FDB. תמונות סיבים להראות סיבים לפני הפציעה (0 שניות, משמאל) על פגיעה פוסט 200 שניות (מימין). סיבים מן העכבר סוג בר (א) להראות פציעה קלה. סיבים מעכברים עם תיקון הממברנה נפגעת (ב) לאפשר לצבוע יותר להיכנס. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> Weisleder, et al. איור 3. Microelectrode ו saponin נזק תאים בתרבית. תמונות להראות C2C12 myotubes (a, b) ו myoblast C2C12 (ג) לפני הפציעה (לעיל) פגיעה פוסט (התחתון). תאים עם פצועים microelectrode (א, ב) להראות MG53 טרנסלוקציה לאתרים פציעה (חיצים). תאים שטופלו saponin (ג) להראות MG53 טרנסלוקציה על קרום התא.

<ol><li>Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eccentric+exercise-induced+injury+to+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).</li>
<li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo+marker+of+myofibre+damage%3A+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li>
<li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li>
<li>Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+secretory+membrane+with+FM1-43+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+repair+defects+in+muscular+dystrophy+are+linked+to+altered+interaction+between+MG53%2C+caveolin-3%2C+and+dysferlin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin.</a> J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardioprotection+of+ischemia%2Freperfusion+injury+by+cholesterol-dependent+MG53-mediated+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair.</a> Circ Res. 107, 76-83 (2010).</li>
<li>Knab, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+of+exercise+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Repeatability of exercise behaviors in mice.</a> Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).</li>
<li>Massett, M. P., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+differences+in+responses+to+exercise+training+in+inbred+and+hybrid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).</li>
<li>Bansal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ריצה הליכון היא מתודולוגיה שימושי על מתן עומס התרגיל של בעלי חיים שטופלו. כפי מתודולוגיה עבור מדידת תפקוד השרירים או יכולת סיבולת היא גישה רועש לשמצה שקשה לבצע באופן עקבי לשחזור 8. באופן כללי, פעמים כדי תשישות יכולה לשמש נקודת הסיום כדי לפתור הבדלים משמעותיים בין קבוצות הניסוי, כגון אלה בין כמה קווי עכבר נוקאאוט ועכברים סוג בר 9. מניפולציות ניסויית המייצרים הבדל דק יותר, כגון כמה ניסויים התרופות, לא יכול לפתור חילוקי מעל הרעש הקשורות טכניקה זו. על מנת למקסם את reproducibility ורגישות של טכניקות אלה חשוב לשמור על תנאים מושב למושב מאוד הדוק. הזמן של היום חיות ימומשו, כמו גם תקופת התנאים להתחמם בשימוש, הם גורמים חשובים וצריכים להישאר עקבי ממשפט למשפט. השפעת מתח יכול להיות השפעה משמעותית על עיצוב של פרוטוקולים הליכון כמו זנים מסוימים של עכברים יכול לרוץ הרבה יותר זמן על ההליכון מאשר זנים אחרים מגיבים באופן שונה תרגיל סיבולת 10. כקו מנחה כללי, עכברים רבים יוכלו לרוץ 200-300 מטר הכולל במחקר תשישות עם עלייה מתמדת במהירות של ההליכון (5 מ &#39;/ מ&#39; מהירות ראשוני עם 1 מ &#39;/ מ&#39; מוסף עבור כל דקה אחרי ההתחלה). עבור תרגיל סיבולת העכברים ניתן לרוץ בין 9-12 מ &#39;/ מ&#39; במשך 30 דקות 2 או 3 פעמים בשבוע. עם זאת, מחקרים בודדים בדרך כלל דורשים אופטימיזציה של פרוטוקול כדי להתאים לצרכים ניסיוניים בודדים. ההליך-UV לייזר נזק הוכח להיות שיטה יעילה למדידת תיקון קרום קיבולת של סיבי שריר השלד 3,6,11. אחת מרכיב חיוני להצלחת ניסויים אלה היא להשתמש בסיבי השריר היחיד להציג מראה ישר, בצורת מוט עם דפוס קבוע של פסי ו sarcolemma חלק שאינו מופיע מקומט. אם סיבי השריר אחרים נבחרו נזק הקרום עשוי להיות כבר נוכח אלה סיבים הפרשנות של תוצאות ניסויים אלה עשוי להיות מסובך. חשוב גם כי הכיוון של הסיבים ואת ההגדרה של האזור מוקרן להיות מוגדרת כ באיור 1. זה מספק פגיעה בגודל לשחזור, ובכך מאפשר השוואה בין הסיבים. אם האזור מוגדר של פגיעה נמצא לחלוטין בתוך הסיב, פגיעה פנימית תיווצר במקום לשבש את sarcolemma. בנוסף, ערך מחושב עבור ΔF / F 0 רגיש מאוד באזור של עניין שנבחרו מדידת הקרינה מתכוון. שטח של כ 200μm 2, סמוך ובכלל במקום הפציעה, הוא המתאים. בניגוד לאזור שהוגדר עבור פציעה, אזור זה צריך לשקר לחלוטין בתוך הסיב. אם תכלול שטח מחוץ סיבים, שטח ריק וכתוצאה מכך יגדל ΔF / F 0 בסיבים עם כניסה לצבוע מעט תוך הפחתת ΔF / F 0 בסיבים עם פנוטיפ חמור יותר. זה מקטין את הרגישות של assay, ובכך השוואה בין סיבי קשה יותר. עבור assay את הנזק micropipette, את הזווית בין micropipette והתחתון צלחת זכוכית צריך להיות כ 45 מעלות על מנת ביעילות נזק של קרום התא. התאים נבחרו נזק micropipette יש לצרף בחוזקה אל החלק התחתון של התבשיל תאים מעוגלים לא אמור לשמש מאז סביר להניח שהם תנתק לאחר micropipette תוקעת. Permeabilzation ניסויים Saponin פחות תובענית מבחינה טכנית יחסית מהר לבצע לעומת micropipette מבחני חדירה. עם זאת, ישנן מספר מגבלות לנזק saponin, ובכלל זה רק תא אחד יכול לשמש לכל צלחת מאז saponin יהיה מפוזר נזק לתאים אחרים בכלי זה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> מכרסמים הליכון </td><td> קולומבוס מכשירים Exer 3 / 6 או שווה ערך </td><td></td></tr><tr><td> 70% אתנול </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Dissection כלים כולל מלקחיים טיפ יפה, המספריים אביב </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td></td></tr><tr><td> 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase סוג אני </td><td> סיגמא </td><td></td></tr><tr><td> 0 Ca 2 + Tyrode חיץ (140 mM NaCl, KCl 5 mM, HEPES 10 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ MgCl 2, pH 7.2, 290 mosm) </td><td> סיגמא </td><td></td></tr><tr><td> 2.5mm Ca 2 + Tyrode חיץ (140 mM NaCl, 2.5 מ&quot;מ CaCl 2, 5 מ&quot;מ KCl, HEPES 10 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ MgCl 2, pH 7.2, 290 mosm) </td><td> סיגמא </td><td></td></tr><tr><td> טמפרטורה לשליטה מסלולית שייקר </td><td> ניו ברונסוויק או שווה ערך </td><td></td></tr><tr><td> דלתא תבשיל TPG </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> LSM 510 מיקרוסקופ confocal עם לייזר 80 mW Enterprise UV או מיקרוסקופ confocal המקבילה </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43-64 או FM4 צבעים </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> בורוסיליקט נימים גודל 0.8-1.0 X 100 מ&quot;מ </td><td> פיירקס </td><td> חלק מס &#39;9530-2 </td></tr><tr><td> Micropipette חולץ </td><td> סאטר מכשירים </td><td> דגם P-97 </td></tr><tr><td> 3 ציר micromanipulator </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> 2100 Radiance סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal מיקרוסקופ או שווה ערך </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Saponin </td><td> סיגמא </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של תיקון mg53 בתיווך קרום התא באמצעות in vivo ו במבחנה מערכות

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

תיקון של פגיעה חריפה על קרום התא היא תהליך יסודי של הפיזיולוגיה הסלולר נורמלי, פגום לתיקון קרום נקשר הרבה מחלות אנושיות ניווניות. התגלית האחרונה של MG53 כמרכיב עיקרי של המנגנון פותחת הממברנה מאפשרת הבנה טובה יותר של מולקולרי הביולוגיה הבסיסית של תיקון רקמות, כמו גם עבור יישומים translational פוטנציאליים רפואה רגנרטיבית. כאן אנו בפירוט את פרוטוקולי הניסוי לבחינת תפקוד vivo של MG53 במצב של פציעה בשריר תוך שימוש בפרוטוקולים תרגיל הליכון על מודלים העכבר, לבדיקת vivo לשעבר קרום יכולת לתקן על ידי מדידת ערך צבע לתוך סיבי שריר מבודדים, לניטור תהליך דינמי סחר MG53 בתיווך שלפוחית ​​ואת קרום התא לתקן תאים בתרבית באמצעות מיקרוסקופ תא חי confocal.

שתוארו כאן הם השתמשו בפרוטוקולים כדי להמחיש את התהליך הדינמי של תיקון MG53 בתיווך קרום התא בבעלי חיים שלם ברמה התאית. שיטות אלה ניתן ליישם כדי לחקור את הביולוגיה של התא פותחת הממברנה הפלסמטית ורפואה רגנרטיבית.

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

תיקון של פגיעה חריפה בממברנת התא הוא תהליך בסיסי של פיזיולוגיה תאית תקינה, ותיקון פגום של הממברנה נקשר לרבים מ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את יכולת תיקון הממברנה הן בבעל החיים והן בתאים מבודדים. סיבי שריר שלד מבודדים נאספים ומוקפים במצע המכיל צבע FM 1 43. לאחר מכן נעשה שימוש בלייזר UV כדי להקרין ולפגוע בחלק מממברנת התא כדי לאפשר חדירה של הצבע אל התא.תאים מבודדים עוברים טרנספקציה עם פלסמיד DNA המבטא GFP MG 53, אשר ימוקם בממברנה הפלסמטית ובציטוזול של התא. לאחר מכן, קצה של מיקרו-אלקטרודה מוחדר לממברנת C two C 12 כדי לגרום לנזק. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות טרנסלוקציה של GFP MG 53 לאתר הפגיעה.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן נדרש תרגול כדי לשלוט בטכניקות של חדירת מיקרו-אלקטרודה ובידוד סיבי שריר. את הפרוצדורה ידגימו ד"ר Lin, מנהל המעבדה שלנו, ד"ר Wazu, פוסט-דוקטורנט Matt Orange, סטודנט לתואר מתקדם, וד"ר Shaza, מרצה בכירה למחקר במחלקה שלנו. כדי להתחיל, הניחו מגש או משטח מעבדה כחול מתחת להליכה כדי לאסוף פסולת מהבעלי החיים במהלך הניסוי.בשלב הבא, הגדירו את זווית משטח מסוע הריצה. בחלק ממסועי הריצה קיים מנגנון מובנה לכיוון השיפוע, בעוד שבמסועים אחרים יש להגביה את המסוע באמצעים אחרים. בדרך כלל נעשה שימוש במשטח שטוח או בזווית שבין 7 ל-15 מעלות במורד או בעלייה.הסגילו את העכברים על ידי הנחתם על המסוע כאשר רשת החשמל כבויה ומנוע הנעת הרצועה פועל, אך ללא תנועה, למשך 15 דקות. לאחר תקופת ההסגילה, הפעילו את רשת החשמל המוטיבציונית. התחילו את פעולת המסוע במהירות ראשונית של כחמישה מטרים לדקה. הגבירו את המהירות במטר אחד עד שניים לדקה בכל דקה, ואפשרו לבעל החיים תקופת חימום של חמש דקות.חזור על תקופת חימום זו מדי יום במשך 3 עד 10 ימים כדי להגביר את רמת הציות במהלך הבדיקה. לביצוע תרגיל תשימה אקוטי, הגבר את מהירות מסוע הריצה לאורך זמן עד להגעה למהירות מקסימלית, ועקוב אחר סימני תשישות.בעל חיים נחשב לתשוש כאשר הוא מבלה יותר ממחצית מהזמן מחוץ להליכון או חמישה שניות רצופות על הסבכה. הוצא את העכבר התשוש ורשום את סך זמן הריצה. אימון סיבולת.פרוטוקולי ריצה מתחילים באותו הליך חימום. עם זאת, המהירות המקסימלית היא בדרך כלל נמוכה יותר וזמני הריצה עשויים להיות ארוכים למדי. החזירו את העכברים לכלוב הבית לאחר הבדיקה ונקו את מסע הריצה ב-70% ethanol.בודד את השכבה השטחית של שריר ה-flexor digitorum brevis מכף הרגל לצורך ניתוח נוסף. ראשית, חתוך את עור כף הרגל בקו האמצע, תוך הקפדה לא לפגוע בשריר שמתחתיו. לאחר מכן, בצע חתכים אופקיים והסר את העור.זהו את הגיד הלבן והשטוח של שריר ה-FDB המחובר לעצם העקב (calcaneus). השתמשו בפינצטה כדי להפריד ולאחר מכן לחתוך את הגיד בקרבת נקודת ההיצמדות. משכו את הגיד למעלה בעדינות תוך חיתוך של כל רקמה חיבורית.אתרו את המיקום שבו הגידים הדיסטליים מתפצלים לאצבעות הבודדות. חתכו את הגידים בנקודת חיבורם לשכבת השריר העמוקה יותר והסירו את ה-FDB. העבירו את צרור שריר ה-FDB לתוך 1 mL של תמיסת קולגנאז שחוממה מראש ל-37 °C.הדבק את המבחנה באופן אופקי על שייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37 °C ונער במהירות של 200 RPM למשך 65 דקות. עיכול מספיק יבוא לידי ביטוי במראה מפוזר ובצבע חיוור. גזור את קצהו של טיפ פפטה של 1 mL כדי לאפשר למקבץ המעוקל לעבור דרכו.העבירו בקלות את הצרור לתוך מבחנה לצנטריפוגה המכילה כ-600 µL של 2.5. Calcium tyro. הפכו את המבחנה בעדינות כדי לנער את הסיבים המשוחררים מהצרור.בשלב הבא, גזרו את קצהו של טיפ פיפט של 30 µL כך שהקוטר יהיה רק מעט קטן יותר מא束 השריר. השתמשו בטיפ זה כדי לשאוב את צרור השריר לתוך הפיפט ולאחר מכן דחפו אותו חזרה אל תוך התמיסה. חזרו על תהליך זה עד שמרבית הסיבים יופרדו מהצרור.ערבב את הסיבים המופרדים על ידי סיבוב עדין של המבחנה. הוצא את הכמות הרצויה והטלה אותה על צלחת delta T בעלת תחתית זכוכית. אחסן את הסיבים הנותרים בטמפרטורה של 4 °C למשך כשישה שעות לשימוש ובדיקות נוספות.השאירו את הצלחת ללא הפרעה למשך חמש דקות. פעולה זו מאפשרת לסיבים להיצמד לתחתית הזכוכית של הצלחת. הניחו את הצלחת בעלת תחתית הזכוכית על מיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בלייזר UV.בחן את הסיבים תחת מיקרוסקופ פאזה בהגדלה של יותר מ-100 x כדי לוודא קיומו של דפוס פסיים תקין ומבנה דמוי מוט ישר. הוסף לתמיסה צבעי styro perineum מסוג FM 1 43 או FM 4 64 עד לריכוז סופי של 2.5 micromolar. כוון את הסיב בזווית של 45 מעלות מהפינה השמאלית העליונה של שדה הראייה לפינה הימנית התחתונה כדי לגרום לנזק.הקרינו שטח של חמישה על חמישה פיקסלים של ממבנה הפלזמה. באמצעות לייזר UV המכוון לעוצמה מקסימלית למשך חמש שניות, האזור המוקרן צריך לפצל את ממבנה הפלזמה כך שחצי מהריבוע של חמישה על חמישה יהיה בתוך הסיב והחלק הנותר יהיה מחוץ לסיב; צלמו תמונות של כניסת הצבע לסיב במרווחים של חמש שניות לכל דגימה למשך עד חמש דקות. ניתן להקרין שלושה סיבים בלבד לכל צלחית, שכן הצבע הפלואורסצנטי יעבור בסופו של דבר אנדוציטוזה לתוך הסיב ויסבך את ניתוח הנתונים.לאחר שימוש בשלושה סיבים, יש להכין צלחת חדשה. באמצעות תוכנת ניתוח, חשב את השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה בשטח של כ-200 מיקרון רבוע להשוואה בין הסיבים. עבור כל פריים יש לבצע את החישוב הבא: delta F חלקי F zero, כאשר F zero הוא ממוצע הפלואורסצנציה של אזור העניין (region of interest) בפריים הראשון שנתפס, ו-delta F הוא השינוי בפלואורסצנציה בכל פריים עוקב.השתמשו בשיטות סטנדרטיות לטרנספקציית תאים עם DNA פלסמידי המבטא GFP MG 53. לאחר מכן, הכינו את המיקרו-פיפטות. הניחו קפילרה של Pyrex על מיקרו-פיפטה.ביצוע מתיחה (pull) לפי תוכנית שהוגדרה מראש. הצמדת המיקרו-פיפט למניפולטור מיקרוסקופי תלת-צירי בתרבית. המדיה מוסרת מכלי ה-delta T ומוחלפת בבופר calcium tyro בריכוז 2.5 millimolar.הניחו את הצלחת המכילה תאים שעברו טרנספקציה תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר, המצויד בעדשת שמן 40x 1.3 NA. גרמו לנזק חריף לתא חי על ידי החדרת המיקרו-פיפט לתוך ממברנת התא ולאחר מכן נסוגו במהירות עם המיקרו-פיפט מחוץ לתא. אספו סדרת תמונות של התא החי במרווח של 1.54 שניות לכל פריים עבור הפרעת הממברנה המושרה על ידי טרופונין.בצעו PERFU של 0.005% troponin בקצב של כמיליליטר אחד לדקה ישירות מעל התא המצולם. ניתן להשתמש בהמסוע למדידת ירידה ביכולת הריצה. לעכברי ה-MG 53 knockout המוצגים כאן יש יכולת ריצה מופחתת עקב נזק לשריר השלד.היקף הנזק הנגרם על ידי לייזר ה-UV תלוי ביכולת תיקון הממברנה של הסיב הנצפה. כאן מוצג סיב לפני פגיעה בעכבר רגיל. תמונה זו צולמה 200 שניות מאוחר יותר ומראה פגיעה קלה.סיב שריר המופק מעכברי knockout של MG 53, עם יכולת פגועה לתיקון ממברנה, יראה חדירה משמעותית יותר של צבע לאחר הפציעה. הנה דוגמה לשפופרת שריר (myotube) מסוג C2C12 שעברה טרנספקציה של GFP MG 53 ואינה פגועה. החץ בתמונה זו מצביע על שלפוחיות המכילות GFP MG 53 הנעות לעבר אתרי הפגיעה.בדוגמה זו, נעשה שימוש בספונין כדי לפגוע בממברנת הפלזמה. שימו לב לתעתוע (translocation) של GFP MG 53 מהציטוזול לממברנת התא לאחר הפגיעה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבודד סיבי שריר איכותיים בעלי ממברנות סרקופלזמיות חלקות ודפוסי פסיים ברורים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את יכולת תיקון הממברנה של שריר ואת תרביות התאים.

visualization-mg53-mediated-cell-membrane-repair-using-vivo-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול מפורט מתואר הדמיה בזמן אמת היווצרות של קומפלקסים לתקן...

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

סרטון זה מדגים בדיקה לחקר יעילות האיטום מחדש של קרום הפלזמה בתאי יונקים. התאים נחשפים לרעלן חיידקי היוצר נקבוביות, היוצר נקבוביות בקרום התא. בנוכחות יוני סידן חוץ-תאיים, הנקבובית גורמת לזרימת סידן, וגורמת לאירועים של איטום מחדש של הממברנה. יעילות האיטום מחדש מוערכת באמצעות צבע פרופידיום יודיד קושר DNA, אשר נכנס רק לתאים ללא קרום אטום מחדש.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות חוץ גופית למדידת יעילות האיטום מחדש של קרום הפלזמה

הדמיה חיה של תאים שנחשפו לצבע lipophilic FM1-43 מאפשרת קביעה מדויקת של קינטיקה שבו רעלים יוצרים נקבוביות יוסרו מקרום הפלזמה. זה assay רגיש שיכול לשמש כדי להעריך את הדרישות לCa 2 +, sphingomyelinase וגורמים אחרים על תיקון קרום פלזמה.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

התהליך של ריפוי תאים נפצעו כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעת קרום תא. פרוטוקול זה מתאר מבחני כדי לפקח על תהליכים אלה.

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

קרום התא ופצעו באמצעות לייזר שני הפוטונים שיטה הנפוצה להערכת יכולת חתימה מחדש קרום, שניתן להחיל על סוגי תאים מרובים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה לחיות-הדמיה של קרום חתימת בתאי החולה dysferlinopathy בעקבות אבלציה לייזר שני הפוטונים.

Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

כאן נתאר של תפוקה גבוהה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית assay המודד קרום פלזמה חתימת יעילה באמצעות ניתוחים fluorometric, הדמיה בתאים חיים. Assay הזה יכול לשמש לסינון סמים או היעד גנים המווסתים קרום פלזמה חתימת בתאי יונקים.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

שיטת הניקור התרמופלסמוני משלבת מיקרוסקופ קונפוקלי, פינצטה אופטית וננו-חלקיקי זהב כדי לחקור תגובות חלבונים במהלך תיקון קרום פלזמה בתאים ובועיות חד-למלריות ענקיות. הטכניקה מאפשרת ניקוב מהיר ומקומי של הממברנה, ומאפשרת זיהוי חלבוני מפתח ותפקידם הפונקציונלי במנגנון המורכב לתיקון קרום הפלזמה.

גישה תרמופלסמונית לחקר תיקון קרום פלזמה בתאים חיים וקרומי מודל

פרוטוקול זה מתאר מנגנון לשימוש במיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה כדי להמחיש את האינטראקציה של מיטוכונדריה וליזוזומים המסומנים ב-mEosEM ו-APEX2, בהתאמה.

מיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה דו-צבעונית להדמיית אינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים

חקור מנגנוני תיקון קרום תא מודרכי MG53 בסיבי שריר שלד מבודדים ובתאים תרבתיים. השיטה משתמשת בלייזר UV ובמיקרואלקטרודות להדמיית שיקום הפלזמה לקידום מחקר ברפואה רגנרטיבית.

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

גלה סרטונים נוספים