חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

שיטה חסכונית למעקב אחר מקורות מיקרוביאלים באמצעות וירוסים ספציפיים של בני אדם ובעלי חיים. המחקר מתאר שיטה חסכונית לזיהוי מקור זיהום שתן צואתי או זיהום על ידי חנקות במים באמצעות PCR כמותי לכימות ספציפי של נגיפי חזיר, בקר, DNA, אדנו-וירוסים ופוליומה אנושיים המוצעים ככלי מעקב אחר מקורות מיקרוביאליים. פיתחנו פרוטוקול לריכוז נגיפים מדגימות מים של 10 ליטר על ידי פלוקולציה אורגנית באמצעות מיצוי חלב דל שומן של חומצות גרעין נגיפיות מהמשקעים וכימות נגיפי DNI של בקר או חזיר אנושי באמצעות PCR כמותי.

ידוע היטב כי זיהום מיקרוביאלי של הוויטמין מהווה סיכון בריאותי משמעותי ועלינו לדעת את מקורות הזיהום. הצענו שימוש בנגיפי DNA נפוצים מאוד ככלי מעקב אחר מקורות מיקרוביאליים. הנגיפים שנבחרו הם אדנו-וירוסים ופוליומה-וירוסים.

הנגיפים האלה מופרשים בהתמדה לאורך כל השנה ובכל האזורים הגיאוגרפיים. למד במחקרים קודמים. פיתחנו שיטות ריכוז חזקות בעלות נמוכה לנגיפים במים, ועבדנו על פיתוח מבחני QPCR לכימות אדנו-וירוסים של פורין ונגיפי פוליומה של בקר.

בנוסף, אנו משתמשים באדנו-וירוסים אנושיים, NGC Polyomavirus, שנבדקו על ידי QPCR, גם כסמנים לזיהום אנושי במים, איסוף דגימות מים. במחקר זה, ארבעה שכפולים של 10 ליטר לדגימת מים נאספים במיכלי פלסטיק עם תחתית שטוחה ודגימה נוספת אחת כבקרת תהליך. דגימה אחרונה זו תיזרע עם כמות ידועה של חלקיקי הנגיף המשמשים כבקרה.

בקרה שלילית מוכנה במעבדה על ידי שימוש במי ברז במצב במיכל פלסטיק נוסף של 10 ליטר. אם הדגימה מציגה כמות גבוהה של חומר מרחף, חול וחומרים אחרים, הניחו לה לשקוע למשך 15 דקות, העבירו את המים למיכל חדש. ריכוז ויראלי על ידי פלוקולציה אורגנית.

זיהוי וירוסים בדגימות מים מזוהמות נמוכות או בינוניות דורש ריכוז הנגיפים מכמה ליטרים של מים לפחות לנפח קטן בהרבה. הליך הריכוז כולל החמצה של דגימות מים של 10 ליטר, פלוקולציה באמצעות כוח משיכה של חלב דל שומן, שקיעת הלהקות ואיסוף המשקעים ב-10 מיליליטר של מאגר פוספט כדי להתחיל בתהליך, מכינים תמיסה של איתור חלב רזה במי ים מלאכותיים על ידי המסת 10 גרם אבקת חלב רזה בליטר אחד של מי ים מלאכותיים והתאמת ה-pH בזהירות ל-3.5. עם חומצה הידרוכלורית, הצאן צריך להיות גלוי.

הכן את התמיסה רגע לפני השימוש או אחסן בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. מערבבים את דגימות המים ונמדדת המוליכות בדגימות. אם הוא נמוך מ -1.5 מיליסימנס, יתווספו מלחי ים.

התאם את ה-pH של דגימת המים ל-3.5 על ידי תוספת של חומצה הידרוכלורית. רשום את ה- pH של הדגימות לפני ואחרי ההתנייה, כמו גם את נפח החומצה ההידרוכלורית המשמשת. יש לתעד גם את המוליכות.

לאחר התאמת ה-pH, אנו מוסיפים 100 מיליליטר של חלב דל שומן, 1% לדגימת המים של 10 ליטר, ומערבבים את הדגימות במשך שמונה עד 10 שעות כדי לאפשר לנגיפים להיספג ללהקות. עבור דגימת הספייק המשמשת כבקרת תהליכים, הוסף את הנפח הסטנדרטי של נגיף הבקרה, מיליליטר אחד, למשל, לדגימה. הפסיקו את הערבוב ותנו ללהקה למשקעים בכוח הכבידה למשך שמונה עד 10 שעות.

לאחר 16 שעות, בדרך כלל למחרת, נוכל לאסוף את המשקעים. לשם כך, הסר את הסופרנטנט באמצעות משאבה פריסטלטית. אוספים את המשקעים עם הלהקות, כ -500 מיליליטר לבקבוק צנטריפוגה.

מאזנים את הסירים על ידי תוספת של חלב רזה pH 3.5, צנטריפוגה את הסירים עם צנטריפוגה במהירות גבוהה, 8,000 גרם 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ברגע שהצנטריפוגה נעצרת, הסר את סירי הצנטריפוגה בזהירות מהצנטריפוגה. יוצקים בעדינות רבה וזורקים את הסופרנטנט.

ממיסים את הגלולה בכל בקבוק צנטריפוגה לנפח סופי של 10 מיליליטר פוספט, מיצוי חומצות גרעין וכימות וירוסים. התרכיז הנגיפי משמש למיצוי חומצות גרעין נגיפיות ונגיפי האדנווירוסים והפוליומה הספציפיים המעניינים יכומתו על ידי A-Q-P-C-R. בצע מיצוי חומצת גרעין עם ערכת המיני RNA הנגיפי של מגבר המפתח.

הליזיס של הנגיפים הקיימים ב -140. מיקרוליטרים של תרכיזים נגיפיים מבוצעים באופן ידני, וסך חומצות הגרעין מופקות ל -80 מיקרוליטר. ערכה זו מאפשרת שימוש בפלטפורמה אוטומטית כגון Key Cube.

השלב הבא הוא כימות הגנום הנגיפי. ניתן לכמת עותקים בדגימות באמצעות PCR כמותי עם בדיקות tac man, אדנו-וירוסים אנושיים, נגיפי JC Polyoma ונגיפי פוליומה בקר באותה צלחת 96 בארות. מכיוון שכולם משתמשים באותם מחזורי הגברה, יש לבדוק אדנו-וירוסים חזיריים בנפרד בצלחת עצמאית לכימות נגיף המטרה.

הכן את תערובת ה- PCR הכמותית באזור נפרד ונקי. לאחר הכנת התערובת, הקצו 15 מיקרוליטר לכל באר, כולל הבקרות. הוסף את מיצוי חומצות הגרעין מהדגימות 10 מיקרוליטר באזור נפרד, הפעל ישירות ודילול פי עשרה במים מטוהרים של כל דגימה בשכפול הנפח הכולל לתגובה אחת לאחר הוספת המטרה יהיה 25 מיקרוליטר, 15 של תערובת ועוד 10 של דגימה או כיסוי סטנדרטי של הבארות המכילות את הדגימות עם חלק מכיסוי דבק.

שמור את החלק השני של הכיסוי לשלב הבא. דילול AB של תרחיפי תקן ה-DNA. 10 מיקרוליטר מ-10 לאפס ל-10 עד שישה עותקי גנום, העמידו פנים של מיקרוליטר על ידי טריפליקט ושימוש במיקרו pbit המשמש אך ורק לכיסוי ה-DNA הסטנדרטי.

הבארות המכילות את התקנים עם כיסוי הדבק נחתך בעבר. איור זה מציג את התפלגות דגימות המתלים והבקרות הסטנדרטיות. בצלחת 96 הבאר.

בצע את ה-QPCR למערכת נאותה, ובחר את הפרמטרים המתאימים לאחר הפעלת משרעת הזהב למשך 10 דקות. בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס מבוצעים 40 מחזורי הגברה לאחר השלמת התגובות. אחסן נתונים ותוצאות כמתואר במדריך למשתמש של הציוד המשמש.

כמות ה-DNA תוגדר כחציון הנתונים המתקבלים לאחר תיקון גורם הדילול בעת הצורך. תרשים ההגברה והעקומה הסטנדרטית שהתקבלו לכימות אדנו-וירוסים חזיריים הראו מקדם מתאם של 0.999. ערכי שיפוע מקובלים נעים בין מינוס 3.1 למינוס 3.6 בעקבות ההליך.

נגיפים אנושיים ובעלי חיים שתוארו נבדקו בדגימות מי תהום מאזור המציג רמות גבוהות של חנקות כדי להגדיר את מקורות הזיהום. ארבעת השכפולים שנותחו הראו תוצאות חיוביות עבור הערך הממוצע של אדנו-וירוסים חזיריים, 7.74 לכל 10 עד שני עותקי גנום לליטר, מה שיהיה קשור לנוכחות של תמיסות חזיר באזור המקיף את אתר הדגימה, ויוכיח נוכחות של זיהום צואה חזירית במי התהום. לא היה זיהום אנושי באף אחת מהדגימות שנבדקו.

הנתונים הווירולוגיים אושרו על ידי ניתוח PCR וריצוף מקונן. מסקנה. במחקר זה, הצגנו תוצאות המנתחות דגימות מי תהום, המציגות זיהום ממקור חזירי בהיעדר זיהום בבני אדם או בקר. הנוהל יושם גם על ניתוח מי רחצה, מי ים ומי נהרות.

אנו מציגים כאן את הנוהל ליישום כלים אלה לזיהוי מקור הזיהום במי תהום, ומציגים רמות גבוהות של חנקות כדוגמה ליישום השיטות שפותחו לאיתור מקור הזיהום בסביבה.