Name: חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: למד שיטה חסכונית למעקב אחר מקורות זיהום מיקרוביאלי במים באמצעות PCR כמותי לזיהוי וירוסי DNA ספציפיים מאדם, חזיר ופרה. השיטה מאפשרת זיהוי מקורות זיהום צואתי ושיפור ניטור איכות המים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הממשלה הספרדית &quot;Ministerio de Educación y Ciencia&quot; (פרויקט AGL2008-05275-C01/ALI), על ידי האיחוד האירופי למחקר Framework 7 פרויקטים במימון VIROBATHE (חוזה מס &#39;513648), VIROCLIME (חוזה מס&#39; 243923 ) ועל ידי הסוכנות קטלאנית של מים, Agència Catalana de l&#39;Aigua (ACA), Departament דה קונטרול אני Millora dels Ecosistemes Aquatics. במהלך המחקר פיתחו מרתה Rusiñol היה בחור של ממשלת קטלאנית &quot;AGAUR&quot; (FI-DGR).

1. ריכוז של חלקיקים נגיפיים נוכח דגימות מים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף ומיזוג של דגימות מים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מינימום של 2 משכפל של L 10 לדגימה במכלי פלסטיק עם תחתית שטוחה דגימה אחת נוספת כמו בקרת תהליך. מדגם זה האחרון יהיה ממוסמר עם כמות ידועה של חלקיקים נגיפיים לשמש מלאה. הערה: מומלץ יש חומר מיוחד נפרד (בקבוקים, צינור וכו ') עבור דגימות ממוסמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקת כיול של conductimeter ו לכייל מחדש במידת הצורך. הכן בקרה שלילית על ידי שימוש במי ברז מותאם בעבר מוליכות מספיק (ראה להלן 1.6) באחד מיכל פלסטיק תוספת 10 L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות ממוסמר: הוסף נפח סטנדרטי של הנגיף השליטה (כ -10 5 עותקים בגנום לכל 10 ליטר מים) המדגם. מערבבים מתיזים על ידי ערבוב הימנעות ו אירוסולים. שולטת חיובי יכול להכיל בזן נדיר של adenovirus such כמו HAdV-35 או bacteriophage כגון MS2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המדגם מציג כמות גבוהה של חומר מושעה (חול או חומרים אחרים), תן לו משקעים במשך 15 דקות. מעבירים את המים לתוך מיכל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ה-pH של המדגם מים 3.5 (± 0.1) על ידי תוספת של 1 N HCl. שלב זה חשוב לצורך ריכוז של וירוסים, כדי לוודא את רמת החומציות הותאם כראוי. מערבבים את המים באופן יסודי על ידי בחישה נמרצת תוך הוספת HCl. (הערה: אם רמת ה-pH נמוך מ 3.5 להוסיף 1 M NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המוליכות. אם המדגם יש המוליכות של 1500 μS / ס"מ ומעלה, שלב זה אינו נחוץ. אם מוליכות נמוכה מ 1500 μS / cm היווצרות חומר flocculated (flocs) אינו מובטח כך להתאים את מוליכות אל μS 1500 / cm על ידי תוספת של מלחי ים מלאכותי (Sigma). מערבבים נמרצות על ידי ערבוב תוך הוספת מלחי הים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא ה-pH של דגימות לפני ואחרי מיזוג כמו גםs נפח HCl בשימוש. מוליכות צריך גם להיות מוקלט לאחר התאמת ה-pH. תמיד לחטא את ה-pH-מטר conductimeter האלקטרודות בתמיסת HCl טריים, טיהרת עם פתרון של 10% tiosulphate נתרן ולבסוף לשטוף עם מים מזוקקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חלב מראש flocculated רזה 1% (PSM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את כיול מכשירי pH meter לבין conductimeter ו לכייל מחדש במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מראש flocculated פתרון חלב דל שומן (1% PSM, w / v) על ידי המסת 10 גרם אבקת חלב דל שומן (Difco) ב 1 ליטר מי ים מלאכותי (להמיס 33.3 גרם של מלחי ים מלאכותי L 1 של מי ברז החיטוי dechlorinated ו) ו בקפידה כדי להתאים את ה-pH 3.5 עם HCl 1N. Flocs צריך להיות גלוי. הכן את הפתרון ממש לפני לשמש או לאחסן ב 4 ° C למשך 24 ח עבור dechlorination להשתמש 1 מ"ל של תמיסת tiosulphate 10% 100 מ"ל מים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתתה של חלקיקים נגיפיים נוכח דגימות מים<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ"ל של PSM 1% ל מדגם 10-L המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את דגימות עבור 8-10 שעות, כדי לאפשר וירוסים כדי לספוג את flocs. השתמש טיימר כיבוי כדי בחישה לאחר 8-10 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את ערבוב ולתת משקעים flocs על ידי כוח הכבידה של 8-10 ח </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מחדש המסת flocs. צנטריפוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant באמצעות משאבה peristaltic ו פיפטה פלסטיק מחוברת צינורית פלסטיק. לקבלת דוגמיות ממוסמר supernatant צריך להיות נאסף לתוך בקבוק וחיטוי פי נהלים פנימיים. בכל המקרים לא לדאוג לאסוף את גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף משקעים עם flocs (כ 500 מ"ל) לתוך בקבוק צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאזן את הסירים על ידי תוספת של 3.5 pH PSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הסירים בצנטריפוגה במהירות גבוהה ב XG 8000 למשך 30 דקות ב 4 ° C. ברגע צנטריפוגות מפסיק, להסיר בזהירות את הסירים צנטריפוגה מ בצנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוד gently לשפוך וישאירו supernatant. עקבו האמצעים המתאימים לחומר זיהומיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7 מ"ל של חיץ פוספט לפרק את גלולה בבקבוק כל צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר flocs כבר מומס, למדוד ולהוסיף למאגר פוספט להגיע בנפח כולל של 10 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize להתרכז ויראלי ידי vortexing ולהפיץ את 10 מ"ל לתוך microtubes נקי שאמור להיות קפוא ב -80 ° C עד צורך בניתוח נוסף. </li></ol></li></ol> 2. חומצות גרעין ממוצא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מיצוי חומצות גרעין עם ערכת QIAamp נגיפי RNA מיני הבאים הוראות היצרן. ערכה זו מאפשרת את השימוש של פלטפורמת אוטומטי (כגון Qiacube, Qiagen). </li></ol> 3. PCR כמותי של adenoviruses האנושי (HAdV), polyomaviruses JC (JCPyV), adenoviruses חזירי (PAdV) ו polyomaviruses שור (BPyV) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות של עותקים בגנום בדגימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכיןתמהיל qPCR באזור נפרד נקי באמצעות TaqMan הסביבה PCR מיקס מאסטר 2x (Applied Biosystems). התגובה מתרחשת צלחת תגובה 96-אופטי היטב מכוסה מכסה דבק אופטי. ריכוזים של מיקס מאסטר, primers ואת בדיקות מתוארים בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לערבב הוכן, 15μl aliquot לתוך זה גם כולל את הפקדים (ראה 3.2). הנפח הכולל של תגובה אחת אחרי תוספת של היעד יהיה 25μl (לערבב 15μl + מדגם 10μl או רגילה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את גרעין חומצה עקירות מן דגימות (10μl) באזור נפרד. הפעלה ישירה דילול של פי עשרה בתוך מים מטוהרים מדגם כל כפולים. מכסים את הבארות המכיל את הדגימות עם חלק לכסות דבק, לשמור את החלק השני של השער לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף דילולים של תקן ה-DNA השעיות (10μl) מ GC/10μl 0-10 6 10 על ידי בשלושה עותקים ושימוש micropipette בשימוש בלעדי של סטןגודארד DNA. מומלץ להוסיף תקנים באזור מצויד קרינת UV להשמדת DNA פלסמיד ולנקות את micropipette לאחר כל שימוש. מכסים את הבארות המכיל את הסטנדרטים עם כיסוי מראש לחתוך את הדבק. הערה: כדי להכין השעיות תקן לשמש כימות של עותקים בגנום, באזור ה-DNA היעד צריך להיות משובטים לתוך פלסמיד ו - לינארית. בשנת לכתובת הבאה תמצאו נוהל מפורט על איך ליצור עקומות רגיל עם תבניות DNA פלסמיד לשמש qPCR: <a href="http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf">http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את qPCR למערכת נאותה בחירת הפרמטרים המתאימים (בהתחשב בשימוש לכסות דבק ואת הנפח הכולל של כל טוב, וכו '). הפעלה בעקבות הזהב AmpliTaq עבור 10 דקות בשעה 95 ° C, 40 מחזורים של הגברה מבוצעות כדלקמן: 15 זה על 95 מעלות צלזיוסו 1 דקות ב 60 ° C עבור HAdV, JCPyV ו BPyV, ו 15 שניות על 95 ° C, ה -20 בשעה 55 ° C ו -20 ב 60 ° C עבור PAdV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התגובות הושלמו, נתונים לאחסן תוצאות כמתואר במדריך למשתמש של הציוד שבשימוש. כמות ה-DNA יוגדר החציון של נתונים המתקבלים לאחר תיקון גורם לדילול בעת הצורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקרות חיוביות ושליליות. Assay חייב לכלול אחד או יותר שאינם תבנית שליטה (NTC) כדי להוכיח את תערובת אינו מייצר פלואורסצנטי. מומלץ להפעיל את בקרת תהליך חיובי על מנת להעריך את פוטנציאל עיכוב אנזימטי בשל מעכבי נוכח דגימות למד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא בתוצאות של מבחני qPCR שני דילולים שונים של ה-DNA רגיל מן לשלוט על התהליך. השתמש בתוצאות כדי להכין תרשימי בקרה על בקרת איכות (QC) תוכניות הקשורות הרגישות והיעילות של מבחני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישורתוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות חיוביות ניתן אישור נוסף באמצעות רצף מקוננות-PCR ו נוקלאוטיד של amplicons, הפקת נתונים נוספים על רצפי נוקליאוטידים של זנים זיהה 1,5,6,7,9,12. </li></ol></li></ol> בעקבות ההליך המתואר, וירוסים אדם ובעלי חיים שזוהו לכמת במימי ים, ים ומים הנהר 2,3. כדוגמה מייצגת, מי התהום דגימות מאזורים להציג רמות גבוהות של חנקות הוערכו על מנת להגדיר את מקורות הזיהום. עשרה ליטר מים דגימות נאספו 4 בארות שונים באזורים כפריים של אזור בצפון מזרח ספרד. חמש משכפל נאספו לשכפל כל אחד לשלומו seeded עם adenovirus האדם 2 משמש שליטה בתהליך. דוגמאות עובדו על פי פרוטוקול מיוצג באיור 1. ארבעת משכפל ניתח אחד מארבעת האתרים למד הראו תוצאות חיוביות עבור PAdV (ממוצע ערך 7.72 4x10 GC / L) אשר יהיה קשור לנוכחות של slurries חזיר באזורים הסובבים את האתר הדגימה יתמכו זיהום צואתי חזירי כמקור של חנקות במי התהום (טבלה 2). 4. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2820/2820fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. נוהל איתור וכימות של וירוסים במים. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table1.jpg" alt="טבלה 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="טבלה 1"> טבלה 1. ריכוז primers ו בדיקות עבור מבחני qPCR. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table3.jpg" alt="טבלה 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="לוח 3"> טבלה 2. איתור וכימות של adenoviruses החיה האנושית polyomaviruses בדגימות מי התהום. מספר n של משכפל ניתח אחוז% מכלל חיובי משכפל (-) לא מזוהה

<ol><li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li>
<li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li>
<li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li>
<li>de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li>
<li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li>
<li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li>
<li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Z.+Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li>
</ol>

שתי בקשות פטנט שהוגשו בשנת 2009 כדי להגן על הקניין הרוחני של פרוטוקולים כימות PAdV ו BPyV.

<html> ההליך המתואר היו מקיימים את התנאים של שיטה מתאים שגרתי במעבדות בריאות הסביבה והציבור: לשחזור, אמינה, פשוטה וחסכונית. פרוטוקול היא פשוטה, אך היא חייבת להיות מלווה בזהירות. מוליכות נמוכה בדגימות מבלי להוסיף את הריכוז המבוקש של מלחי ים מלאכותי יהיה להפחית באופן דרמטי את ההתאוששות של וירוסים גם יהיה המקרה אם הזמן ערבוב הפתתה מצטמצם משמעותית (פחות מ 5 שעות, למשל). מיושם כיום כלים MST מתבססים בדרך כלל על שיטות מו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> צנטריפוגות מהירות גבוהה (8000 XG) </td><td> Berckman קולטר </td><td> אוואנטי J-20XP </td><td></td></tr><tr><td> ה-pH מטר, מדחום conductimeter </td><td> Afora </td><td> LPPC3003 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות פלסטיק 100-200 ס&quot;מ אורך </td><td> Deltalab </td><td> 350059 </td><td></td></tr><tr><td> סטרילי סיים pipettes הפנויה </td><td> Labclinics </td><td> PN10E1 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות פלסטיק סטרילית של 1.5 מ&quot;ל ו - 10-15 (Eppendorf, פלקונס, וכו &#39;) </td><td> Afora </td><td> KA298/00 </td><td></td></tr><tr><td> צנטריפוגה סירים (500 מ&quot;ל) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> SE5753512 </td><td></td></tr><tr><td> Stirrers מגנטיים מגנטים (אחד לכלהמדגם) </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 10510 </td><td></td></tr><tr><td> מיכלי זכוכית או פלסטיק בעל תחתית שטוחה כדי לאפשר את השימוש stirrers מגנטי </td><td> Deltalab </td><td> 191642 </td><td></td></tr><tr><td> משאבה peristaltic להסרת supernatant (או משאבת מים סילון ואקום) </td><td> ווטסון, מרלו </td><td> 323E / D </td><td></td></tr><tr><td> טיימר כיבוי כדי בחישה לאחר 8-10 שעות </td><td> Deltalab </td><td> 900400 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה הידרוכלורית (1N ו 0.1N) </td><td> Panreac </td><td> 141020.1611 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד (1N) </td><td> Panreac </td><td> 131687.1211 </td><td></td></tr><tr><td> מלאכותית ים מי ים ומלחים </td><td> סיגמא </td><td> S9883 </td><td></td></tr><tr><td> חלב נטול שומן (SM) </td><td> Difco </td><td> 232100 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט חיץ pH 7, 5 </td><td></td><td></td><td> 01:02 v / v סטרילית של Na 2 HPO 4 0,2 M ו לאא 2 PO 4 0,2 M ב-pH 7.5 </td></tr><tr><td> Thiosulphate </td><td> Panreac </td><td> 121879.1209 </td><td> הפוך את פתרון 10% מים </td></tr><tr><td> QIAamp נגיפי RNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 52904 </td><td></td></tr><tr><td> 96, גם התגובה בצלחת אופטי (500 יחידות) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 43426659 </td><td></td></tr><tr><td> מכסה דבק אופטי (100 יחידות) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan הסביבה PCR מיקס מאסטר 2x </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr></tbody></table>

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

זיהום מיקרוביאלית של הסביבה מהווה סיכון בריאותי משמעותי. קלאסי אינדיקטורים צואתי חיידקי הראו שיש מגבלות משמעותיות, וירוסים הם עמידים יותר בפני תהליכי איון הרבה אינדיקטורים צואה רגילה לא להודיע ​​על מקור הזיהום. פיתוח חסכונית שיטות ריכוז של וירוסים ממים מבחני מולקולרית מקלה את הישימות של וירוסים כאינדיקטורים לזיהום צואתי ו חיידקים כמו מעקב אחר המקור (MST) כלים. Adenoviruses ו polyomaviruses הם נגיפי DNA מדביק בעלי החוליות כולל בני אדם ספציפיים, ומופרשים בצואה בהתמדה ו / או שתן בכל האזורים הגיאוגרפיים למד. במחקרים קודמים, הצענו כימות adenoviruses האנושי (HAdV) ו polyomaviruses JC (JCPyV) על ידי ה-PCR כמותי (qPCR) כאינדקס של זיהום צואתי אנושי. לאחרונה, פיתחנו מבחני qPCR עבור כימות מסוים של porcine adenoviruses (PAdV) ו polyomaviruses שור (BPyV) כסמנים של זיהום צואתי חיה עם רגישויות של עותקים בגנום 1-10 לכל מבחנה. במחקר זה, אנו מציגים את והנוהל לזהות את מקור הזיהום בדגימות מים באמצעות כלים אלה. כדוגמה נציג של תוצאות, ניתוח של וירוסים במים הקרקע הצגת רמות גבוהות של חנקות מוצג. איתור של וירוסים במים מזוהמים נמוך או בינוני דורש ריכוז של וירוסים מ לפחות כמה ליטרים של מים לתוך נפח קטן בהרבה, הליך שבדרך כלל כולל שני שלבים ריכוז בסדרה. זו פרוצדורה מסורבלת במקצת ואת השתנות נצפתה החלמה ויראלי משמעותי בסל עיבוד בו זמני של מספר גדול של דגימות המים. על מנת למנוע את צוואר הבקבוק נגרמת על ידי שני שלבים נהלים יישמנו פרוטוקול צעד אחד שפותח studie הקודםs ו החלים על מגוון של מטריצות מים. ההליך כולל: החמצה של עשרה ליטר דגימות מים, הפתתה על ידי חלב דל שומן, שקיעה הכובד של חומרי flocculated, אוסף של המשקע ו צנטריפוגה, resuspension של המשקע במאגר פוספט 10 מ&quot;ל. להתרכז ויראלי משמש להפקת חומצות גרעין ויראליות ואת adenoviruses ספציפיים polyomaviruses של הריבית על ידי לכמת qPCR. מספר גבוה של דגימות עשוי להיות מנותח בו זמנית בשיטה זו עלות נמוכה ריכוז. הנוהל הוחל על ניתוח של מי ים, מי ים ומים הנהר במחקר זה, אנו מציגים תוצאות ניתוח דגימות מי התהום. שיטה זו תפוקה גבוהה כמותי אמין, פשוט, וחסכוני.

המחקר מתאר שיטה חסכונית לזיהוי מקור הזיהום צואה / שתן או זיהום חנקות במים באמצעות כימות qPCR עבור הספציפי של נגיפי DNA, adenoviruses אדם / חזירי / שור ו polyomaviruses, כפי שהוצע כלים MST.

זיהום מיקרוביאלי של הסביבה מהווה סיכון בריאותי משמעותי. נמצא כי למדדי צואה בקטריאליים קלאסיים יש...

שיטה יעילה כלכלית למעקב אחר מקורים מיקרוביאליים באמצעות וירוסים ספציפיים של בני אדם ובעלי חיים. המחקר מתאר שיטה יעילה כלכלית לזיהוי מקור זיהום צואתי, זיהום שתן או זיהום על ידי חנקות במים, תוך שימוש ב-quantitative PCR לכימות ספציפי של DNA viruses, adenoviruses ו-polyomaviruses של בני אדם, חזירים ובקר, המוצעים ככלים למעקב אחר מקורים מיקרוביאליים. פיתחנו פרוטוקול לריכוז וירוסים מדגימות מים של 10 liter באמצעות פלוקולציה אורגנית, מיצוי חומצות גרעין וירוסליות מהמשקעים באמצעות חלב דל שומן וכימות של DNA viruses של בני אדם, בקר או חזירים באמצעות quantitative PCR.ידוע כי זיהום מיקרוביאלי של הוויטמין מהווה סיכון בריאותי משמעותי, ועלינו להכיר את מקורות הזיהום. הצענו להשתמש בנגיפי DNA נפוצים מאוד ככלים למעקב אחר מקור מיקרוביאלי. הנגיפים שנבחרו הם אדנווירוסים ופוליומאווירוסים.וירוסים אלו מופרשים באופן עקבי לאורך כל השנה ובכל האזורים הגאוגרפיים, כפי שנחקר במחקרים קודמים. פיתחנו שיטות ריכוז חסכוניות ויעילות לווירוסים במים, ועבדנו על פיתוח בדיקות QPCR לכימות של purine adenoviruses ו-bovine polyomaviruses.בנוסף, אנו משתמשים באדנו-וירוסים אנושיים וב-NGC Polyomaviruses, שנבדקו באמצעות QPCR, גם הם כסמנים לזיהום אנושי במים, איסוף דגימות מים. במחקר זה, נאספות ארבע חזרות של 10 liter לכל דגימת מים בתוך מכלים מפלסטיק בעלי תחתית שטוחה, ודגימה אחת נוספת כבקרת תהליך. דגימה אחרונה זו תזוהם בכמות ידועה של חלקיקי וירוס המשמשים כביקורת.ביקורת שלילית מוכנה במעבדה באמצעות שימוש במי ברז תקינים במיכל פלסטיק נוסף בנפח 10 ליטר. אם הדגימה מכילה כמות גבוהה של חומרים רחופים, חול וחומרים אחרים, יש להמתין 15 דקות לשקיעתם ולהעביר את המים למיכל חדש. ריכוז ויראלי באמצעות פלוקולציה אורגנית.גילוי נגיפים בדגימות מים עם זיהום נמוך או בינוני דורש ריכוז של הנגיפים מכמה ליטרים לפחות של מים לנפח קטן בהרבה. הליך הריכוז כולל החמשה של דגימות מים בנפח של 10 ליטר, פלוקולציה באמצעות חלב רזה, שקיעה בגלל כוח הכבידה של הפלוקים ואיסוף המשקע ב-10 מיליליטר של בופר פוספט. כדי להתחיל את התהליך, מכינים תמיסה של חלב רזה במי מים מלוחים מלאכותיים על ידי המסה של 10 גרם אבקת חלב רזה בליטר אחד של מי מים מלוחים מלאכותיים וכיוון מדויק של ה-pH ל-3.5 באמצעות חומצה כלורית; הפלוקים צריכים להיות גלויים לעין.הכינו את התמיסה רגע לפני השימוש או שמרו אותה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ערבבו את דגימות המים ומדדו את המוליכות בדגימות. אם היא נמוכה מ-1.5 millisiemens, יש להוסיף מלחים ימיים.התאימו את ה-pH של דגימת המים ל-3.5 על ידי הוספה של חומצה כלורית. רשמו את ה-pH של הדגימות לפני ואחרי ההתנייה, וכן את נפח החומצה הכלורית שנעשה בו שימוש. יש לרשום גם את המוליכות.לאחר כיוון ה-pH, נוסיף 100 milliliters של חלב רזה מרוכז, 1%, לדגימת המים בנפח של 10 liter, ונערבב את הדגימות במשך שמונה עד 10 שעות כדי לאפשר לווירוסים להיספג בתוך הפלוקים. עבור דגימת הבקרה (spike sample) המשמשת כבקרת תהליך, יש להוסיף לדגימה את הנפח הסטנדרטי של וירוס הבקרה, למשל own milliliter אחד. נעצור את הערבוב ונניח לפלוקים לשקוע בכבידה במשך שמונה עד 10 שעות.לאחר 16 שעות, בדרך כלל למחרת, ניתן יהיה לאסוף את המשקעים. לשם כך, הסירו את הנוזל העליון באמצעות משאבה פריסטאלטית. אספו את המשקע יחד עם הפלוקים, כ-500 milliliters, לבקבוק צנטריפוגה.יש לאזן את המבחנות על ידי הוספת חלב דל שומן מסונן ב-pH 3.5, ולסבב אותן בצנטריפוגה במהירות גבוהה, 8,000 Gs למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. מיד עם עצירת הצנטריפוגה, הוצא בעדינות את המבחנות מהמכשיר. שפוך בזהירות רבה את הנוזל העליון (supernatant) והשליכו אותו.המס את המשקע בכל בקבוק צנטריפוגה לנפח סופי של 10 milliliter פוספט, לצורך הפקת חומצות גרעין וכמיות של נגיפים. הריכוז הנגיפי ישמש להפקה של חומצות גרעין נגיפיות, והאדנו-נגיפים ונגיפי הפוליאומה הספציפיים הנבדקים יכומתו באמצעות A-Q-P-C-R. בצע הפקת חומצה גרעינית באמצעות ערכת key amp viral RNA mini kit.ליזיס של הווירוסים הנוכחים ב-140 µL של תרכיזים ויראליים מבוצע ידנית, וחומצות גרעיניות כולליות מופקות ל-80 µL. ערכה זו מאפשרת שימוש בפלטפורמה אוטומטית כגון Key cube.השלב הבא הוא כימות הגנום הוויראלי. ניתן לכמת עותקים בדגימות באמצעות PCR כמותי עם גששים מסוג tac man; אדנו-וירוסים אנושיים, JC Polyoma viruses ו-bovine polyoma viruses ניתנים לכימות באותה פלטה בעלת 96 בארות. מכיוון שכולם משתמשים באותם מחזורי הגברה, יש לבדוק אדנו-וירוסים של חזירים בנפרד, בפלטה עצמאית, לצורך כימות הווירוס המטרה.הכינו את תערובת ה-quantitative PCR באזור נפרד ונקי. לאחר הכנת התערובת, הקציתו 15 µL לכל באר, כולל הבקרות. הוסיפו 10 µL של תמריטי חומצות הגרעין מהדגימות באזור נפרד; בצעו בדיקה ישירה ובדיקה של דילול פי עשרה במים מופקדים עבור כל דגימה בכפילות. הנפח הכולל לתגובה אחת לאחר הוספת המטרה יהיה 25 µL, מתוכם 15 µL של תערובת ו-10 µL של דגימה או סטנדרט. כסו את הבארות המכילות את הדגימות באמצעות חלק מכיסוי דביק.שמרו את החלק השני של המכסה לשלב הבא. דילול של תמיסות סטנדרט ה-DNA. העבירו 10 µL מריכוזים של 10⁰ עד 10⁶ עותקים של גנום, לתוך 90 µL בtriplicate ובאמצעות micro-pipette המיועדת באופן בלעדי לכיסוי של ה-DNA הסטנדרטי.הבארים המכילות את התקנים עם הכיסוי הדביק שנגזר מראש. איור זה מציג את התכנית של דגימות תמיסות התקן והביקרים בלוח 96 באערים.בצע את ה-QPCR במערכת מתאימה, תוך בחירת הפרמטרים הרלוונטיים לאחר הפעלת ה-amplitude gold למשך 10 דקות. בטמפרטורה של 95 °C, בוצעו 40 מחזורי הגברה עם השלמת התגובות. שמור את הנתונים והתוצאות כפי שמתואר במדריך למשתמש של הציוד שבו נעשה שימוש.כמות ה-DNA תוגדר כחציון הנתונים שהתקבלו לאחר תיקון מקדם הדילול במידת הצורך. גרף ההגברה ועקומת הסטנדרט שהתקבלו עבור הכמות של adenoviruses של חזירים הראו מקדם מתאם של 0.999. ערכי שיפוע מקובלים נעים בין מינוס 3.1 למינוס 3.6 לאחר ביצוע הפרוטוקול.נגיפי אדם ובעלי חיים מתוארים נבדקו בדגימות מי תהום מאזור המציג רמות גבוהות של חנקה (nitrates) כדי להגדיר את מקורות הזיהום. ארבע החזרות שנותחו הראו תוצאות חיוביות עבור אדנו-וירוסים של חזירים (porcine adenoviruses) בערך ממוצע של 7.74 ל-10² עותקים של הגנום לליטר, דבר שעשוי להיות קשור לנוכחות של שפרירי חזירים (porcine slurries) באזור שסביב נקודת הדגימה, ויעיד על נוכחות של זיהום צוארי מחזירים במי התהום. לא נמצאה זיהום אנושי באף אחת מהדגימות שנבדקו.הנתונים הווירולוגיים אוששו באמצעות nested PCR ואנליזת ריצוף. סיכום. במחקר זה הצגנו תוצאות של ניתוח דגימות מי תהום, המראות זיהום ממקור חזיר בהיעדר זיהום אנושי או בקרים. ההליך הוחל גם על ניתוח של מי רחצה, מי ים ומי נהרות.אנו מציגים כאן את הפרוצדורה ליישום כלים אלו לזיהוי מקור זיהום במי תהום, כאשר נציג רמות גבוהות של חנקת (nitrate) כדוגמה לישימותן של השיטות שפותחו לזיהוי מקור זיהום בסביבה.

cost-effective-method-for-microbial-source-tracking-using-specific

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Virochip הוא microarray הפאן ויראלי שנועד לזהות בו זמנית את כל וירוסים ידועים, כמו גם וירוסים רומן על בסיס הומולוגיה ברצף נשמרת. כאן אנו מדגימים איך לנהל assay Virochip לנתח דגימות קליניות עבור נוכחות של וירוסים מוכרים ושאינם מוכרים.

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

מחקר זה מתאר את האבחנה של שפעת העופות בעופות בר באמצעות מערכת ניידת rRT-PCR. השיטה מנצלת מיובשים בהקפאה ריאגנטים למסך ציפורי בר בסביבה הלא במעבדה, תרחיש טיפוסי של התפרצות. שימוש בכלים מולקולריים מספק חלופות מדויק ורגיש לאבחון מהיר.

אבחון מהיר של וירוס שפעת העופות בעופות בר: שימוש ניידים rRT-PCR ו מיובשים בהקפאה ריאגנטים בתחום

שיטה לשמר, לזהות רצף הרנ"א מפני וירוסים שפעת העופות היה תוקף המורחבת באמצעות דגימות צואה טבעיים ציפורים. טכניקה זו מסירה את הצורך של שמירה על שרשרת מגניב וטיפול וירוסים זיהומיות ניתן ליישם תוכנית ההתקנה של תפוקה גבוהה 96-היטב.

מעקבים שפעת העופות FTA עם כרטיסי: שיטות שדה, biosafety, וסוגיות התחבורה נפתר

שיטה של ​​התחקות נוירונים הקשורים synaptically מתוארת. אנו משתמשים סגוליים TVA של תא במעלה זרם כדי לבחון אם אוכלוסיית תא של עניין מקבלת קלט סינפטי מסוגי תאים מוגדרים מבחינה גנטית.

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

בדיקות תפוקה גבוהה של פתוגנים מבוססים DNA ו- RNA על ידי ננו PCR מתוארות באמצעות כלבים syndromic ולוח PCR נשימת סוסים.

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

אניון להחליף שיטה מבוססת-שרף, הותאם לנוזל הוכח bioaerosol מבוסס-impingement דגימה של וירוסים. כאשר יחד עם זיהוי מולקולרי במורד הזרם, השיטה מאפשרת גילוי נתיישב ורגיש של וירוסים bioaerosols.

זיהוי של וירוסים Bioaerosols באמצעות אניון Exchange שרף

כאן אנו מציגים את VirWaTest, המהווה שיטה פשוטה, במחיר סביר ונייד לריכוז ואיתור של וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.

וירוטסט, נקודת שימוש לאיתור וירוסים בדגימות מים

רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים נמצאו ביתושים בשל השימוש הנרחב בטכנולוגיות ריצוף. אנו מספקים הליך יעיל לבידוד והגברה של וירוסים באמצעות קווי תאים של בעלי חוליות ויתושים, אשר עשוי לשמש בסיס למחקרים עתידיים על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל וירוסים המועברים על ידי יתושים וספציפיים ליתושים.

בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח

אנו מציגים פרוטוקול המשלב הגברה של רקומבינאז פולימראז עם מערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA ובונים מיקרוסקופ סמארטפון נייד עם סיווג בעזרת בינה מלאכותית לזיהוי נגיפי DNA נקודתיים.

מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה מהירה וחסכונית לאפיון גנומים של נגיף הכלבת (RABV) באמצעות טכנולוגיית ננו-נקבוביות. זרימת העבודה נועדה לתמוך במעקב מבוסס גנומיקה ברמה המקומית, לספק מידע על שושלות RABV מסתובבות ומיקומם בתוך פילוגניות אזוריות כדי להנחות אמצעים להדברת כלבת.

ריצוף גנום שלם לאפיון מהיר של נגיף הכלבת בטכנולוגיית ננופור

כאן, אנו מתארים בדיקה חיסונית פלואורסצנטית מרובת מרבבים שפותחה לאחרונה המשתמשת במערכת ציטומטרית זרימה דו-מדווחת כדי לזהות בו זמנית שני אפיטופים ייחודיים של חלבון ספייק על חלקיקים נגיפיים שלמים של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) שנלכדו על ידי מיקרוספרות מגנטיות מצומדות אנזים 2-2 הממירות אנגיוטנסין.

יצירת פרופיל של אפיטופים של חלבון פני השטח על חלקיקים נגיפיים על ידי אסטרטגיית Multiplex Dual-Reporter

למד שיטה חסכונית למעקב אחר מקורות זיהום מיקרוביאלי במים באמצעות PCR כמותי לזיהוי וירוסי DNA ספציפיים מאדם, חזיר ופרה. השיטה מאפשרת זיהוי מקורות זיהום צואתי ושיפור ניטור איכות המים.

חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

גלה סרטונים נוספים