חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

שיטה יעילה כלכלית למעקב אחר מקורים מיקרוביאליים באמצעות וירוסים ספציפיים של בני אדם ובעלי חיים. המחקר מתאר שיטה יעילה כלכלית לזיהוי מקור זיהום צואתי, זיהום שתן או זיהום על ידי חנקות במים, תוך שימוש ב-quantitative PCR לכימות ספציפי של DNA viruses, adenoviruses ו-polyomaviruses של בני אדם, חזירים ובקר, המוצעים ככלים למעקב אחר מקורים מיקרוביאליים. פיתחנו פרוטוקול לריכוז וירוסים מדגימות מים של 10 liter באמצעות פלוקולציה אורגנית, מיצוי חומצות גרעין וירוסליות מהמשקעים באמצעות חלב דל שומן וכימות של DNA viruses של בני אדם, בקר או חזירים באמצעות quantitative PCR.

ידוע כי זיהום מיקרוביאלי של הוויטמין מהווה סיכון בריאותי משמעותי, ועלינו להכיר את מקורות הזיהום. הצענו להשתמש בנגיפי DNA נפוצים מאוד ככלים למעקב אחר מקור מיקרוביאלי. הנגיפים שנבחרו הם אדנווירוסים ופוליומאווירוסים.

וירוסים אלו מופרשים באופן עקבי לאורך כל השנה ובכל האזורים הגאוגרפיים, כפי שנחקר במחקרים קודמים. פיתחנו שיטות ריכוז חסכוניות ויעילות לווירוסים במים, ועבדנו על פיתוח בדיקות QPCR לכימות של purine adenoviruses ו-bovine polyomaviruses.

בנוסף, אנו משתמשים באדנו-וירוסים אנושיים וב-NGC Polyomaviruses, שנבדקו באמצעות QPCR, גם הם כסמנים לזיהום אנושי במים, איסוף דגימות מים. במחקר זה, נאספות ארבע חזרות של 10 liter לכל דגימת מים בתוך מכלים מפלסטיק בעלי תחתית שטוחה, ודגימה אחת נוספת כבקרת תהליך. דגימה אחרונה זו תזוהם בכמות ידועה של חלקיקי וירוס המשמשים כביקורת.

ביקורת שלילית מוכנה במעבדה באמצעות שימוש במי ברז תקינים במיכל פלסטיק נוסף בנפח 10 ליטר. אם הדגימה מכילה כמות גבוהה של חומרים רחופים, חול וחומרים אחרים, יש להמתין 15 דקות לשקיעתם ולהעביר את המים למיכל חדש. ריכוז ויראלי באמצעות פלוקולציה אורגנית.

גילוי נגיפים בדגימות מים עם זיהום נמוך או בינוני דורש ריכוז של הנגיפים מכמה ליטרים לפחות של מים לנפח קטן בהרבה. הליך הריכוז כולל החמשה של דגימות מים בנפח של 10 ליטר, פלוקולציה באמצעות חלב רזה, שקיעה בגלל כוח הכבידה של הפלוקים ואיסוף המשקע ב-10 מיליליטר של בופר פוספט. כדי להתחיל את התהליך, מכינים תמיסה של חלב רזה במי מים מלוחים מלאכותיים על ידי המסה של 10 גרם אבקת חלב רזה בליטר אחד של מי מים מלוחים מלאכותיים וכיוון מדויק של ה-pH ל-3.5 באמצעות חומצה כלורית; הפלוקים צריכים להיות גלויים לעין.

הכינו את התמיסה רגע לפני השימוש או שמרו אותה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ערבבו את דגימות המים ומדדו את המוליכות בדגימות. אם היא נמוכה מ-1.5 millisiemens, יש להוסיף מלחים ימיים.

התאימו את ה-pH של דגימת המים ל-3.5 על ידי הוספה של חומצה כלורית. רשמו את ה-pH של הדגימות לפני ואחרי ההתנייה, וכן את נפח החומצה הכלורית שנעשה בו שימוש. יש לרשום גם את המוליכות.

לאחר כיוון ה-pH, נוסיף 100 milliliters של חלב רזה מרוכז, 1%, לדגימת המים בנפח של 10 liter, ונערבב את הדגימות במשך שמונה עד 10 שעות כדי לאפשר לווירוסים להיספג בתוך הפלוקים. עבור דגימת הבקרה (spike sample) המשמשת כבקרת תהליך, יש להוסיף לדגימה את הנפח הסטנדרטי של וירוס הבקרה, למשל own milliliter אחד. נעצור את הערבוב ונניח לפלוקים לשקוע בכבידה במשך שמונה עד 10 שעות.

לאחר 16 שעות, בדרך כלל למחרת, ניתן יהיה לאסוף את המשקעים. לשם כך, הסירו את הנוזל העליון באמצעות משאבה פריסטאלטית. אספו את המשקע יחד עם הפלוקים, כ-500 milliliters, לבקבוק צנטריפוגה.

יש לאזן את המבחנות על ידי הוספת חלב דל שומן מסונן ב-pH 3.5, ולסבב אותן בצנטריפוגה במהירות גבוהה, 8,000 Gs למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. מיד עם עצירת הצנטריפוגה, הוצא בעדינות את המבחנות מהמכשיר. שפוך בזהירות רבה את הנוזל העליון (supernatant) והשליכו אותו.

המס את המשקע בכל בקבוק צנטריפוגה לנפח סופי של 10 milliliter פוספט, לצורך הפקת חומצות גרעין וכמיות של נגיפים. הריכוז הנגיפי ישמש להפקה של חומצות גרעין נגיפיות, והאדנו-נגיפים ונגיפי הפוליאומה הספציפיים הנבדקים יכומתו באמצעות A-Q-P-C-R. בצע הפקת חומצה גרעינית באמצעות ערכת key amp viral RNA mini kit.

ליזיס של הווירוסים הנוכחים ב-140 µL של תרכיזים ויראליים מבוצע ידנית, וחומצות גרעיניות כולליות מופקות ל-80 µL. ערכה זו מאפשרת שימוש בפלטפורמה אוטומטית כגון Key cube.

השלב הבא הוא כימות הגנום הוויראלי. ניתן לכמת עותקים בדגימות באמצעות PCR כמותי עם גששים מסוג tac man; אדנו-וירוסים אנושיים, JC Polyoma viruses ו-bovine polyoma viruses ניתנים לכימות באותה פלטה בעלת 96 בארות. מכיוון שכולם משתמשים באותם מחזורי הגברה, יש לבדוק אדנו-וירוסים של חזירים בנפרד, בפלטה עצמאית, לצורך כימות הווירוס המטרה.

הכינו את תערובת ה-quantitative PCR באזור נפרד ונקי. לאחר הכנת התערובת, הקציתו 15 µL לכל באר, כולל הבקרות. הוסיפו 10 µL של תמריטי חומצות הגרעין מהדגימות באזור נפרד; בצעו בדיקה ישירה ובדיקה של דילול פי עשרה במים מופקדים עבור כל דגימה בכפילות. הנפח הכולל לתגובה אחת לאחר הוספת המטרה יהיה 25 µL, מתוכם 15 µL של תערובת ו-10 µL של דגימה או סטנדרט. כסו את הבארות המכילות את הדגימות באמצעות חלק מכיסוי דביק.

שמרו את החלק השני של המכסה לשלב הבא. דילול של תמיסות סטנדרט ה-DNA. העבירו 10 µL מריכוזים של 10⁰ עד 10⁶ עותקים של גנום, לתוך 90 µL בtriplicate ובאמצעות micro-pipette המיועדת באופן בלעדי לכיסוי של ה-DNA הסטנדרטי.

הבארים המכילות את התקנים עם הכיסוי הדביק שנגזר מראש. איור זה מציג את התכנית של דגימות תמיסות התקן והביקרים בלוח 96 באערים.

בצע את ה-QPCR במערכת מתאימה, תוך בחירת הפרמטרים הרלוונטיים לאחר הפעלת ה-amplitude gold למשך 10 דקות. בטמפרטורה של 95 °C, בוצעו 40 מחזורי הגברה עם השלמת התגובות. שמור את הנתונים והתוצאות כפי שמתואר במדריך למשתמש של הציוד שבו נעשה שימוש.

כמות ה-DNA תוגדר כחציון הנתונים שהתקבלו לאחר תיקון מקדם הדילול במידת הצורך. גרף ההגברה ועקומת הסטנדרט שהתקבלו עבור הכמות של adenoviruses של חזירים הראו מקדם מתאם של 0.999. ערכי שיפוע מקובלים נעים בין מינוס 3.1 למינוס 3.6 לאחר ביצוע הפרוטוקול.

נגיפי אדם ובעלי חיים מתוארים נבדקו בדגימות מי תהום מאזור המציג רמות גבוהות של חנקה (nitrates) כדי להגדיר את מקורות הזיהום. ארבע החזרות שנותחו הראו תוצאות חיוביות עבור אדנו-וירוסים של חזירים (porcine adenoviruses) בערך ממוצע של 7.74 ל-10² עותקים של הגנום לליטר, דבר שעשוי להיות קשור לנוכחות של שפרירי חזירים (porcine slurries) באזור שסביב נקודת הדגימה, ויעיד על נוכחות של זיהום צוארי מחזירים במי התהום. לא נמצאה זיהום אנושי באף אחת מהדגימות שנבדקו.

הנתונים הווירולוגיים אוששו באמצעות nested PCR ואנליזת ריצוף. סיכום. במחקר זה הצגנו תוצאות של ניתוח דגימות מי תהום, המראות זיהום ממקור חזיר בהיעדר זיהום אנושי או בקרים. ההליך הוחל גם על ניתוח של מי רחצה, מי ים ומי נהרות.

אנו מציגים כאן את הפרוצדורה ליישום כלים אלו לזיהוי מקור זיהום במי תהום, כאשר נציג רמות גבוהות של חנקת (nitrate) כדוגמה לישימותן של השיטות שפותחו לזיהוי מקור זיהום בסביבה.