Name: מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: למדו שיטת זיהוי מהירה ורגישה לנגיפי DNA באמצעות RPA-CRISPR/Cas12a ולמידה עמוקה. מערכת זו מאפשרת אבחון נקודתי של frog virus 3 ומונעת התפרצויות מגפה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין 31970752, מדע, טכנולוגיה, חדשנות הוועדה של עיריית שנזן JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; מימון פתוח של מעבדת מפרץ שנזן, SZBL2020090501004; הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין 2020M680023; והמנהל הכללי של המכס של הרפובליקה העממית של סין 2021HK007.

<ol><li>Gire, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+surveillance+elucidates+Ebola+virus+origin+and+transmission+during+the+2014+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak.</a> Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).</li>
<li>The Ebola Outbreak Epidemiology Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+Ebola+virus+disease+in+the+Democratic+Republic+of+the+Congo%2C+April-May+2018%3A+an+epidemiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May 2018: an epidemiological study.</a> Lancet. 392 (10143), 213-221 (2018).</li>
<li>Zumla, A., Hui, D. S., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome.</a> Lancet. 386 (9997), 995-1007 (2015).</li>
<li>Plourde, A. R., Bloch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+literature+review+of+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A literature review of Zika virus.</a> Emerg Infect Dis. 22 (7), 1185-1192 (2016).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+perspective+diagnostic+techniques+for+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Current and perspective diagnostic techniques for COVID-19.</a> ACS Infect Dis. 6 (8), 1998-2016 (2020).</li>
<li>Minhaj, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monkeypox+outbreak+-+nine+states%2C+May+2022%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb+Mortal+Wkly+Rep%22%5BJournal%5D)">Monkeypox outbreak - nine states, May 2022.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 71 (23), 764-769 (2022).</li>
<li>Bao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+based+molecular+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sens%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for clustered regularly interspaced short palindromic repeats based molecular biosensing.</a> ACS Sens. 6 (7), 2497-2522 (2021).</li>
<li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a%2FC2c2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li>
<li>Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHERLOCK%3A+nucleic+acid+detection+with+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.</a> Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).</li>
<li>Mukama, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrasensitive+and+specific+point-of-care+CRISPR%2FCas12+based+lateral+flow+biosensor+for+the+rapid+detection+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">An ultrasensitive and specific point-of-care CRISPR/Cas12 based lateral flow biosensor for the rapid detection of nucleic acids.</a> Biosens Bioelectron. 159, 112143(2020).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Yin, L., Man, S., Ye, S., Liu, G., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+based+virus+detection%3A+Recent+advances+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives.</a> Biosens Bioelectron. 193, 113541(2021).</li>
<li>Dronina, J., Bubniene, U. S., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+DNA+polymerases+and+Cas9+as+representative+of+DNA-modifying+enzymes+group+in+DNA+sensor+design+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">The application of DNA polymerases and Cas9 as representative of DNA-modifying enzymes group in DNA sensor design (review).</a> Biosens Bioelectron. 175, 112867(2021).</li>
<li>Fozouni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification-free+detection+of+SARS-CoV-2+with+CRISPR-Cas13a+and+mobile+phone+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy.</a> Cell. 184 (2), 323-333.e9 (2021).</li>
<li>Kumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FnCas9-based+CRISPR+diagnostic+for+rapid+and+accurate+detection+of+major+SARS-CoV-2+variants+on+a+paper+strip%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">FnCas9-based CRISPR diagnostic for rapid and accurate detection of major SARS-CoV-2 variants on a paper strip.</a> eLife. 10, e67130(2021).</li>
<li>Lee, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+CRISPR-based+diagnostic+for+field-applicable+detection+of+Plasmodium+species+in+symptomatic+and+asymptomatic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).</li>
<li>Ganguli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hands-free+smartphone-based+diagnostics+for+simultaneous+detection+of+Zika%2C+Chikungunya%2C+and+Dengue+at+point-of-care%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Hands-free smartphone-based diagnostics for simultaneous detection of Zika, Chikungunya, and Dengue at point-of-care.</a> Biomed Microdevices. 19 (4), 73(2017).</li>
<li>Yeo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smartphone-based+fluorescent+diagnostic+system+for+highly+pathogenic+H5N1+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Smartphone-based fluorescent diagnostic system for highly pathogenic H5N1 viruses.</a> Theranostics. 6 (2), 231-242 (2016).</li>
<li>von Chamier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Democratising+deep+learning+for+microscopy+with+ZeroCostDL4Mic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic.</a> Nat Commun. 12 (1), 2276(2021).</li>
<li>Shiaelis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+detection+and+identification+in+minutes+using+single-particle+imaging+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Virus detection and identification in minutes using single-particle imaging and deep learning.</a> ACS Nano. 17 (1), 697-710 (2020).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed-UNet%3A+Refined+class+activation+mapping+for+weakly-supervised+semantic+segmentation+with+multi-scale+inference%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Comput.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mixed-UNet: Refined class activation mapping for weakly-supervised semantic segmentation with multi-scale inference.</a> Front. Comput. Sci. 4, 1036934(2022).</li>
<li>Lawrimore, J., Doshi, A., Walker, B., Bloom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AI-assisted+forward+modeling+of+biological+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">AI-assisted forward modeling of biological structures.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 279(2019).</li>
<li>Yang, Y., Hu, Y., Zhang, X., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+selective+ensemble+of+CNN+via+deep+tree+training+for+medical+image+classification%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Cybern%22%5BJournal%5D)">Two-stage selective ensemble of CNN via deep tree training for medical image classification.</a> IEEE Trans Cybern. 52 (9), 9194-9207 (2022).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RCMNet%3A+A+deep+learning+model+assists+CAR-T+therapy+for+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">RCMNet: A deep learning model assists CAR-T therapy for leukemia.</a> Comput Biol Med. 150, 106084(2022).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+prediction+from+electrocardiograms+by+deep+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22Multimed+Tools+Appl%22%5BJournal%5D)">Stroke prediction from electrocardiograms by deep neural network.</a> Multimed Tools Appl. 80, 17291-17297 (2021).</li>
<li>Wang, J., Zhu, H., Wang, S., Zhang, Y. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+deep+learning+on+medical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+Netw+Appl%22%5BJournal%5D)">A review of deep learning on medical image analysis.</a> Mobile Netw Appl. 26, 351-380 (2021).</li>
<li>Artoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+of+spontaneous+arousal+fluctuations+detects+early+cholinergic+defects+across+neurodevelopmental+mouse+models+and+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deep learning of spontaneous arousal fluctuations detects early cholinergic defects across neurodevelopmental mouse models and patients.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23298-23303 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeepLearnMOR%3A+a+deep-learning+framework+for+fluorescence+image-based+classification+of+organelle+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">DeepLearnMOR: a deep-learning framework for fluorescence image-based classification of organelle morphology.</a> Plant Physiol. 186 (4), 1786-1799 (2021).</li>
<li>Yosinski, J., Clune, J., Bengio, Y., Lipson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+transferable+are+features+in+deep+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+27th+International+Conference+on+Neural+Information+Processing+Systems%22%5BJournal%5D)">How transferable are features in deep neural networks.</a> Proceedings of the 27th International Conference on Neural Information Processing Systems. 2, 3320-3328 (2014).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+all-solution+phase+African+Swine+Fever+Virus+%28ASFV%29+detection+using+CRISPR-Cas12a+and+fluorescence+based+point-of-care+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">High-throughput and all-solution phase African Swine Fever Virus (ASFV) detection using CRISPR-Cas12a and fluorescence based point-of-care system.</a> Biosens Bioelectron. 154, 112068(2020).</li>
<li>Krizhevsky, A., Sutskever, I., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageNet+classification+with+deep+convolutional+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+ACM%22%5BJournal%5D)">ImageNet classification with deep convolutional neural networks.</a> Commun. ACM. 60 (6), 84-90 (2017).</li>
<li>Lawton, S., Viriri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+COVID-19+from+CT+lung+scans+using+transfer+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Intell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detection of COVID-19 from CT lung scans using transfer learning.</a> Comput Intell Neurosci. 2021, 5527923(2021).</li>
<li>Lei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+frog+virus+3+by+integrating+RPA-CRISPR%2FCas12a-SPM+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Detection of frog virus 3 by integrating RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with deep learning.</a> ACS Omega. 8 (36), 32555-32564 (2023).</li>
<li>Chen, Z., Huang, J., Zhang, F., Zhou, Y., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+shrimp+hemocyte+iridescent+virus+by+recombinase+polymerase+amplification+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection of shrimp hemocyte iridescent virus by recombinase polymerase amplification assay.</a> Mol Cell Probes. 49, 101475(2020).</li>
<li>Fu, X., Sun, J., Ye, Y., Zhang, Y., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+ultrasensitive+dual+detection+platform+based+on+Cas12a+for+simultaneous+detection+of+virulence+and+resistance+genes+of+drug-resistant+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A rapid and ultrasensitive dual detection platform based on Cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug-resistant Salmonella.</a> Biosens Bioelectron. 195, 113682(2022).</li>
<li>Habimana, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+of+CRISPR%2FCas+nucleases+for+programmable+targeting+and+early-stage+diagnosis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights of CRISPR/Cas nucleases for programmable targeting and early-stage diagnosis: A review.</a> Biosens Bioelectron. 203, 114033(2022).</li>
<li>Liang, Y., Lin, H., Zou, L., Deng, X., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+tracking+of+Omicron+variant+of+SARS-CoV-2+using+CRISPR-Cas12a-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay.</a> Biosens Bioelectron. 205, 114098(2022).</li>
<li>Sivaraman, D., Biswas, P., Cella, L. N., Yates, M. V., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+RNA+viruses+in+living+mammalian+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Detecting RNA viruses in living mammalian cells by fluorescence microscopy.</a> Trends Biotechnol. 29 (7), 307-313 (2011).</li>
<li>Wang, I. H., Burckhardt, C. J., Yakimovich, A., Greber, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging%2C+tracking+and+computational+analyses+of+virus+entry+and+egress+with+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Imaging, tracking and computational analyses of virus entry and egress with the cytoskeleton.</a> Viruses. 10 (4), 166(2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בשיטה זו, אנו מפתחים מערכת מהירה, קלה ליישום, רגישה מאוד, ספציפית לרצף וזיהוי וירוסי DNA POC בסיוע AI. לאחר קבלת דגימות, RPA מוחל כדי להגביר את רצף המטרה, ולאחר מכן CRISPR/Cas12a יכול לזהות את DNA המטרה ולשחרר פלואורסצנטיות, אשר מגדילה את אות האיתור. מיקרוסקופ סמארטפון נייד בנוי לצלם תמונות פלואורסצנטיות, ומודלים של למידה עמוקה עם למידת העברה משמשים לסיווג בינארי של תמונות הדגימות החיוביות והשליליות. FV3 נלקח כמדגם חיובי בשיטה זו ולאחר מכן נחקר מנקודות מבט מרובות כדי לשפר את הספציפיות והרגישות של המערכת המוצעת.
האסטרטגיה הראשונה היא תכנון פריימרים ספציפיים של RPA וסינון הפריימרים היעילים ביותר. יעילות ההגברה של תגובת RPA מושפעת מפריימרים שונים36. הספציפיות של הפריימרים המשמשים להגברת גן המטרה של זני נגיף ה- DNA יכולה להיות מאושרת על ידי פיצוץ מול מסד הנתונים הסטנדרטי של ריצוף נוקלאוטידים. מכיוון שאין מדריך לתכנון זוגות פריימר RPA יעילים, נדרש אימות ניסיוני37. 
גישה נוספת היא לתכנן את ה-crRNA של וירוס המטרה עבור תגובת CRISPR/Cas12a מכיוון שיעילות המחשוף הבטחוני תורמת משמעותית לרגישות הזיהוי38,39. יש לקחת בחשבון את עוצמת האות הפלואורסצנטי המופעל בתגובת CRISPR/Cas12a ללא RPA בבחירת crRNA טוב יותר. חוץ מזה, הפעילות הבטחונית של חלבון LbCas12a מופעלת כל הזמן במשך 24 שעות32, מה שיכול להועיל לזיהוי.
לצורך זיהוי וירוסים והדמיית חלקיקים נגיפיים, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי40,41. עם זאת, מיקרוסקופיה קונבנציונלית היא מסורבלת ויקרה לאבחון POC מהיר. לפיכך, במערכת המוצעת, SPM נייד עם עלות נמוכה יותר נבנה כדי להשיג את אות הפלואורסצנטיות על ידי לכידת התמונות לזיהוי POC. SPM נייד כזה עולה הרבה פחות מאשר קורא לוחות מסחרי או מכונת PCR בזמן אמת, שהוא חסכוני עבור הגדרת מערכת זיהוי.
פלטפורמה מוצעת זו גם צריכה להיות משופרת עוד יותר בכמה היבטים. בעת החלת פלטפורמת זיהוי זו על זיהוי וירוסי DNA אחרים, יש לעצב מחדש הן פריימר RPA והן רצף Cas12a-crRNA. מכיוון שאין מדריך לתכנון שלהם, יש לבצע ניסויים כדי להעריך את יעילותם. למרות שהמערכת המוצעת יכולה לענות על היתרונות של ניידות, עדיין יש להקטין עוד יותר את גודל המערכת כולה כדי להשיג מערכת קלה יותר. מכיוון שלא קל להתמקד במצלמת הטלפון הנייד עצמה לצילום מטווח קרוב, לוקח זמן להסתגל בתהליך קבלת תמונות פלורסנט, כולל שדה הראייה, לתמונות באיכות טובה יותר.
עם התקדמות הטכנולוגיה הקשורה ויישומים חדשים שלה, היעילות בזיהוי POC תמשיך להשתפר. השיטה המוצגת כאן היא דוגמה אחת לשיפור שעשוי לסייע בזיהוי POC המבוסס על מערכת CRISPR/Cas12a ופלטפורמת SPM, בסיוע AI חדשני. בנוסף, המערכת המשולבת עשויה לשמש לזיהוי כל יעד DNA עקב יכולת התכנות מחדש של crRNA. למערכת RPA-CRISPR/Cas12a-AI יהיה מקום משמעותי בזיהוי פתוגנים של DNA במונחים של רגישות זיהוי, ספציפיות, זמן ואמינות.

בשנים האחרונות, מגיפות של מחלות זיהומיות הנגרמות על ידי וירוסים שונים התרחשו לעתים קרובות, כולל מגיפת נגיף האבולה (EVD) בשנת 20141 ו 20182, תסמונת הנשימה במזרח התיכון (MERS) בשנת 20153, מגיפת מחלת נגיף זיקה בשנת 20154, מחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) הנגרמת על ידי תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2)5 ואבעבועות הקוף המתמשכת הנגרמת על ידי נגיף אבעבועות הקוף (MKPV) בשנת 20226. התפרצויות פתאומיות אלה של מחלות זיהומיות מגיפות גורמות למספר רב של מקרי מוות ומביאות להפסדים כלכליים עצומים ותסיסה חברתית. נדרשת בדחיפות מערכת זיהוי מהירה ומדויקת כדי לאבחן במהירות את הזיהום ולמנוע את המשך התפשטות הנגיף.
לאחרונה, חלבונים פלינדרומיים קצרים מקובצים במרווחים קבועים (CRISPR) וחלבונים הקשורים לקריספר (Cas) זכו לתשומת לב עולמית והראו תוצאות מבטיחות בזיהוי חומצות גרעין 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . חלבון CRISPR/Cas12a, מונחה על ידי CRISPR RNA (crRNA), נקשר לדנ"א המטרה וקורע אותו. פעילות זו מובילה לשחרור DNA חד-גדילי לא ספציפי (ssDNA), המכונה trans-cleavage, וניתן להשתמש בה כדי לשפר את אות הזיהוי לזיהוי חומצות גרעין. כמה שיטות זיהוי מסורתיות כמו תגובת שרשרת פולימראז (PCR), PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) הן מסובכות, גוזלות זמן ויקרות לזיהוי נקודת טיפול (POC). בעבודתנו הקודמת פיתחנו בהצלחה מערכת זיהוי אוטומטית, משולבת וחסכונית לנגיף קדחת החזירים האפריקנית (ASFV) המבוססת על טכנולוגיית CRISPR/Cas12a. במערכת זו השגנו מגבלת זיהוי של 1 pM בתוך מסגרת זמן של שעתיים ללא צורך בהגברה. מערכת CRISPR/Cas12a והגברה של רקומבינאז פולימראז (RPA) משולבות כדי לשפר את הרגישות והספציפיות לזיהוי עקבות DNA. בהשוואה לטכניקות הגברה איזותרמיות אחרות, RPA הוא פשוט בעיצוב ונוח לתפעול מכיוון שיש לו זמן תגובה קצר יותר ללא ציוד בקרת טמפרטורה מתוחכם.
לזיהוי POC של פתוגנים, מכשירים כגון מיקרוסקופ סמארטפון (SPM), פלואורימטר כף יד או פסי זרימה רוחביים מפותחים עבור קריאות התוצאות 16,17,18. SPM לוכד תמונות באמצעות מצלמה ומעלה אותן ליישומים ניידים מסוימים לצורך ניתוח נתונים מהיר. מיקרוסקופיה כזו מייצרת מערכת קליטת אותות ניידת, זולה וממוזערת עם רגישות גבוהה והראתה יתרונות באיתור פתוגנים כגון H5N1, נגיף זיקה ו- SARS-CoV-219,20. לכן, אנו בונים SPM נייד כדי לתפוס את אותות הפלואורסצנטיות המופעלים על ידי זיהוי RPA-CRISPR/Cas12a של נגיף ה- DNA המטרה. גשושית כתב ssDNA המקשרת בין פלואורופור ומרווה תיבקע כאשר CRISPR/Cas12a יזהה את נגיף ה- DNA המטרה, והפלואורסצנטיות הנפלטת מהפלואורופור יכולה להילכד על ידי SPM.
בהשוואה לתוכנה המקצועית המשמשת בדרך כלל להשגת מידע התוצאות מתמונות הפלואורסצנטיות מ- SPM21, חלק מהמומחים משתמשים בלמידת מכונה ובלמידה עמוקה כדי לכמת את ריכוזי ה- DNA של הנגיף לאחר השגת תמונות פלואורסצנטיות22, דבר הגוזל זמן רב יותר. כשמדובר בסיווג תמונות רפואיות, רשתות עצביות קונבנציונליות (CNN) משמשות לעתים קרובות כדי ללמוד תכונות מהתמונות המפוקסלות הגולמיות באופן מקצה לקצה 23,24,25,26. מודלים פופולריים מבוססי למידה עמוקה מבוססי CNN כמו AlexNet, DenseNet-121 ו- EfficientNet-B7 יושמו בהצלחה בתחום זה27,28. עם זאת, השגת מערכי נתונים גדולים בתחומים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת, ומחייבת למידה העברה29,30. גישה זו מאמנת מראש מודל למידה עמוקה עם מערך נתונים גדול, והמודל שהוכשר מראש משמש כנקודת התחלה למשימה חדשה עם מערך נתונים קטן. טכניקה זו יכולה להפחית את הצורך במערכי נתונים גדולים, להילחם בהתאמת יתר ולהפחית את זמן האימון31. כאן, אנו משתמשים במודלים של למידה עמוקה עם למידת העברה לסיווג בינארי של תמונות פלואורסצנטיות של הדגימות החיוביות והשליליות.
בשיטה זו אנו משלבים RPA ומערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA. דנ"א המטרה מוגבר ומזוהה על ידי RPA ו-CRISPR/Cas12a בנפרד, מה שמפעיל את פעילות המחשוף ההיקפי של Cas12a שחותכת כתב DNA עם תווית פלואורופורית ומכלילה פלואורסצנטיות. אנו בונים SPM נייד כדי לצלם את התמונות הפלואורסצנטיות לזיהוי POC ולפתח מודלים של למידה עמוקה לסיווג בינארי. הסכימה של מערכת זיהוי POC הבנויה מוצגת באיור 1. ללא מפעילים מיומנים ומכשירים מגושמים, הסיווג בסיוע RPA-CRISPR/Cas12a-SPM עם בינה מלאכותית (AI) מראה פוטנציאל גדול לזיהוי וירוסי DNA POC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig01.jpg"> איור 1: הסכימה של מערכת זיהוי RPA-CRISPR/Cas12-SPM יחד עם סיווג AI עבור תמונות שנאספו. חומצות הגרעין של דגימות שמקורן בבעלי חיים משוחררות על ידי PINDBK. דנ"א המטרה של הנגיף מוגבר ומזוהה באופן ספציפי על ידי מערכת RPA-CRISPR/Cas12a. קשרי CRISPR/Cas12a עם crRNA וקשרים מורכבים Cas12a-crRNA עם DNA מטרה, מה שמפעיל את הפיצול הבטחוני של CRISPR/Cas12a על גשושיות כתב ssDNA. הפלואורופור על הכתב משתחרר, והפלואורסצנטיות מזוהה על ידי קורא לוחות ממוסחר או SPM שאנו בונים. שלושה מודלים שונים של למידה עמוקה, כולל AlexNet, DenseNet-121 ו- EfficientNet-B7 עם למידת העברה, משמשים לסיווג תמונות הפלואורסצנטיות. נעשה שימוש חוזר בנתון זה באישור Lei et al.35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>הגברה 20x</td><td>OLYMPUS</td><td>OPLN20X</td><td></td></tr><tr><td>532 ננומטר לייזר ירוק</td><td>Thorlabs</td><td>PL201</td><td>עם הספק פלט של 0.9</td></tr><tr><td>mW 535 ננומטר אורך גל חיתוך</td><td>כרום</td><td>AT535</td><td></td></tr><tr><td>6x מאגר טעינת DNA</td><td>Thermo scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות מיקרופלייט שחור</td><td>קורנינג משולב</td><td>3603</td><td>שחור עם תחתית שטוחה שקופה</td></tr><tr><td>עדשה אספרית</td><td>Lubang</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פס</td><td>פס SEMROCK</td><td>FF01-542/27-25</td><td></td></tr><tr><td>Bsu DNA פולימראז</td><td>ATG ביוטכנולוגיה</td><td>M103</td><td>שבר גדול</td></tr><tr><td>crRNA</td><td>סנגון ביוטק</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>שברי DNA</td><td>סנגון ביוטק</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מחזיקי Dichroic</td><td>Ruicage</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מראה דיכרואית</td><td>SEMROCK</td><td>FF555-Di03-25x36</td><td>עם אורך גל חיתוך של 535 ננומטר</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל E.Z.N.A</td><td>אומגה ביוטק</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>EnGen Lba Cas12a (Cpf1)</td> <td>ניו אינגלנד ביולאבס (בייג'ינג) בע"מ</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>מחזיקי מסננים</td><td>Ruicage</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fluorophore-ssDNA-Quencher מדווח בודק</td><td>סנגון ביוטק</td><td>N/A</td><td>TAMRA (carboxy tetramethylrhodamine) כפלואורופור ב-5 הקצוות; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) כמרווה בשלושת הקצוות</td></tr><tr><td>GP32</td><td>ATG Biotechnology</td><td>M104</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td> קוד פתוח <td>גרסה 1.53t 24</td><td>הורד מ-https://imagej.nih.gov/ij/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט</td><td>SPARK, TECAN</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר PCR תרמי רב בלוק</td><td>LongGene</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c ספקטרופוטומטרים</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer r2.1</td><td>ניו אינגלנד Biolabs (בייג'ינג) בע"</td>מ <td>B6002S</td><td>10x CRISPR / Cas12a מאגר תגובה</td></tr><tr><td>טיפול בפלזמה חמצן&nbsp;</td><td>אלקטרו-טכניקה&nbsp; מוצרים</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>פתוגן מושבת, ללא מיצוי חומצות גרעין, מאגר ישיר ל-PCR עם פרוטאינאז K (PINDBK)</td><td>Ebio</td><td>PINDBK -25 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>זוגות פריימר PCR</td><td>Sangon Biotech</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>RPA פריימר</td><td>זוגות סנגון ביוטק</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>סמארטפון</td><td>Huawei</td><td>שלבי תרגום Mate10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ruicage</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מסנני צפיפות ניטרלית משודרים</td><td>Thorlabs</td><td>ND40A</td><td></td></tr><tr><td>עדשות אכרומטיות משולשות</td><td>Thorlabs</td><td>TRH127-020-A</td><td></td></tr><tr><td>UvsX</td><td>ATG ביוטכנולוגיה</td><td>M105</td><td></td></tr><tr><td>UvsY</td><td>ATG ביוטכנולוגיה</td><td>M106</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת זיהוי וירוסי dna מבוססת על rpa-crispr/cas12a-spm ולמידה עמוקה

DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

אנו מדווחים על מערכת זיהוי נגיפי DNA מהירה, קלה ליישום, רגישה מאוד, ספציפית לרצף ונקודת טיפול (POC), המשלבת הגברה של רקומבינאז פולימראז (RPA) ומערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA. דנ"א המטרה מוגבר ומזוהה על ידי RPA ו-CRISPR/Cas12a בנפרד, מה שמפעיל את פעילות המחשוף ההיקפי של Cas12a שחותכת כתב DNA עם תווית פלואורופורית ומכלילה פלואורסצנטיות. לזיהוי POC, מיקרוסקופ סמארטפון נייד בנוי לצלם תמונות פלואורסצנטיות. חוץ מזה, מודלים של למידה עמוקה לסיווג בינארי של דגימות חיוביות או שליליות, להשגת דיוק גבוה, נפרסים בתוך המערכת. וירוס צפרדע 3 (FV3, סוג Ranavirus, משפחה Iridoviridae) נבדק כדוגמה למערכת זיהוי POC זו של נגיף DNA, וגבולות הזיהוי (LoD) יכולים להשיג 10 aM תוך 40 דקות. ללא מפעילים מיומנים ומכשירים מגושמים, הסיווג הנייד והזעיר בסיוע RPA-CRISPR/Cas12a-SPM עם בינה מלאכותית (AI) מראה פוטנציאל גדול לזיהוי וירוסי POC DNA ויכול לסייע במניעת התפשטות וירוסים כאלה.

שיטה זו מתמקדת במערכת זיהוי מהירה, קלה ליישום, רגישה ביותר ונקודת טיפול (POC) עבור נגיפי DNA. תכנון זוגות פריימרים עבור תגובת RPA ועיצוב crRNA עבור תגובת CRISPR/Cas12a הם שניים מהחלקים החיוניים מכיוון שהם ישפיעו על יעילות תגובת RPA-CRISPR/Cas12a וישפיעו על הזיהוי והסיווג הבאים.
בשיטה זו, FV3 נחשב כדוגמה לזיהוי נגיף DNA. כמה זוגות פריימר RPA עבור FV3 מתוכננים, והיעיל ביותר נבחר ומוודא שהוא מראה יעילות הגברה טובה, אשר ניתן לאשר על ידי הבטחת בהירות וגודל הפסים באמצעות אלקטרופורזה ג'ל של מוצרי RPA כאמור בשלב 2.8. במקביל, תכננו CRNA מסוג CRISPR/Cas12a ובחרנו את היעיל ביותר בהתבסס על האות הפלואורסצנטי החזק יותר המופעל בתגובת CRISPR/Cas12a ללא RPA. הרצף של שלושת הפריימרים קדימה ושלושה אחורה עבור RPA ושלושה crRNA עבור Cas12a מוצגים בטבלה 7. בהתבסס על תוצאות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז המוצגות באיור 3, זוג הפריימריםהשישי נותן יעילות הגברה טובה יותר (F2 ו-R1), אשר נבחרה עבור השיטה. כפי שניתן לראות באיור 4, crRNA-3 הוא היעיל ביותר עבור מחשוף בטחוני, שנבחר בשיטה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פריימר RPA F1</td>
			<td colspan="2">ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAG</td>
		</tr><tr><td>פריימר RPA F2</td>
			<td colspan="2">ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA</td>
		</tr><tr><td>פריימר RPA F3</td>
			<td colspan="2">TCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCAAGTGGT</td>
		</tr><tr><td>פריימר RPA R1</td>
			<td colspan="2">GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG</td>
		</tr><tr><td>פריימר RPA R2</td>
			<td colspan="2">GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAA</td>
		</tr><tr><td>פריימר RPA R3</td>
			<td colspan="2">CGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAACG</td>
		</tr><tr><td>LbCas12a crRNA-1</td>
			<td colspan="2">uaauuucuacuaaguguagauATCGACTTGGCCACTTATGACAA</td>
		</tr><tr><td>LbCas12a crRNA-2</td>
			<td colspan="2">uaauuucuacuaaguguagauTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGG</td>
		</tr><tr><td>LbCas12a crRNA-3</td>
			<td colspan="2">uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 7: פריימרים של RPA ורצפי crRNA לאופטימיזציה של תגובה. 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig03.jpg"> איור 3: תוצאות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז להערכת יעילות RPA. תגובות RPA בוצעו באמצעות שילובים שונים של פריימרים באותו מצב עם מטרה מטוהרת של 1 ננומטר. מספר 1 נחשב לשילוב של RPA-F3 ו-RPA-R3, 2 כ-RPA-F3 ו-RPA-R2, 3 כ-RPA-F3 ו-RPA-R1, 4 כ-RPA-F2 ו-RPA-R3, 5 כ-RPA-F2 ו-RPA-R2, 6 כ-RPA-F2 ו-RPA-R1, 7 כ-RPA-F1 ו-RPA-R3, 8 כ-RPA-F1 ו-RPA-R2, 9 כ-RPA-F1 ו-RPA-R2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig04.jpg"> איור 4: זיהוי מקטעי המטרה FV3 עם שלושה crRNA שונים על-ידי CRISPR/Cas12a. ריכוזי המקטעים המטוהרים שיושמו בגילוי היו בין 10 ננומטר ל-100 pM דנ"א מטרה לעומת 10 ננומטר דנ"א בקרה עם דגירה של 30 דקות. נעשה שימוש חוזר בנתון זה באישור Lei et al.35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדי להפיק את הנתונים באיור 5, יישמנו פריימרים ממוטבים של RPA, crRNA והגדרת SPM. כדי לקבל תחושה טובה יותר של הריכוז בדגימות, הגברנו מקטעי דנ"א של 240 bp של הגן MCP (ראשי תיבות של Major Capsid) מ-FV3 ו-Infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV, Iridoviridae) כמטרה ובקרה באמצעות ערכת הגברה של PCR, המופעלת עם ההליכים המוצגים בטבלה 8. גודל הדנ"א המוגבר מאושר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, וחילצנו את מטרת ה- dsDNA המטוהר והשליטה מהג'ל. מקטעי הדנ"א המטוהרים מכומתים באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop 2000.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig05.jpg"> איור 5: תמונות פלואורסצנטיות של דנ"א מטרה מטוהר ודנ"א בקרה. (A) הבקרה השלילית. (B) דנ"א מטרה מטוהר (100 pM). נעשה שימוש חוזר בנתון זה באישור Lei et al.35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>במה</td>
			<td>טמפרטורה (°C)</td>
			<td>זמן</td>
			<td>מחזור(ים)</td>
		</tr><tr><td>התחלה חמה</td>
			<td>95</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>דנטורציה</td>
			<td>95</td>
			<td>30 שניות</td>
			<td rowspan="3">35</td>
		</tr><tr><td>חישול</td>
			<td>60</td>
			<td>45 שניות</td>
		</tr><tr><td>סיומת</td>
			<td>72</td>
			<td>30 שניות</td>
		</tr><tr><td>סיומת</td>
			<td>72</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>אחסון</td>
			<td>4</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 8: הליך הגברת ה-PCR. 
להמחשה בלבד, ערכת נתונים הכוללת 162 תמונות פלואורסצנטיות מתקבלת לאחר ניקוי הנתונים. יש להרחיב את מספר התמונות הפלואורסצנטיות לניתוח נוסף, והכשרנו את מערך הנתונים באמצעות 337 תמונות פלואורסצנטיות לסיווג בינארי ו-398 לסיווג רב-מחלקתי.
השגנו זיהוי תוך כ-40 דקות, כולל 30 דקות להגברת RPA ו-10 דקות לזיהוי LbCas12a לאחר RPA. בעת שימוש במערכת הזיהוי שפותחה עם פריימרים נבחרים של RPA ו-crRNA, עוצמת האות של 10 aM FV3 והבקרה מראה הבדלים משמעותיים, כפי שמוצג באיור משלים 1.
איור משלים 1: הנתונים הסטטיסטיים של עוצמת האות עבור תמונות פלואורסצנטיות שנאספו בתגובות RPA-LbCas12a עם ריכוזים שונים של מקטעים מטוהרים. *: P &lt; 0.05; **: עמ' &lt; 0.01; עמ' &lt; 0.001.: עמ' &lt; 0.0001.: F: FV3, I: ISKNV; A.U.: יחידת ספיגה. נעשה שימוש חוזר בנתון זה באישור Lei et al.35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/revised-LoD.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

אנו מציגים פרוטוקול המשלב הגברה של רקומבינאז פולימראז עם מערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA ובונים מיקרוסקופ סמארטפון נייד עם סיווג בעזרת בינה מלאכותית לזיהוי נגיפי DNA נקודתיים.

מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase ...

הפרוטוקול שלנו מציג מערכת זיהוי מהירה ורגישה ביותר לנגיף צפרדע 3. באופן משמעותי, שיטה זו מאפשרת זיהוי נקודתי של נגיפי DNA, הממלאים תפקיד מכריע במניעת הופעתן של מחלות פנדמיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו טמון בשילוב של RPA עם מערכת CRISPR/Cas12a, בתוספת מיקרוסקופ נייד מבוסס סמארטפון וסיווג AI.שילוב זה משפר באופן משמעותי את יעילות הזיהוי והדיוק ובו זמנית מפחית טעויות המיוחסות לגורמים אנושיים. כדי להתחיל, הוסף את ארבעת אנזימי RPA העיקריים במאגר התגובה. לאחר מכן הוסיפו לתערובת את הפריימרים המעוצבים מראש.מערבבים היטב את התערובת. הוסיפו מיקרוליטר אחד של דנ"א המטרה המתקבל מווירוס צפרדע 3 לכל תגובת RPA, ומערבלים כדי להתערבב היטב. לאחר מכן, פיפטה שבעה מיקרוליטר של 100 מילימולר מגנזיום כלורי כדי ליזום את התגובה.לדגור על התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להשלים את הבדיקה. הכינו את החיידק Lachnospiraceae CAS12a חלבון עם CRISPR RNA ליצירת קומפלקסים פונקציונליים. ערבבו את החלבון החיידקי ואת מאגר התגובה 10 X CRISPR/Cas12a.כעת הוסף 500 ננו-מולרית חד-גדילית גשושית כתב DNA. הוסף מיקרוליטר אחד של מוצר תגובת RPA לתערובת תגובת CRISPR/Cas12a CRISPR RNA. דוגרים על התערובת בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות.מדוד את האותות הפלואורסצנטיים באמצעות קורא מיקרו-לוחות. לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ סמארטפון, ראשית, יש לדחוס את תערובת התגובה המוכנה על מגלשת זכוכית נסוגה. לאחר מכן מכסים אותו בכיסוי לפני הדגירה.מקם את השקופית על במת המיקרוסקופ של הטלפון החכם, וכוונן את אורך המוקד והבהירות. צלם תמונה כדי למדוד את האותות הפלואורסצנטיים. השתמשו ב- ImageJ כדי למדוד את הערך האפור הממוצע של כל תמונה ואת סטיית התקן של הערך האפור הממוצע בקבוצת ריכוז.אמצו את מודל הלמידה העמוקה AlexNet 33 לסיווג. כעת השתמש ב- Python כדי לעצב מחדש את תמונות הקלט ל- 224 על 224 על ידי שלושה ערוצים. לבסוף, השתמש ברשת עמוד שדרה מאומנת מראש עם ערכת נתונים של ImageNet כדי לחלץ תכונות תמונה.זוג הפריימרים השישי סיפק את יעילות ההגברה המרבית, ונבחרו. CRISPR RNA-3 התגלה כיעיל ביותר עבור מחשוף בטחוני. השימוש במערכת זיהוי מפותחת עם פריימרים נבחרים של RPA ו-CRISPR RNA הביא להבדלים משמעותיים בין FV3 של 10 aM לבין הבקרה.הנקודה החשובה ביותר שיש לזכור היא שלב זיהוי CAS 12a הספציפי. ניתן לשנות או לעצב מחדש את ה-CRISPR RNA של התגובה כך שתתמקד בנגיפי DNA אחרים בהתבסס על זיהוי CAS 12a. השיטה המוצעת יכולה לסייע בהערכה ראשונית של כמות נגיף היעד.בהתבסס על כך, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו qPCR כדי להשיג עומס נגיפי מדויק יותר. טכניקה זו מספקת ניסיון ראשוני לקראת זיהוי נייד של נגיפי DNA. באשר וירוס צפרדע 3 המשמש בפרוטוקול זה, זיהוי בזמן יכול להניע אמצעי הגנה יעילים, הפחתת הפסדים בתעשיית הרבייה.

dna-virus-detection-system-based-on-rpa-crisprcas12a-spm-deep

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מציגים גישה חדשה לזיהוי וירוסים עם כפול-גדיל DNA הגנום. אנו משתמשים בשיטות הרגילות כדי לחלץ DNA ו- RNA עלים נגועים ולבצע רצף הדור הבא. כלים Bioinformatic להרכיב רצפים לתוך contigs, לזהות contigs המייצג את הגנום של וירוס והקצה הגנום לקבוצות בטקסונומיה.

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

כפול גדילי RNA שהופק במהלך שכפול וירוס רנ א ניתן לזהות על ידי קולטנים זיהוי תבנית כדי ליצור תגובה חיסונית מולדת. וירוסים RNA שלילי-סנס, האינטראקציה בין dsRNA ברמה נמוכה PRRs עדיין לא ברור. פיתחנו שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית להמחיש arenavirus dsRNA ו- PRR בתאים בודדים.

הדמיה קונאפוקלית של זוגיות גדילי RNA ודפוס זיהוי רצפטורים להדבקת וירוס RNA שלילי-סנס

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

פרוטוקול זה מספק את השלבים החל מיצוי DNA ועד לערך ניסיוני עבור PCR טיפה דיגיטלית (ddPCR), כולל ניתוח לזיהוי וכימות של אירועי הצטרפות קצה לא הומולוגיים (NHEJ) באתרי יעד לאחר מחשוף Cas9 המושרה על ידי gRNA ותיקון DNA. שימושים אחרים בשיטה זו כוללים יישומים כגון זיהוי פולימורפיזם ואימות וריאנט עריכת גנים.

PCR טיפה דיגיטלית כדי לזהות מוטציות indels באוכלוסיות יתושים אנופלין מהונדס גנטית

בעבודה זו פותחה שיטת זיהוי מהירה, רגישה וניידת עבור Candidatus Liberibacter asiaticus המבוססת על הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a.

זיהוי קנדידטוס ליבריבקטר אסיאטיקוס הניתן לפריסה בשטח באמצעות הגברה של רקומבינאז פולימראז בשילוב עם CRISPR-Cas12a

מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר שולבו בתוכנית של שערים בוליאניים בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae). המעגלים הלוגיים הקטנים החדשים הראו ביצועים טובים והעמיקו את ההבנה של גורמי שעתוק מבוססי dCas9/dCas12a והתכונות של חלבונים אנטי-קריספר.

מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

כאן, אנו מציגים את ההכנה שלב אחר שלב של הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז מעורבבת מראש, ליופילית ותגובות מבוססות Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), אשר ניתן להשתמש בהן לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין של פתוגנים של מחלות זיהומיות או סמנים גנטיים אחרים בעלי עניין.

אבחון מבוסס קריספר נקודתי עם ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה

כדי להקל על הזיהוי המהיר והמדויק של Acinetobacter baumannii, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בהגברה רקומבינאז פולימראז (RPA) בשילוב עם אנדונוקלאז LbaCas12a לזיהוי זיהומי A. baumannii .

זיהוי מהיר וספציפי של זיהומי אצינטובקטר באומני באמצעות הגברת פולימראז רקומבינאז/מערכת מבוססת Cas12a

בפרוטוקול זה, מבחן CRISPR/Cas12a משולב להגברת פולימראז רקומבינאז מודגם לזיהוי הפתוגן הצמחי הפולש, Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical race 4.

בדיקת הגברה משולבת של פולימראז רקומבינאז CRISPR/Cas12a לאיתור Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

כאן, אנו מתארים הליך פשוט ומהיר לזיהוי DNA מפתוגנים של דבורים, כגון Lotmaria passim ו-Nosema ceranae, באמצעות ליזיס תאים מוכן להגברה, הגברת פולימראז רקומבינאז ומבחני CRISPR/Cas12a.

זיהוי DNA באתר של טפילים טריפנוזומטיים ו-nosema ceranae באמצעות ליזה אלקליין בשילוב עם מערכת RPA/CRISPR/Cas12a

למדו שיטת זיהוי מהירה ורגישה לנגיפי DNA באמצעות RPA-CRISPR/Cas12a ולמידה עמוקה. מערכת זו מאפשרת אבחון נקודתי של frog virus 3 ומונעת התפרצויות מגפה.

מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה

גלה סרטונים נוספים