מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה
10 במאי 2024
אנו מציגים פרוטוקול המשלב הגברה של רקומבינאז פולימראז עם מערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA ובונים מיקרוסקופ סמארטפון נייד עם סיווג בעזרת בינה מלאכותית לזיהוי נגיפי DNA נקודתיים.
הפרוטוקול שלנו מציג מערכת זיהוי מהירה ורגישה ביותר לנגיף צפרדע 3. באופן משמעותי, שיטה זו מאפשרת זיהוי נקודתי של נגיפי DNA, הממלאים תפקיד מכריע במניעת הופעתן של מחלות פנדמיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו טמון בשילוב של RPA עם מערכת CRISPR/Cas12a, בתוספת מיקרוסקופ נייד מבוסס סמארטפון וסיווג AI.
שילוב זה משפר באופן משמעותי את יעילות הזיהוי והדיוק ובו זמנית מפחית טעויות המיוחסות לגורמים אנושיים. כדי להתחיל, הוסף את ארבעת אנזימי RPA העיקריים במאגר התגובה. לאחר מכן הוסיפו לתערובת את הפריימרים המעוצבים מראש.
מערבבים היטב את התערובת. הוסיפו מיקרוליטר אחד של דנ"א המטרה המתקבל מווירוס צפרדע 3 לכל תגובת RPA, ומערבלים כדי להתערבב היטב. לאחר מכן, פיפטה שבעה מיקרוליטר של 100 מילימולר מגנזיום כלורי כדי ליזום את התגובה.
לדגור על התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להשלים את הבדיקה. הכינו את החיידק Lachnospiraceae CAS12a חלבון עם CRISPR RNA ליצירת קומפלקסים פונקציונליים. ערבבו את החלבון החיידקי ואת מאגר התגובה 10 X CRISPR/Cas12a.
כעת הוסף 500 ננו-מולרית חד-גדילית גשושית כתב DNA. הוסף מיקרוליטר אחד של מוצר תגובת RPA לתערובת תגובת CRISPR/Cas12a CRISPR RNA. דוגרים על התערובת בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות.
מדוד את האותות הפלואורסצנטיים באמצעות קורא מיקרו-לוחות. לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ סמארטפון, ראשית, יש לדחוס את תערובת התגובה המוכנה על מגלשת זכוכית נסוגה. לאחר מכן מכסים אותו בכיסוי לפני הדגירה.
מקם את השקופית על במת המיקרוסקופ של הטלפון החכם, וכוונן את אורך המוקד והבהירות. צלם תמונה כדי למדוד את האותות הפלואורסצנטיים. השתמשו ב- ImageJ כדי למדוד את הערך האפור הממוצע של כל תמונה ואת סטיית התקן של הערך האפור הממוצע בקבוצת ריכוז.
אמצו את מודל הלמידה העמוקה AlexNet 33 לסיווג. כעת השתמש ב- Python כדי לעצב מחדש את תמונות הקלט ל- 224 על 224 על ידי שלושה ערוצים. לבסוף, השתמש ברשת עמוד שדרה מאומנת מראש עם ערכת נתונים של ImageNet כדי לחלץ תכונות תמונה.
זוג הפריימרים השישי סיפק את יעילות ההגברה המרבית, ונבחרו. CRISPR RNA-3 התגלה כיעיל ביותר עבור מחשוף בטחוני. השימוש במערכת זיהוי מפותחת עם פריימרים נבחרים של RPA ו-CRISPR RNA הביא להבדלים משמעותיים בין FV3 של 10 aM לבין הבקרה.
הנקודה החשובה ביותר שיש לזכור היא שלב זיהוי CAS 12a הספציפי. ניתן לשנות או לעצב מחדש את ה-CRISPR RNA של התגובה כך שתתמקד בנגיפי DNA אחרים בהתבסס על זיהוי CAS 12a. השיטה המוצעת יכולה לסייע בהערכה ראשונית של כמות נגיף היעד.
בהתבסס על כך, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו qPCR כדי להשיג עומס נגיפי מדויק יותר. טכניקה זו מספקת ניסיון ראשוני לקראת זיהוי נייד של נגיפי DNA. באשר וירוס צפרדע 3 המשמש בפרוטוקול זה, זיהוי בזמן יכול להניע אמצעי הגנה יעילים, הפחתת הפסדים בתעשיית הרבייה.
סקירה כללית
מחקר זה מציג מערכת זיהוי מהירה ורגישה עבור frog virus 3, תוך דגש על שילוב של הגברת פולימראז באמצעות רקומבינאזה (RPA) עם מערכת CRISPR/Cas12a כדי לאפשר זיהוי של נגיפי DNA בנקודת הטיפול (point-of-care). שיטה חדשנית זו שואפת להגביר את דיוק ויעילות הזיהוי, דבר שהוא קריטי למניעת התפרצויות פנדמיות פוטנציאליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- ביולוגיה מולקולרית
- גילוי פתוגנים
- אבחון בנקודת הטיפול
רקע
- החשיבות של זיהוי ויראלי מהיר במניעת פנדמיות.
- שילוב של מתודולוגיות מתקדמות כגון טכנולוגיות RPA ו-CRISPR.
- תפקידם של מערכות ניידות בהערכות אבחוניות מוכנות לשטח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הגברה רבובת פולימראז רקומבינאזה (RPA)
- מערכת CRISPR/Cas12a
- מיקרוסקופיה מבוססת סמארטפון עם סיווג מונחה בינה מלאכותית (AI)
תוצאות עיקריות
- בידול משמעותי בין דגימות FV3 בריכוז 10 aM לבין דגימות הביקורת.
- דיוק גילוי משופר באמצעות שימוש בפריימרים ספציפיים וב-CRISPR RNA.
- פוטנציאל להתאמת השיטה לנגיפי DNA אחרים על ידי שינוי ה-CRISPR RNA.
מסקנות
- המחקר מדגים שיטת זיהוי ניידת ויעילה עבור נגיפי DNA.
- גישה זו רלוונטית לנקיטת אמצעי הגנה מהירים בתעשיית הגידול, וממחישה את חשיבותה למחקר ביולוגי ולבריאות הציבור.
שאלות נשאלות שכיחוק
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכות מהירות וניידות לגילוי נגיפי DNA הן קריטיות להתערבות מוקדמת ולהכלה, הן במסגרות מחקריות והן בסביבות ביו-פארמצבטיות יישומיות. השילוב של RPA-CRISPR/Cas12a עם מיקרוסקופיה מבוססת סמארטפון ולמידה עמוקה מאפשר גילוי רגיש וספציפי-רצף בנקודת הטיפול, ובכך מפחית את התלות במעבדות מרכזיות. גישה זו תומכת בקבלת החלטות מואצת ובצמצום סיכונים לאורך תהליכי הגילוי והתרגום הקליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה מהירה של מטרות DNA ויראליות לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של ריאגנטים לזיהוי ושל CRISPR guide RNAs.
- מסייע במיון בשלב מוקדם של מערכות זיהוי מועמדות לצורך קידום הפורטפוליו.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק קריאה כמותית וסטנדרטית לצורך אופטימיזציה ותיקוף של הבדיקה.
- מאפשר תהליכי זיהוי הניתנים לשחזור ולהרחבה, המתאימים לסריקה בתפוקה גבוהה (high-throughput screening).
- תומך בהשוואה חזקה של יעילות הפריימרים ושל ה-CRISPR RNA לצורך דיוק הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי מתן אפשרות לגילוי נגיפי שניתן להטמיע בשטח.
- תומך ברצף מהשלב של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות פלטים כמותיים וניידים.
- מפחית סיכון ביולוגי על ידי מתן אפשרות לגילוי והתערבות בזמן במודלים רלוונטיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מערכת זו מגשרת בין גילוי מוקדם, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי, על ידי אספקת פלטפורמה ניידת לגילוי כמותי הניתנת להתאמה למספר וירוסי DNA.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות ובתיקוף מטרות באמצעות זיהוי ספציפי לרצף.
- סריקה: מספק פלטי פלואורסצנציה כמותיים הניתנים לשחזור עבור סטנדרטיזציה של בדיקות.
- אנליטיקה: משלב סיווג מבוסס למידה עמוקה לצורך פרשנות אובייקטיבית ובעלת רמת ביטחון גבוהה של התוצאות.
- מחקר תרגומי: מאפשר זיהוי מהיר ומוכן לעבודה בשטח התומך במחקרים פרה-קליניים ובמחקרי סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה למטרות ויראליות חדשות באמצעות עיצוב מחדש של מדריכי CRISPR RNA.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בזיהוי נגיפי.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של תהליכי עבודה של זיהוי.
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום מהיר של טכנולוגיות זיהוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית ובתכנון בדיקות CRISPR.
- דורש גישה למכשירי דימוי ניידים ותשתיות מחשוב לניתוח AI.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי בדיקה ופירוש נתונים.
- ניתן להתאמה לווירוסים של DNA שונים על ידי שינוי רצפי ה-CRISPR RNA.
- תלוי בתיקוף ראשוני לפני פריסה בסביבות שטח מגוונות.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:40
Combining Recombinase Polymerase Amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a Systems for the Detection of DNA Viruses
1:20
CRISPR/Cas12a Detection With/Without Smartphone Microscopy (SPM)
2:23
Data Augmentation and Transfer Learning
2:58
Results: AI-Detection of DNA Virus Using RPA-CRISPR/Cas12a-SPM
3:26
Conclusion
