DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

Changyue Liu; Zhengyang Lei; Lijin Lian; Likun Zhang; Zhicheng Du; Peiwu Qin

doi:10.3791/64833

מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה

JoVE Journal
Biology
Author Produced

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

מערכת זיהוי וירוסי DNA מבוססת על RPA-CRISPR/Cas12A-SPM ולמידה עמוקה

Full Text

1,503 Views

04:17 min

May 10, 2024

DOI: 10.3791/64833-v

Changyue Liu*^1,2, Zhengyang Lei*^1,2, Lijin Lian², Likun Zhang^1,2, Zhicheng Du^1,2, Peiwu Qin^1,2

¹Center of Precision Medicine and Healthcare,Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, ²Institute of Biopharmaceutics and Health Engineering,Tsinghua Shenzhen International Graduate School

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a rapid and sensitive detection system for frog virus 3, emphasizing the integration of recombinase polymerase amplification (RPA) with the CRISPR/Cas12a system to enable point-of-care detection of DNA viruses. This innovative method aims to enhance detection accuracy and efficiency, which is crucial in preventing potential pandemic outbreaks.

Key Study Components

Research Area

Molecular biology
Pathogen detection
Point-of-care diagnostics

Background

The significance of rapid viral detection in preventing pandemics.
Integration of advanced methodologies like RPA and CRISPR technology.
The role of portable systems in field-ready diagnostic assessments.

Methods Used

Recombinase polymerase amplification (RPA)
CRISPR/Cas12a system
Smartphone-based microscopy with AI-assisted classification

Main Results

Significant differentiation between 10 aM FV3 and control samples.
Enhanced detection accuracy through the use of specific primers and CRISPR RNA.
Potential for adapting the method for other DNA viruses by modifying CRISPR RNA.

Conclusions

The study demonstrates an efficient portable detection method for DNA viruses.
This approach is relevant for timely protective measures in the breeding industry, illustrating its importance in biological research and public health.

Frequently Asked Questions

What is the primary application of this detection system?

The system is designed for point-of-care detection of DNA viruses, enabling rapid diagnostic results.

Which virus is primarily studied in this protocol?

Frog virus 3 is the main focus of the detection method outlined in this study.

How does the integration of RPA and CRISPR/Cas12a improve detection?

This integration enhances efficiency and accuracy while minimizing human error in the detection process.

What technological innovations are used in this protocol?

The protocol utilizes a portable smartphone microscope and AI-assisted classification for analyzing results.

Can the methodology be adapted for other viruses?

Yes, the CRISPR RNA can be modified to target other DNA viruses, making the technique versatile.

What is the significance of this study in terms of public health?

Timely detection and effective responses to viral outbreaks can help mitigate economic losses and health risks in breeding industries.

What role does AI play in the detection process?

AI assists in classifying the results obtained from the smartphone microscopy images, thus improving accuracy.

אנו מציגים פרוטוקול המשלב הגברה של רקומבינאז פולימראז עם מערכת CRISPR/Cas12a לאיתור עקבות של נגיפי DNA ובונים מיקרוסקופ סמארטפון נייד עם סיווג בעזרת בינה מלאכותית לזיהוי נגיפי DNA נקודתיים.

הפרוטוקול שלנו מציג מערכת זיהוי מהירה ורגישה ביותר לנגיף צפרדע 3. באופן משמעותי, שיטה זו מאפשרת זיהוי נקודתי של נגיפי DNA, הממלאים תפקיד מכריע במניעת הופעתן של מחלות פנדמיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו טמון בשילוב של RPA עם מערכת CRISPR/Cas12a, בתוספת מיקרוסקופ נייד מבוסס סמארטפון וסיווג AI.

שילוב זה משפר באופן משמעותי את יעילות הזיהוי והדיוק ובו זמנית מפחית טעויות המיוחסות לגורמים אנושיים. כדי להתחיל, הוסף את ארבעת אנזימי RPA העיקריים במאגר התגובה. לאחר מכן הוסיפו לתערובת את הפריימרים המעוצבים מראש.

מערבבים היטב את התערובת. הוסיפו מיקרוליטר אחד של דנ"א המטרה המתקבל מווירוס צפרדע 3 לכל תגובת RPA, ומערבלים כדי להתערבב היטב. לאחר מכן, פיפטה שבעה מיקרוליטר של 100 מילימולר מגנזיום כלורי כדי ליזום את התגובה.

לדגור על התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להשלים את הבדיקה. הכינו את החיידק Lachnospiraceae CAS12a חלבון עם CRISPR RNA ליצירת קומפלקסים פונקציונליים. ערבבו את החלבון החיידקי ואת מאגר התגובה 10 X CRISPR/Cas12a.

כעת הוסף 500 ננו-מולרית חד-גדילית גשושית כתב DNA. הוסף מיקרוליטר אחד של מוצר תגובת RPA לתערובת תגובת CRISPR/Cas12a CRISPR RNA. דוגרים על התערובת בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות.

מדוד את האותות הפלואורסצנטיים באמצעות קורא מיקרו-לוחות. לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ סמארטפון, ראשית, יש לדחוס את תערובת התגובה המוכנה על מגלשת זכוכית נסוגה. לאחר מכן מכסים אותו בכיסוי לפני הדגירה.

מקם את השקופית על במת המיקרוסקופ של הטלפון החכם, וכוונן את אורך המוקד והבהירות. צלם תמונה כדי למדוד את האותות הפלואורסצנטיים. השתמשו ב- ImageJ כדי למדוד את הערך האפור הממוצע של כל תמונה ואת סטיית התקן של הערך האפור הממוצע בקבוצת ריכוז.

אמצו את מודל הלמידה העמוקה AlexNet 33 לסיווג. כעת השתמש ב- Python כדי לעצב מחדש את תמונות הקלט ל- 224 על 224 על ידי שלושה ערוצים. לבסוף, השתמש ברשת עמוד שדרה מאומנת מראש עם ערכת נתונים של ImageNet כדי לחלץ תכונות תמונה.

זוג הפריימרים השישי סיפק את יעילות ההגברה המרבית, ונבחרו. CRISPR RNA-3 התגלה כיעיל ביותר עבור מחשוף בטחוני. השימוש במערכת זיהוי מפותחת עם פריימרים נבחרים של RPA ו-CRISPR RNA הביא להבדלים משמעותיים בין FV3 של 10 aM לבין הבקרה.

הנקודה החשובה ביותר שיש לזכור היא שלב זיהוי CAS 12a הספציפי. ניתן לשנות או לעצב מחדש את ה-CRISPR RNA של התגובה כך שתתמקד בנגיפי DNA אחרים בהתבסס על זיהוי CAS 12a. השיטה המוצעת יכולה לסייע בהערכה ראשונית של כמות נגיף היעד.

בהתבסס על כך, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו qPCR כדי להשיג עומס נגיפי מדויק יותר. טכניקה זו מספקת ניסיון ראשוני לקראת זיהוי נייד של נגיפי DNA. באשר וירוס צפרדע 3 המשמש בפרוטוקול זה, זיהוי בזמן יכול להניע אמצעי הגנה יעילים, הפחתת הפסדים בתעשיית הרבייה.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos