בידוד קריפטים במעי: שיטה לבידוד קריפטות שלמות ממודל המעי הדק של מורין

רירית המעי מכוסה בבליטות או וילי ופלישות או קריפטות. קריפטות הן בלוטות המעיים המפרישות בעיקר אנזימי עיכול.

כדי לבודד קריפטות מעיים דקים, התחל במיקום עכבר מורדם במצב שכיבה על לוח דיסקציה. בעזרת מספריים, נתחו את הצפק לאורך כדי לחשוף את מערכת העיכול.

אתר את המעי הדק ומשוך אותו בעדינות מגוף העכבר. חותכים את המעי בבסיסו. העבירו את המעי שנקטף לכלי המכיל חיץ מתאים. חותכים את המעי לאורך, חושפים את הלומן.

הניחו את המעי, עם הצד הלומינלי כלפי מעלה, על קרש חיתוך כדי לחשוף את הווילי. הזיזו מגלשת זכוכית זוויתית על פני המעי כדי לגרד את הווילי, וחשפו את כל הקריפטות.

חותכים את המעי לחתיכות זעירות, ומעבירים את החתיכות לצינור המכיל חיץ קר כקרח כדי להבטיח נזק מינימלי לקריפטות.

לאחר מכן, טפלו ב-EDTA ודגרו. EDTA גורם לכל הקריפטות להתרופף מרירית המעי. הסר את התמיסה המכילה EDTA משומשת. הוסף חיץ טרי וטריטוראט באמצעות פיפטה כדי לנתק את הקריפטות מרירית המעי.

אספו את הסופרנטנט המכיל את הקריפטות לתוך שפופרת חדשה. השלם את הצינור עם מדיום תרבית מתאים וצנטריפוגה כדי לגלול את הקריפטות.

נתח את הצפק לאורך בעזרת מספריים. החזיקו את הבטן עם המלקחיים וחתכו אותה לרוחב לשניים בעזרת מספריים מעיים מנקודה זו ואילך. שולפים את המעי ומניחים אותו בצלחת פטרי המכילה PBS. התחל בהנחת הקצה הקהה לתוך הבטן ודחף אותו בעדינות דרך הפילורוס.

המשך בחיתוך עם המספריים ומשיכה בעזרת המלקחיים. לאחר שכל המעי הדק פתוח לאורך, שטפו אותו ב-PBS קר על ידי החזקתו עם המלקחיים ושטיפה עדינה בתמיסת PBS בתנועות בצורת U. לאחר ניקוי כל שאריות הצואה, המשך לשטח את המעי על קרש חיתוך עם הצד הלומינלי כלפי מעלה.

לזהות בקלות את הצד הלומינלי על ידי היעדר כלי דם ועל ידי מראהו החיוור בהשוואה לחלק החיצוני. בעזרת מגלשת זכוכית, הסירו בעדינות את הווילה על ידי גירוד המעי השטוח. בצע שלב זה פעמיים לכל אורך הרקמה. לאחר מכן, חותכים את המעי הדק בעזרת להב כירורגי סטרילי לחתיכות של 2 עד 5 מילימטרים.

הניחו את שברי המעי הדק בצינור של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר PBS קר כקרח. נקה את שברי הרקמה והסר את כל הזיהומים שנותרו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ב-PBS. השליכו את ה-supernatant וחזרו על שלב זה עד שה-PBS יהיה צלול לחלוטין. לאחר מכן, הוסף 15 מיליליטר PBS קר כדי להביא את הנפח הסופי הכולל של PBS ל-25 מיליליטר. הוסיפו 2 מילי-מולרי EDTA ודגרו במשך 45 דקות על רולר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

לאחר השלכת ה-PBS/EDTA, הוסיפו 10 מיליליטר של PBS ונתקו את הקריפטות על ידי פיפטינג קשה של שברי הרקמה למעלה ולמטה. לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט. חזור על השלב ארבע פעמים. הוסף מדיום תרבית כדי להגיע לנפח סופי של 50 מיליליטר. גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה. לבסוף, השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית לפני גלולת הקריפטות על ידי צנטריפוגה.