מחסום גידול דם-מוח או מודל BBTB: התאמה של מחסום הדם-מוח או מודל BBB להערכת מתן טיפולים לגידול

מחסום הדם-מוח, או BBB, הוא מחסום סלקטיבי של תאי אנדותל ותאי מוח כגון אסטרוציטים המווסת את הובלת החומרים בין הדם למוח.

כדי לפתח מודל BBB, הפוך תוספת ממברנה על מכסה צלחת תרבית.

זרע אסטרוציטים מעל הממברנה. הניחו את צלחת התרבות מעל התוספת ודגרו.

זה לוכד את האסטרוציטים בין הממברנה למשטח הבאר.

החזירו את הצלחת כדי להביא אסטרוציטים לתחתית והוסיפו מדיום מתאים לבאר.

לתוספת, הוסף תאי אנדותל המבטאים חלבוני צומת הדוקים אופטימליים המשפרים את המגעים בין תא לתא הנחוצים להיווצרות מחסום.

דגירה כדי לאפשר לתאי אנדותל להיצמד לממברנה.

הסר את המדיום המושקע והעביר את התוספת למדיום אסטרוציטים אחר המכיל היטב ללא גורמי גדילה.

לאחר מכן, הוסף מדיום תאי אנדותל נטול גורם גדילה לתוספת ודגירה.

היעדר גורמי גדילה מעכב את חלוקת התאים, שומר על מגעים בין תאים ומייצב את תכונות המחסום.

תאי האנדותל והאסטרוציטים מתקשרים ויוצרים קרום בסיסי עם צמתים הדוקים כמו ה-BBB.

לאחר מכן, זרעי גליומה ספרואידים בבאר תרבית חדשה.

העבירו את מודל ה-BBB על הספרואידים הללו ודגרו ליצירת מחסום גידול הדם-מוח או מודל BBTB.

הוסף מולקולות מטרה למודל BBTB כדי להעריך את מסירתן לאתר הגידול.

מתחת למכסה המנוע של תרבית תאים סטרילית, שטפו בזהירות את האסטרוציטים המתורבתים עם 5 מיליליטר PBS סטרילי. השתמש במשאבת ואקום כדי להשליך בעדינות את ה-PBS ולהוסיף 2 מיליליטר של מגיב דיסוציאציה של תאים למשך 5 דקות כדי לנתק את התאים.

לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של מדיום תרבית תאי אסטרוציטים שלם סטרילי לכלי כדי לעכב את הפעילות של מגיב הדיסוציאציה של התאים. השתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית כדי להעביר את התאים המנותקים מהכלי לצינור סטרילי של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה בחום של 250 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, הניחו את התוספות. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח את התוספות כשצד המוח כלפי מעלה על מכסה של צלחת סטרילית עם 6 בארות.

לאחר השלמת הצנטריפוגה, השליכו בזהירות את הסופרנטנט מתרחיף התא והשעו מחדש את כדור האסטרוציטים ב-1 מיליליטר של ABM פלוס על ידי פיפטינג עדין של הגלולה על דופן הצינורות עד חמש פעמים.

לאחר מכן, ספרו את התאים והתאימו את צפיפות תרחיף התאים ל-150,000 תאים ב-400 מיקרוליטר ABM פלוס לכל תוספת. הנח את תרחיף התאים הזה באמצע הצד המוחי של קרום התוספת ופזר אותו בזהירות באמצעות כוח נימי עם קצה פיפטה סטרילי.

כשצד המוח של התוספות עדיין למעלה, הנח את צלחת 6 הבארות בחזרה על התוספות. הניחו את הצלחת והתוספות כשצד המוח כלפי מעלה לתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר הידבקות של תאים.

לאחר מכן, החזר את צלחת 6 הבארות בחזרה למקומה הרגיל כשהתוספות כעת בצד הדם כלפי מעלה. הוסף מדיום והמשך את הדגירה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מתחת למכסה המנוע של תרבית תאים סטרילית, יש לשטוף בזהירות את תאי האנדותל המתורבתים עם 5 מיליליטר PBS סטרילי.

השתמש במשאבת ואקום כדי להשליך בעדינות את ה-PBS ולהוסיף 2 מיליליטר של מגיב דיסוציאציה של תאים למשך 5 דקות כדי לנתק את התאים. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של מדיום תרבית תאי אנדותל שלם סטרילי לכלי כדי לעכב את פעילות מגיב הדיסוציאציה של התאים.

השתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית כדי להעביר את התאים המנותקים מהכלי לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה בחום של 250 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור תאי האנדותל במיליליטר אחד של EBM פלוס על ידי פיפטינג איטי של תרחיף התאים על דופן הצינור עד חמש פעמים.

ספרו את התאים והתאימו את צפיפות תרחיף התאים ל-200,000 תאים ב-2.5 מיליליטר של תרבית תאי אנדותל, נטולי גורם גדילה אנדותל בסרום וכלי דם-A לכל הוספה. אחזר את הצלחת המכילה את התוספות.

השליכו בזהירות את המדיום מצד הדם והחליפו אותו ב-2.5 מיליליטר של תרחיף תאי אנדותל. לאחר מכן, החזירו את הצלחת לאינקובטור והשאירו אותה למשך הלילה כדי לאפשר לתאי האנדותל להיצמד לממברנה.

למחרת, הכינו צלחת בת 6 בארות על ידי העברת 3 מיליליטר ABM מחומם מראש מינוס לכל באר. בעזרת מלקחיים סטריליים, טפל בתוספות כדי להשליך בזהירות את המדיום השלם האנדותל מצד הדם והנח את התוסף בצלחת החדשה המכילה ABM מינוס. לאחר מכן, הוסף 2.5 מיליליטר EBM מינוס.

השאירו את התוספות בחממה עם הפרעה פיזית מינימלית או שינוי טמפרטורה למשך 5 ימים. ביום ההעברה, החלף את המדיום. להדמיה אימונופלואורסצנטית, הנח עד ארבעה כיסויי בורוסיליקט סטריליים עגולים בכל באר של צלחת בת 6 בארות, המכילה 2 מיליליטר פולי-D-ליזין. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

בינתיים, השתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית כדי להעביר בזהירות את כדורי הגידול מכלי תרבית התאים לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את כדורי הגידול ב-250 x גרם למשך 3 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו בעדינות את הכדורים במיליליטר של GBM מינוס.

ספור את התאים והתאם את צפיפות התאים לכ-10,000 כדורים או 100,000 תאים למיליליטר GBM מינוס. לאחר מכן, השליכו את הפולי-D-ליזין מהבארות ושטפו את הבארות שלוש פעמים עם PBS סטרילי. זרע כל באר של הצלחת עם 3 מיליליטר של תרחיף הספרואיד של הגידול והעביר את התוספות עם חיקוי BBTB על תרחיף תאי הגידול.

דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר לאתרי גידול הדם והמוח של הבדיקה להגיע לשיווי משקל. למחרת, החליפו את המדיה בצד הדם ב-EBM מינוס בתוספת מולקולות, תרופות או ננו-חלקיקים מעניינים.