שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

הליך זה נועד לסימולציה חוץ גופית של מחסום הדם-מוח על ידי תרבית משותפת של אסטרוציטים ותאי אנדותל בצדדים מנוגדים של קרום נקבובי. ראשית מצפים את המשטח הלומינלי של הממברנה הנקבובית במטריצה חוץ-תאית. חלבון כמו קולגן מתאים לתוספת ההפוכה עם צינור סיליקון חיצוני ותקע סיליקון פנימי ליצירת באר נשלפת מעל פני השטח של הממברנה.

כעת זרעו את תאי האסטרוציטים על התוספת ההפוכה כך שהם נדבקים למשטח האלומינלי. לאחר מכן הסר את הצינור והנח את התוספת בכיוון הרגיל שלה בתוך באר מלאה בינונית. לאחר מכן זרעו את תאי האנדותל לתוך התא הלומינלי של התוסף ותרבו במשותף עם האסטרוציטים המנוגדים.

בסופו של דבר, מעבר של עוקבים פלואורסצנטיים או רישום של התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל משמש למדידת שינויי חדירות ב-BBB במבחנה בתגובה לחומרים מעוררים שונים. מי שידגים את ההליך הזה יהיה מר בארי ניגו, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי, שבמהלך הדוקטורט שלו, פיתח את פרוטוקול הזריעה המותאם הזה שהשתמשנו בו כדי לדמות את מחסום הדם-מוח. היה לנו מושג לראשונה על הליך זה לאחר שבדקנו שיטות ישיבה גסות יותר והיה לנו תסכול רב מדליפה של מדיום דרך ההפסקה, כמו גם נפחים בינוניים קטנים.

זה הכתיב תקופות ישיבה קצרות ולא מספיקות של אסטרוציטים, שאנו מנסים להתמודד איתן בהליך שלנו. מניחים את תוספות תרבית הרקמה בבארות של צלחת 24 בארות. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר של 132 מיקרוגרם למיליליטר קולגן עכברוש, אחד לציפוי פני השטח הלומינליים של התוספות, דגרו למשך הלילה בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס על מנת להסיר כל חומצה שיורית, שטפו את שני הצדדים האלומינליים והלומינליים של התוספות במים מזוקקים כפולים.

לאחר מכן הפוך את התוספות והתאם בעדינות חתיכה קצרה של צינור סיליקון אלסטי סביב שפת הממברנה הנקבובית. בעצם יצירת באר חדשה מעל פני השטח האלומינליים. כדי לאטום את החלק התחתון.

הכן תקע עשוי צינורות סיליקון אטום בקצה אחד עם קצה חתוך של צינור PCR של 0.2 מיליליטר. כעת בעזרת מלקחיים סטריליים, הכנס את פקק הסיליקון לחלל הלומינלי וקדם אותו עד שהוא מגיע עד כמילימטר אחד עד שני מילימטרים מהממברנה. הזרע הבא, 40,000 אסטרוציטים ב-200 מיקרוליטר של מדיום התחזוקה שלהם ישירות לתוך הסיליקון הרבה מעל פני הממברנה האלומינלית.

כדי לנטר את מצב ההיצמדות של האסטרוציטים, השתמש בלוח סטנדרטי של 96 בארות מכיוון שיש לו שטח פנים זהה לזה של התוספת של 6.5 מילימטר ומאפשר. הדמיה קלה יותר של תאים על ידי זרע מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, נפח זהה של תרחיף תאי האסטרוציטים לתוך לוח 96 באר שמונה. זה ינוטר לאורך זמן כדי לקבוע מתי האסטרוציטים בבאר 96 ובהרחבה בקרום ההכנסה נדבקו מספיק כדי לשמור על סטריליות.

העבר את התוספות המורכבות בין שתי צלחות שש בארות כדי למזער את החשיפה לאוויר לא מסונן. מקמו את התאים באינקובטור כדי לאפשר לאסטרוציטים להידבק. הנח גם את צלחת הבקרה 96 באר לתוך החממה בשלב זה.

לאחר כארבע שעות, בדוק את באר הבקרה 96 כדי לראות אם האסטרוציטים נדבקו. אם כן, העבר את מכלול ההכנסה בחזרה למכסה המנוע של תרבית הרקמות. הסר בעדינות את צינורות הסיליקון החיצוניים והתקעים.

לאחר מכן החזר את התוספות לכיוון הזקוף הרגיל לבארות המכילות 800 מיקרוליטר לבאר של מדיום תחזוקת תאי אנדותל. ראה 20,000 תאי אנדותל במוח ב-200 מיקרוליטר על המשטח הלומינלי המצופה קולגן למשך שלושה ימים במדיום BEC ללא כל שינוי מדיה. לפני ניסויים.

שטפו את צינורות הסיליקון והתקעים באתנול לפני החיטוי לשימוש מאוחר יותר. כדי לעורר את מחסום המוח בדם במבחנה, ראשית, החלף את המדיה האלומינלית והלומינלית ב-600 מיקרוליטר ו-100 מיקרוליטר של מדיום becs חופשי בסרום בהתאמה. שאפו את הכביסה הלומינלית והחליפו ב-100 מיקרוליטר של חומר נטול סרום המכיל חומרים מעוררים.

אם משרים את ה-BBB במבחנה מהתא האסטרוציטי, יש לשאוב את המדיום האבלומינלי ולהחליף ב-600 מיקרוליטר של סרום ללא נסיוב. מדיום המכיל חומרים מעוררים ממשיך עם מבחני החדירות הפרא-תאיים או הטרנס-תאיים הסטנדרטיים של עוקבי התווית על מנת לבסס מודל מחסום דם-מוח במגע אנושי. אסטרוציטים ותאי אנדותל מוח אנושיים מעובדים על שלושה ממברנות נקבוביות מיקרוניות המאפשרות מעבר של אסטרוציטים וכפות רגליים למגע עם תאי אנדותל.

השיטה אפשרה תקופת זריעה אופטימלית ללא הפרעה של אסטרוציטים ו-becs, אשר בתורם נצמדים חזק למשטח הנקבובי עם אובדן תאים מינימלי וגדלים לשטף בשלושה ימים. לאחר הזריעה. שני סוגי התאים שומרים על הסמנים הספציפיים לתאים שלהם על ממברנות נקבוביות כפי שמצוין על ידי דפוסי הביטוי של חלבון חומצי סיבי גליה GFAP ב-SVGs ו-VWF NECs של גורם פון וונד.

בהתאם לתכונה הבסיסית ביותר של מודל BBB מגע, ה-NFE האסטרוציטי יכול לעבור דרך נקבוביות שלוש המיקרון לתוך התא הלומינלי. לפיכך, יכול להתקיים מגע פוטנציאלי בין SVG ו-BES היושבים על נקבוביות של ממד זה. יתר על כן, הדמיית SEM מצביעה על כך ש-SVG ו-BBC היו מסוגלים לגדול ישירות מעל נקבוביות הממברנה, תופעה התורמת באופן מלאכותי לתפקוד המחסום הפיזי של מודלים של מגע BBB במבחנה.

במחקר זה, נעשה שימוש במודל BBB במגע אנושי כדי לחקור את ההשפעה של חומר פיברינוליטי TPAA על ה-BBB. מחקרי מבחנה אלה מאשרים כי TPA אכן הגדיל את החדירות של ה-BBB השלם בריכוז ובאופן תלוי זמן, ששניהם היו בטווח רלוונטי פרמקולוגי. שינויים מורפולוגיים דרמטיים של אסטרוציטים SVG ניכרים על הממברנות הנקבוביות לאחר חשיפה ל-TPA, מה שמרמז על כך שתגובה אסטרוציטית ל-TPA עומדת בבסיס פתיחת BBB המושרה על ידי TPA.

שיטה זו מילאה תפקיד מפתח במחקר שלנו, שמטרתו לחקור כיצד מחסום הדם במוח מגיב לתרופה טרומבוליטית TPAA המשמשת בחולי שבץ להמסת קרישי דם. זוהי ההדגמה הראשונה של שיטה זו בספרות, ואנו מקווים שחוקרים אחרים יוכלו לאמץ אותה למטרותיהם.