שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

הליך זה נועד לסמלץ in vitro את מחסום הדם-מוח באמצעות תרבית משולבת (co-culturing) של אסטרוציטים ותאי אנדותל על שני צדדים מנוגדים של ממברנה נקבובית. ראשית, יש לצפות את המשטח הלומינלי של הממברנה הנקבובית במטריצה חוץ-תאית. חלבונים כגון קולגן מתאימים לאינסרט ההפוך עם צינור סיליקון חיצוני ופקק סיליקון פנימי, כדי ליצור באר נשלפת מעל המשטח האבלומינלי של הממברנה.

כעת זרעו את תאי האסטרוציטים על ההכנסה (insert) ההפוכה, כך שיידבקו למשטח האבלומינלי. לאחר מכן, הסירו את הצינור והניחו את ההכנסה בכיוונה הרגיל בתוך באר מלאה במצע. בשלב הבא, זרעו את התאים האנדותלייליים אל תוך התא הלומנלי של ההכנסה ובצעו תרבית משותפת (co-culture) עם האסטרוציטים שממול.

בסופו של דבר, מעבר של סמני פלואורסצנציה או מדידה של התנגדות חשמלית טרנס-אנדותליאלית משמשים למדידת שינויים בחדירות של מחסום הדם-מוח (BBB) במעבדה (in vitro) בתגובה לחומרים מעוררים שונים. מי שידגים הליך זה הוא מר בורי ניגו (Mr.Barry Nigo), פוסט-דוקטור במעבדתי, אשר במהלך לימודי הדוקטורט שלו פיתח את פרוטוקול הזריעה המודגש שבו השתמשנו כדי לדמות את מחסום הדם-מוח. הרעיון להליך זה עלה תחילה לאחר שבחנו שיטות זריעה פשוטות יותר וחווינו תסכול רב עקב דליפת המצע דרך הנקבים, כמו כן בשל נפחי מצע קטנים.

דבר זה הוביל לתקופות התיישבות קצרות ובלתי מספיקות של אסטרוציטים, נושא שאנו מנסים לפתור בפרוטוקול שלנו. מקם את תבתי תרבית הרקמה (inserts) בבארות של פלטה בעלת 24 בארות. לאחר מכן, הוסף 50 µL של קולגן של חולדה בריכוז 132 µg/mL, מסוג 1, כדי לצפות את המשטח הלומינלי של התבתים; דגרין בן לילה באינקובטור לח במטמפר של 37 °C על מנת להסיר שאריות חומצה, ושטוף הן את הצד האבלומינלי והן את הצד הלומינלי של התבתים במים מזוקקים פעמיים.

לאחר מכן הפכו את המכניסים והלבש בעדינות קטע קצר של צינור סיליקון גמיש מסביב לשוליים של הממברנה נקבובית. פעולה זו יוצרת למעשה באר חדשה מעל השטח האבלומינלי (abluminal), כדי לאטום את הצד התחתון.

הכינו פקק העשוי מצינור סיליקון, האיטור בקצהו בוצע באמצעות הקצה הגזור של מבחנה PCR בנפח 0.2 מיליליטר. כעת, בעזרת פינצטה סטרילית, הכניסו את פקק הסיליקון אל תוך החלל הלומינלי והעבירו אותו עד שיגיע למרחק של כמעט 1-2 מילימטרים מהממברנה. לאחר מכן, זרעו 40,000 אסטרוציטים ב-200 מיקרוליטר של מצע התחזוקה שלהם ישירות אל תוך באר הסיליקון שמעל פני השטח של הממברנה האבלומנלית.

כדי לנטר את מצב ההיצמדות של האסטרוציטים, השתמשו בלוחית 96 בארות סטנדרטית, מכיוון שיש לה את אותו שטח פנים כמו לה inserts בקוטר 6.5 מילימטר והיא מאפשרת ויזואליזציה קלה יותר של התאים באמצעות מיקרוסקופ בניגודיות של מופע. זרעו נפח זהה של תרחיף תאי האסטרוציטים לתוך לוחית ה-96 בארות. מצב זה ינוטר לאורך זמן כדי לקבוע מתי האסטרוציטים בלוחית ה-96 בארות, ובהמשך לכך גם בממברנת ה-insert, היצמדו מספיק כדי לשמור על סטריליות.

העבירו את האינסרטים המורכבים בין שתי פלטות שש-בארות כדי לצמצם את החשיפה לאוויר לא מסונן. הניחו את התאים באינקובטור כדי לאפשר לאסטרוציטים להיצמד. כמו כן, הכניסו את פלטת הבקרה בעלת 96 הבארות לאינקובטור בשלב זה.

לאחר כארבע שעות, בדקו את בורר הבקרה בלוח ה-96 כדי לראות אם האסטרוציטים נצמדו. אם כן, העבירו את מכלול המבטנה (insert assembly) בחזרה למנדף תרביות הרקמה. הסירו בעדינות את צינורות הסיליקון החיצוניים ואת הפקקים.

לאחר מכן, החזיר את ההכנסות (inserts) למצב זקיף רגיל לתוך בארות המכילות 800 µL לבער של תווך תחזוקה לתאי אנדותל. זרע 20,000 תאי אנדותל מוחיים ב-200 µL על פני השטח הלומנליים המצופים בקולגן לתרבית משותפת למשך שלושה ימים בתווך BEC, ללא החלפת תווך. לפני התחילת הניסוי.

שטפו את צינורות הסיליקון ואת הפקקים באתנול לפני עיקור באוטוקלב לשימוש מאוחר יותר. כדי להמריץ את מחסום הדם-מוח in vitro, תחילה, החליפו את המדיומים האבלומינליים והלומינליים ב-600 microliters וב-100 microliters של מצע becs נטול סרום, בהתאמה. שאבו את השטיפה הלומינלית והחליפו ב-100 microliters של מצע נטול סרום המכיל חומרי הגברה.

אם משרים את ה-BBB in vitro מהמדור האסטרוציטי, יש לשאוב את המצע האבלומינלי ולהחליפו ב-600 microliters של מצע נטול סרום המכיל חומרי גירוי. המשך בבדיקות חדירות פאראצלולריות או טרנסצלולריות סטנדרטיות של סמני התיוג כדי לבסס מודל של מחסום דם-מוח אנושי במגע. אסטרוציטים ותאי אנדותל מוחיים אנושיים מומתים גודלים על ממברנות נקבוביות של שלושה מיקרון המאפשרות מעבר של רגלי אסטרוציטים למגע עם תאי האנדותל.

השיטה אפשרה תקופת זריעה אופטימלית ובלתי פסקית של astrocytes ו-becs, אשר בתורם נצמדים בעוצמה למשטח נקבובי עם איבוד תאים מינימלי ומגיעים להתלכדות (confluency) תוך שלושה ימים לאחר הזריעה. שני סוגי התאים שומרים על הסממנים הספציפיים לתא על גבי קרומים נקבוביים, כפי שמעידי דפוסי הביטוי של glial fibrillary acidic protein GFAP ב-SVGs ו-von Willebrand factor VWF ב-NECs.

בהתאם למאפיין הבסיסי ביותר של מודל BBB במגע, ה-NFE האסטרוציטי יכול לעבור דרך נקביים בגודל שלושה מיקרון אל תוך המדור הלומנלי. לפיכך, ייתכן מגע בין SVGs ל-BES השוכבים על נקביים בממדים אלו. יתרה מכך, דימוי ה-SEM מעיד כי SVGs ו-BBCs היו מסוגלים לגדול ישירות מעל נקבי הממברנה, תופעה התורמת באופן מלאכותי לתפקוד מחסום הפיזי של מודלים של BBB במגע in vitro.

במחקר זה, נעשה שימוש במודל מעבר דם-מוח (BBB) במגע אנושי כדי לבחון את ההשפעה של חומר פיברינוליטי מסוג TPAA על ה-BBB. מחקרים אלו in vitro מאשרים כי TPA אכן הגביר את חדירות ה-BBB השלם באופן התלוי בריכוז ובזמן, שניהם היו בטווח רלוונטי פרמקולוגית. שינויים מורפולוגיים דרמטיים של אסטרוציטים מסוג SVG ניכרים על הקרומים נקבוביים לאחר חשיפה ל-TPA, דבר המצביע על כך שהתגובה האסטרוציטית ל-TPA עומדת בבסיס פתיחת ה-BBB המוהוית על ידי TPA.

שיטה זו מילאה תפקיד מרכזי במחקר שלנו, אשר נועד לבחון כיצד מחסום הדם-מוח מגיב לתרופה התרומבוליטית TPAA המשמשת בחולי שבץ מוחי להמסת קרישי דם. זוהי ההדגמה הראשונה של שיטה זו בספרות, ואנו מקווים שחוקרים אחרים יאמצו אותה למטרותיהם שלהם.