Name: שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T18:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: חקור שיטה משופרת להכנת מודל מגע של מחסום דם-מוח אנושי בתרבית משותפת של אסטרוציטים ותאי אנדותל מוחיים. המודל מאפשר מחקר של חדירות מחסום הדם-מוח ומסירת תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענקים שהוענקו לRLM מהמועצה הלאומית לבריאות והמחקר הרפואי של אוסטרליה (מענק # 606,658).

1. תרבית תאים (3-7 ימים לפני אסיפת BBB) 1.1. תאי המוח אנושי כלי הדם האנדותל ראשיים (BECs) BECs התקבלו באופן מסחרי. התאים יוצרו על ידי ניתוק dispase של רקמת קליפת המוח האנושי נורמלית ובתנאי קפוא במעבר 3 (&lt;12 הכפלות אוכלוסייה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התשתית: כלי פרווה רקמות תרבות עם &quot;פקטור קובץ מצורף&quot; לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזוקה נייד: שמור על BECs בינונית מלא המכיל סרום. לניסויים, תרבות BECs במדיום סרום ללא מוחלט. לשמור על התאים ב5% CO 2 humidified, 21% O 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס הערה: כחלופה לחומרים כימיים מיוחדים, 0.1% (w / v) פתרון לטין יכול לשמש כמגיב ציפוי תוך DMEM/F-12 תוספת 15 HEPES מ&quot;מ, 10% (v / v) עוברי עגל בסרום (FCS), L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 50 מיקרוגרם/ מיליליטר gentamycin, 20 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין ו20 מיקרוגרם / תוסף צמיחת תאי האנדותל מיליליטר ניתן להשתמש בם לצורך תחזוקת BEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת culturing לניסויים: BECs מחוברות פיצול ביחס של 1:03-1:06, תלוי בזמן המיועד לשימוש הבא (3-7 ימים). לשנות את מדיום התחזוקה כל 3 ימים. השתמש BECs עד 15 מעברים. </li></ol> 1.2. תא אונליין SVG האדם העוברי astroglial תאים עובריים האנושיים SVG astroglial 22 נגזרו במקור מתרבויות עיקריות של מוח העוברי של אדם הפך עם נגיף סימיאן הכפול מחסרת 40. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזוקה: תרבות תאי SVG במדיום חיוני מינימאלי עם תמיסת מלח מאוזנת של ארל בתוספת 20% (v / v) FCS (אותו אחוז בסרום משמש כדי לשמור על התאים הראשוניים של הוריהם 22), 2 L-גלוטמין מ&quot;מ, 50 / ml פניצילין U ו 50 סטרפטומיצין מיקרוגרם / מיליליטר. לשמור על התאים בhumidified 5% CO 2, 21% O 2 </תת&gt; חממה ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת culturing לניסויים: SVGs מחוברות פיצול ביחס של 1:05-1:10, תלוי בזמן המיועד לשימוש הבא (3-7 ימים). ההסרה של טריפסין לא נדרשה בשל התכולה הגבוהה של סרום במדיום. לשנות את המדיום כל 3 ימים. השתמש SVGs עד 20 מעברים. </li></ol> 2. הרכבה וCoculturing של האדם במבחנה BBB הדגם (יום 0) הערה: האדם במודל BBB קשר מבחנה מוכן על פי פרוטוקולים שפורסמו 13,23, עם שינויים. 2.1. ציפוי של תוספות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מוסיף רקמות תרבות (6.5 מ&quot;מ קוטר עם קרום נקבובי פוליאסטר, 3 מיקרומטר נקבובית בגודל) בבארות של צלחת 24 גם סיפקה. מעייל את פני השטח luminal של מוסיף <s> </s> לילה חממה 37 מעלות צלזיוס humidified עם קולגן עכברושי (20 מיקרוגרם / 2 סנטימטר; 50 μl של 132 מיקרוגרם/ מיליליטר קולגן אני ב0.02% חומצה אצטית במים מילי-Q (MQH 2 O)). שטוף מוסיף פעם אחת (שניהם מהצד abluminal וluminal) עם MQH 2 O להסיר את החומצה יורית. הערה: קרום במרתף של נימי דם במוח לא מכיל קולגן אני אבל בעיקר laminins, isoforms סוג IV קולגן, nidogens, וproteoglycans סולפט heparan 9. מסיבה זו, חלק מהחוקרים לנצל סוכני ציפוי כגון IV קולגן, פיברונקטין 13, או Matrigel (מדעי החיים BD) 16 לדוגמנות BBB יותר אותנטית. </li></ol> 2.2. SVGs זריעה על המשטח התחתון ממברנה (Abluminal) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הכנס ובעדינות שיתאים סביב השפה של הקרום הנקבובי חתיכת צינורות סיליקון אלסטי קצרה (&quot;צינורות חיצוניים&quot;; קוטר ~ ארוך 10 מ&quot;מ, 8 מ&quot;מ פנימי, 1.6 קיר מ&quot;מ), ויוצר במהותו חדשה גם מעל פני השטח abluminal (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחתון של בית הכנסds להיות אטום כדי למנוע דליפת תקשורת. ראשית, להכין את תקע (איור 2 א ו -2 ב) עשוי מצינורות סיליקון (שמכונים &quot;צינור פנימי&quot;; ~ עוד 8 מ&quot;מ, 3.2 מ&quot;מ קוטר פנימי, קיר 1.6 מ&quot;מ; איור 2), אטום בקצה אחד עם קונוס איטום פלסטיק (~ 3 מ&quot;מ ארוך; שהוכן על ידי חיתוך החלק התחתון של תגובת 0.2 מיליליטר פולימראז שרשרת (צינור PCR); איור 2). חרוט זה חותם לא רק לום צינורות הפנימי, אלא גם מרחיב את הקצה שלה להתאמה הדוקה יותר להוספה. בשלב בא, באמצעות מלקחיים סטריליות, להכניס את תקע סיליקון לתוך חלל luminal ולקדם אותה עד שהוא מגיע 1-2 מ&quot;מ של עד ~ מן הקרום (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, זרע 4 x 10 4 תאי SVG ב200 בינוני תחזוקת SVG μl (se1.2.2 ction לעיל) ישירות לתוך סיליקון היטב מעל פני השטח קרום abluminal (איור 2 א). לאפשר SVGs לדבוק לפחות 4 שעות בחממה. הערה: כדי לשמור על סטריליות להעביר מוסיף התאסף בין שתי 6 גם צלחות (צלחת אחת הפוכה מעל אחרים; איור 2C) כדי לצמצם את החשיפה לאוויר לא מסונן במהלך ההליך. צינורות סיליקון ותקעים נשטפים באתנול וautoclaved לשימוש מאוחר יותר. הערה: תקעי שימוש (סעיף 2.2.2) רק מוסיף עם נקבובית קרום גדלים גדול יותר מאשר 1 מיקרומטר. ממברנות בקוטר נקבובית ≤ 1 מיקרומטר לעתים רחוקות דליפה ודורשות רק ההתאמה של הצינור החיצוני סיליקון (סעיף 2.2.1). בנוסף, חלק מסוכני הציפוי אחרים מאשר קולגן אני (ראה הערה בסעיף 2.1) עלולים למנוע דליפות אפילו עד 3 מיקרומטר נקבוביות. לקבוע באופן אמפירי זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לפקח על מצב הדבקות של האסטרוציטים שלך, זרע במקביל ל96, גם נפח זהה סטנדרטי של תא ההשעיה astrocyte. יש גם את זה את אותו שטח פנים כמו להכניס 6.5 מ&quot;מ (0.33 2 סנטימטר) ומאפשר הדמיה קלה יותר של תאים על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד מאשר הקרום להוסיף. כשאתה מתבונן דבקות מספקת של astrocyte בשליטה 96 היטב, האסטרוציטים לי כראוי דבקו גם על הקרום להוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר האסטרוציטים יש דבק מספיק בשליטה 96 היטב, להעביר אסיפות להכניס למכסת המנוע בתרבית הרקמה (ראה הערה לעיל) ובעדינות להסיר את צינורות סיליקון החיצוניים ותקעים. לחזור מוסיף לכיוון הרגיל (כלומר זקוף) לתוך הבארות סיפקו מכילות 800 μl / טוב של מדיום BEC תחזוקה (סעיף 1.1.2 לעיל). </li></ol> 2.3. זריעה של BECs ללשכת לומינל מעל האסטרוציטים זרעי 2x10 4 BECs ב200 μl על פני השטח luminal מצופה קולגן ולהחזיר את inseRTS לתוך החממה. 2.4. Coculturing Coculture מוסיף SVG / BEC נזרע במשך 3 ימים במדיום BEC ללא שינוי תקשורת לפני הניסויים. 3. ניסויים עם דגם BBB האנוש (יום 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעורר את התאים במבחנה הכביסה הראשונים BBB על ידי החלפת כלי תקשורת abluminal וluminal עם 600 μl ובינוני BECs סרום ללא 100 μl, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום luminal שוב ולהחליף עם של מדיום סרום ללא 100 μl עם סוכני מגרה. הערה: אם גירוי של חדר abluminal נדרש (כדי להפעיל את במבחנה BBB מתא astrocytic), לשאוב את מדיום abluminal ולהחליף עם 600 ul של מדיום סרום ללא גירוי עם סוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק כל קבוצת ניסוי בשלושה עותקים (ומכאן, אם גירוי luminal מבוצע, אשר דורש 3 x 100 μl, אנו ממליצים על דילול מחדש<html> סוכנים לריכוזים הסופיים שלהם ב350 μl של מדיום סרום ללא לכל קבוצה כדי למזער שגיאות pipetting בין בארות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע paracellular סטנדרטי ו / או מבחני חדירות transcellular של קליעים נותבים שכותרת 16,24 (עבור האחרונים אנו משתמשים isothiocyanate והעמסת (FITC) מצומדות אלבומין) ו / או מדידה של Teer 13,16,25 כפי שתואר לעיל. </li></ol> כדי להסביר את תנודות בחדירות תחילת המחקר בין ניסויים, לנתח שינויים בביחס חדירות להוספה מצופה ללא תאים (המשמש כנקודת התייחסות לחדירות מקסימליים) ולקבוצה שטופלה ברכב תוך שימוש בנוסחה: חדירות (% ממקסימום) = ( ערך חדירות של הכנס ניסיוני - ערך חדירות ממוצע של קבוצת הרכב) / (ערך חדירות של להכניס הריק - ערך חדירות ממוצע של קבוצת הרכב) X 100. 4. ויזואליזציה של תאים בממברנות נקבוביות NT &quot;&gt; הערה: תאים בלא כתם על קרומים להוסיף קשים להתבונן בניגוד שלב או התערבות ההפרש לעומת זאת מיקרוסקופיה (DIC) מאז הקרום הוא די אטום ומפריע להעברת אור כדי להתמודד עם בעיה זו פיתחנו נהלי צביעה שונים של תאים ב. מוסיף, אשר מאוד לשפר את המראה של תא על הממברנה. באופן כללי, להכתים את הקרומים להכניס ועדיין מחובר להוספה, בבארות. הקרומים יש להסירם רק בסוף ההליך מכתים למטרות הרכבה. 4.1. Hematoxylin מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) paraformaldehyde (PFA) ב פוספט בופר סליין (PBS; 130 mM NaCl, 10 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 10 מ&quot;מ אא 2 PO 4, pH 7.2) עבור 20 דקות. לשטוף פעם ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הכנס בפתרון hematoxylin של 0.1% מאייר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את התוסף במים ברז (על ידי השריית את כל הפרטיםERT במים ברז וכוס המכילה pipetting בעדינות את המים העודפים). להעביר את הכנס לפתרון של סקוט במים ברז (2 גר &#39;/ ל&#39; NaHCO 3, 20 g / L MgSO 4) ל~ 20 שניות עד שהצבע הכחול הרצוי מתפתח. שטוף את הכנס שוב במים ברז (סעיף 4.1.3). כתם eosin אופציונלי יכול להיות הציג כאן על ידי טבילה את הכנס ב1% פתרון eosin ל10 שניות ואחריו שטיפה במים ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש הקרום להוסיף. באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום) להסיר את הקרום ולעגן אותה בשקופית זכוכית הדמיה בהירה שדה הערה: אם הרכבה בינוני di-N-butylphthalateinxylene (DPX) מנוצל לשטוף להכניס את עם 100% אתנול ואחריו קסילן לפני הסרת והתקנת הממברנה. </li></ol> 4.2. מיקרוסקופ האלקטרוני סורק (SEM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) PFA ב PBS עבור 20min. לשטוף שלוש פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את הקרומים ל30 דקות ב1% (w / vtetroxide אוסמיום) בMQH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף מוסיף במים (סעיף 4.1.3) ולייבש בשיפוע הסלמת אתנול (50%, 70%, 90% במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן 3x עם אתנול 100% עבור 10 דקות להפסקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק מוסיף מיובש בתערובת של hexamethyldisilazane (HMDS): אתנול (1:2 אז 2:01 במשך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק מוסיף עם HMDS 100% למשך 5 דקות, אוויר יבש ולאחסן בתנאים יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הקרום באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום). לבחון קרומים ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים. </li></ol> 4.3. Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מוסיף 4% קרים כקרח (w / v) PFA ב PBS עבור 20 דקות, לשטוף פעם שבנאגר מלוח טריס (TBS; 50 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.6, 154 mM NaCl, 0.22 מיקרומטר מסוננים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע immunostaining של התאים על הקרום להוסיף כמתואר 26 בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הקרום באמצעות אזמל (חיתוך מסביב לקצה הקרום) ולעלות אותו על AGשקופית ילדה עם הרכבה בינונית הקרינה. בחן את הקרום על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol>

<ol><li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%2Fneurovascular+unit+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 57, 173-185 (2005).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol. Dis. 37, 13-25 (2010).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.</a> Neuron. 57, 178-201 (2008).</li>
<li>Vivien, D., Gauberti, M., Montagne, A., Defer, G., Touze, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+plasminogen+activator+on+the+neurovascular+unit%3A+from+clinical+data+to+experimental+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue plasminogen activator on the neurovascular unit: from clinical data to experimental evidence.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2119-2134 (2011).</li>
<li>Stewart, P. A., Wiley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+nervous+tissue+induces+formation+of+blood-brain+barrier+characteristics+in+invading+endothelial+cells%3A+a+study+using+quail--chick+transplantation+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developing nervous tissue induces formation of blood-brain barrier characteristics in invading endothelial cells: a study using quail--chick transplantation chimeras.</a> Dev. Biol. 84, 183-192 (1981).</li>
<li>Janzer, R. C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+induce+blood-brain+barrier+properties+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells.</a> Nature. 325, 253-257 (1987).</li>
<li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li>
<li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathol. 122, 1-9 (2011).</li>
<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Semin. Immunopathol. 31, 497-511 (2009).</li>
<li>Girouard, H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+coupling+in+the+normal+brain+and+in+hypertension%2C+stroke%2C+and+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease.</a> J. Appl. Physiol. 100, 328-335 (2006).</li>
<li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+physiology%2C+pathology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25, 59-127 (2005).</li>
<li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+%28muBBB%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB).</a> Lab Chip. 12, 1784-1792 (2012).</li>
<li>Gaillard, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+functional+characterization+of+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier%2C+comprising+a+co-culture+of+brain+capillary+endothelial+cells+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes.</a> Eur. Pharm. Sci. 12, 215-222 (2001).</li>
<li>Hurwitz, A. A., Berman, J. W., Rashbaum, W. K., Lyman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+astrocytes+induce+the+expression+of+blood-brain+barrier+specific+proteins+by+autologous+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells.</a> Brain Res. 625, 238-243 (1993).</li>
<li>Demeuse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+coculture+of+rat+brain+endothelial+cells+and+astrocytes%3A+a+syngenic+model+to+study+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized coculture of rat brain endothelial cells and astrocytes: a syngenic model to study the blood-brain barrier.</a> J. Neurosci. Methods. 121, 21-31 (2002).</li>
<li>Coisne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+syngenic+in+vitro+blood-brain+barrier+model%3A+a+new+tool+to+examine+inflammatory+events+in+cerebral+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium.</a> Lab. Invest. 85, 734-746 (2005).</li>
<li>Cohen-Kashi Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closing+the+gap+between+the+in+vivo+and+in+vitro+blood-brain+barrier+tightness%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Closing the gap between the in vivo and in vitro blood-brain barrier tightness.</a> Brain Res. 1284, 12-21 (2009).</li>
<li>Kroll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+blood-brain+barrier+by+glucocorticoids+and+the+cells+of+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of the blood-brain barrier by glucocorticoids and the cells of the neurovascular unit.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1165, 228-239 (2009).</li>
<li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling%3A+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 312-328 (2008).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+endothelial+and+astrocyte+cocultures%3A+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+drug+delivery+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Permeability of endothelial and astrocyte cocultures: in vitro blood-brain barrier models for drug delivery studies.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 2499-2511 (2010).</li>
<li>Antonic, A., Sena, E., Donnan, G., Howells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+In+Vitro+Models+of+Ischaemic+Stroke%3A+a+Test+Bed+for+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Human In Vitro Models of Ischaemic Stroke: a Test Bed for Translation.</a> Transl. Stroke Res. 3, 306-309 (2012).</li>
<li>Major, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+line+of+human+fetal+glial+cells+that+supports+JC+virus+multiplication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishment of a line of human fetal glial cells that supports JC virus multiplication.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 1257-1261 (1985).</li>
<li>Eugenin, E. A., Berman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-dependent+mechanisms+of+leukocyte+trafficking+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemokine-dependent mechanisms of leukocyte trafficking across a model of the blood-brain barrier.</a> Methods. 29, 351-361 (2003).</li>
<li>Dehouck, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transfer+across+the+blood-brain+barrier%3A+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Drug transfer across the blood-brain barrier: correlation between in vitro and in vivo models.</a> J. Neurochem. 58, 1790-1797 (1992).</li>
<li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li>
<li>Niego, B., Samson, A. L., Petersen, K. U., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin-induced+activation+of+astrocytes+in+mixed+rat+hippocampal+cultures+is+inhibited+by+soluble+thrombomodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombin-induced activation of astrocytes in mixed rat hippocampal cultures is inhibited by soluble thrombomodulin.</a> Brain Res. 1381, 38-51 (2011).</li>
<li>Ma, S. H., Lepak, L. A., Hussain, R. J., Shain, W., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endothelial+and+astrocyte+co-culture+model+of+the+blood-brain+barrier+utilizing+an+ultra-thin%2C+nanofabricated+silicon+nitride+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An endothelial and astrocyte co-culture model of the blood-brain barrier utilizing an ultra-thin, nanofabricated silicon nitride membrane.</a> Lab Chip. 5, 74-85 (2005).</li>
<li>Niego, B., Freeman, R., Puschmann, T. B., Turnley, A. M., Medcalf, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((t-PA-specific+modulation+of+a+human+BBB+model+involves+plasmin-mediated+activation+of+the+Rho-kinase+pathway+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">t-PA-specific modulation of a human BBB model involves plasmin-mediated activation of the Rho-kinase pathway in astrocytes.</a> Blood. , (2012).</li>
<li>Deli, M. A., Abraham, C. S., Niwa, M., Falus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%2CN-diethyl-2-%5B4-%28phenylmethyl%29phenoxy%5Dethanamine+increases+the+permeability+of+primary+mouse+cerebral+endothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers.</a> Inflamm. Res. 52, 39-40 (2003).</li>
<li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nat. Med. 14, 731-737 (2008).</li>
<li>Yepes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-type+plasminogen+activator+induces+opening+of+the+blood-brain+barrier+via+the+LDL+receptor-related+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Tissue-type plasminogen activator induces opening of the blood-brain barrier via the LDL receptor-related protein.</a> J. Clin. Invest. 112, 1533-1540 (2003).</li>
<li>Abu Fanne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+permeability+and+tPA-mediated+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier permeability and tPA-mediated neurotoxicity.</a> Neuropharmacology. 58, 972-980 (1016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoprotein+receptor-mediated+induction+of+matrix+metalloproteinase+by+tissue+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Lipoprotein receptor-mediated induction of matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.</a> Nat. Med. 9, 1313-1317 (2003).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+hemorrhagic+transformation+after+tissue+plasminogen+activator+reperfusion+therapy+for+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke.</a> Stroke. 35, 2726-2730 (2004).</li>
<li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+better+use+of+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">How to make better use of thrombolytic therapy in acute ischemic stroke.</a> Nat. Rev. Neurol. 7, 400-409 (2011).</li>
<li>Acheampong, P., Ford, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+of+alteplase+in+the+treatment+of+ischaemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Metab.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics of alteplase in the treatment of ischaemic stroke.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8, 271-281 (2012).</li>
<li>Derex, L., Nighoghossian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+haemorrhage+after+thrombolysis+for+acute+ischaemic+stroke%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Neurosurg.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Intracerebral haemorrhage after thrombolysis for acute ischaemic stroke: an update.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 79, 1093-1099 (2008).</li>
<li>Garber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+treatment--light+at+the+end+of+the+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stroke treatment--light at the end of the tunnel.</a> Nat. Biotechnol. 25, 838-840 (2007).</li>
<li>Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+Stroke+in+the+2010s%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversing Stroke in the 2010s.</a> Stroke. 40, 3156-3158 (2009).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).</li>
<li>Song, L., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+that+maintain+expression+and+cytoskeletal+association+of+tight+junction-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell.+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Culture of murine brain microvascular endothelial cells that maintain expression and cytoskeletal association of tight junction-associated proteins.</a> In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 313-320 (2003).</li>
<li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li>
</ol>

יש מחברים אין לחשוף.

מחקר רפואי לפתולוגיות מוח סובל קושי רב translational. באזור של שבץ איסכמי חריף, למשל, תרופות רבות אשר הראו הבטחה גדולה במודלים של בעלי חיים נכשלו במרפאת 38,39. הסיבות לתוצאות מאכזבות אלה הן מגוונות וכוללות בגידה של מערכות בדיקה קליני לתרחיש שבץ אדם וההגזמה של תוצאות שהתקבלו ממחקרים בבעלי החיים 21. אסטרטגיה אחת כדי לשפר את הערך המנבא של ממצאים קליניים אל השלב הקליני היא פיתוח נוסף של אדם במבחנת מודלים מבוסס תאים, אלה עשויים לספק כלים ...

BBB הוא ממשק מיוחד בין מערכת העצבים המרכזית, מכריע אחראית לתחזוקה של עצירת דימום במוח זרימת הדם ההיקפית ו. היא כוללת תאים שונים במוח כלי הדם אנדותל (BECs) שמושפעים מבחינה תפקודית על ידי כמה מרכיבים תאיים וacellular (להלן) כדי ליצור שער חזק ודינמי אל המוח. בתנאים פיסיולוגיים BBB מגביל את המעבר של תאי דם, מרכיבי פלזמה וחומרים מזיקים, כל הפוטנציאל רעיל למערכת עצבים, למוח. במקביל, BBB סלקטיבי מחליף יוני מפתח וחומרים מזינים (גלוקוז וחומצות אמינו) ומוצרי פסולת המטבולית בין המוח ואת זרימת הדם כדי לשמור על סביבת מוח 1,2 בדיוק. בשנים האחרונות זה הופך להיות ברור כי כישלון של BBB מתרחש במגוון רחב של פתולוגיות מוח כרוניות, כגון מחלות ניווניות או הקשורים לדלקת (למשל מחלת אלצהיימר וmultiplדואר הטרשת נפוץ, בהתאמה) 3, כמו גם במצבים חריפים כמו שבץ איסכמי 4. מאפייני BBB הייחודיים של תאי האנדותל במוח (BECs) מושרים בעיקר על ידי סביבת מוחותיהם 5, ובפרט על ידי האסטרוציטים 6,7. יש הבנה גוברת כי תאים מסוגים אחרים, כגון pericytes 8, תאי עצב ומיקרוגליה 1,3, כמו גם את הקרום במרתף 9, לתמוך BECs ויוצרים יחד יחידה תפקודית מכונה &quot;יחידת העצבים וכלי הדם&quot; (NVU) אשר בו זמנית זוגות עצביים דרישות חילוף חומרים לנימי אספקתם 10. מעורבותם של BBB במצבים פתולוגיים בבסיס ניסיונות רבים לפתח מודלים BBB חוץ גופית על מנת לסייע במחקר הקשורים ל-BBB 11,12. מודלים אלה שואפים לחקות קרובים ככל האפשר במאפייני BBB vivo על פי עיקרון NVU. במבחנה </em&gt; דגמי BBB בדרך כלל מסתמכים על monolayer של BECs קפוצת יוצרי צומת (בעיקר משור 13, אדם 14, עכברוש 15, עכבר 16, ו17,18 מקורות חזיריים), יחד תרבית על קרום נקבובי עם האסטרוציטים תמיכה (בהרחבה נסקר על ידי מעדניית et al. 11 2005). ניתן לגדל האסטרוציטים בתנאים ללא מגע ובחלק התחתון של תרבית רקמה, מופרד מBECs (טיפחה על פני השטח העליונים של הקרום) על ידי התרבות בינונית עדיין מתקשר עם BECs באמצעות גורמים מסיסים 16. בדגמים מתקדמים יותר שטוב יותר דומה למבנה האנטומי של BBB in vivo, האסטרוציטים נשמרים בתנאי התקשרות ותרבותיים ישירות בצד השני של הקרום בסמיכות לBECs 13,15,17 (איור 1). תצורה זו מאפשרת מגע פיזי בין BECs והאסטרוציטים, שהוקם כאשר פרויקט האסטרוציטיםהתהליכים שלהם דרך הקרום הנקבובי. חשוב מכך, למגע אמיתי להתרחש צריך להיות ≥ הנקבוביות 1μm בקוטר, שכן קצה רגליים astrocytic לא יכולות לעבור בגדלים קטנים יותר נקבוביות (כלומר 0.4 מיקרומטר) 14,15. יש לציין, מערכות BBB קשר הם הפגינו בחלק מהמחקרים להיות עדיף על עמיתיהם שאינם אנשי הקשר שלהם בנוגע להתנגדות שלהם טרנס אנדותל החשמלי (Teer) וערכי חדירות האנדותל של קליעים נותבים שונים 13,17,18. ממד נוסף של זרימת מדיה נוספה לאחרונה במספר במבחנה המודלים BBB ליישם כוחות גזירה לאנדותל לסימולציה קרובה יותר של כלי הדם במוח 12,19. מכשול טכני אחת להתגבר בעת יצירת מודל BBB קשר הוא הזריעה של האסטרוציטים כנגד כוח הכבידה על פני השטח abluminal של הקרום הנקבובי. פרוטוקולים קודמים 13,20, שם האסטרוציטים היו פשוט זורעים בירידה של תקשורת על גבי בהוספת verted, אפשר פעמים זריעה קצרה בלבד (כלומר 10 דקות 13 או 2 שעות 20) שנמצאו בידיים שלנו לא הספיק לקובץ מצורף תא תקין. שימוש בשיטה בסיסית זו, תקופת התקשרות astrocyte כבר לא דורשת ניטור מתמיד של מוסיף על ידי פתיחה תכופה של החממה (גורמת לתנודות בטמפרטורה, חומציות ולחות), והוא גם נוטה לזריעת תא אחידה עקב דליפה של תקשורת הדרך הנקבוביות, במיוחד אם הנקבוביות גדולות יותר מאשר 1 מיקרומטר הם מועסקים. כאן אנו מתארים פרוטוקול כללי להכנת מודל BBB ליצירת קשר. ההליך שלנו כולל את שיטה חלופית לתא זריעה על מוסיף הפוך, העוסק במגבלות שהוזכרו לעיל. השיטה מאפשרת לדבקות באין מפריע של האסטרוציטים על פני השטח קרום abluminal, בחממת equilibrated, במשך תקופה ארוכה של זמן. כתוצאה מכך, זריעה אחידה של האסטרוציטים מושגת אשר מגדילה את איכות מחסוםוממזער וריאציות חדירות בסיסי בין מוסיף. ככל שהשימוש בתאים אנושיים הוא חשוב למחקר אנושי רלוונטי 21, אנחנו בנוסף להפגין במאמר זה ניצול המסוים של שילוב רומן של BECs האנושית הראשונית והנציחו את האסטרוציטים אדם להקמת מודל BBB אדם מגע עם יכולת הקרנת תפוקה גבוהה . מאז שצפו בתאים בממברנות נקבוביות יכול להיות לנו גם טכניקות קשות, פרט מכתים אשר יכול לסייע בקביעת המפגש והמורפולוגיה של תאים על הקרומים נקבוביים. לבסוף, אנו מדגימים כיצד מודל BBB האנושי שלנו יכול להיות מנוצל כדי לבחון את ההשפעה של activator plasminogen רקמות מהסוג (t-PA) - אנזים קריש קורע המשמש כאפשרות טיפול יחידה לשבץ איסכמי חריף - על BBB.

<table><tbody><tr><td>Attachment Factor</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-210</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BECs), ראשוניים, תאגיד מערכות תאים אנושי</td><td></td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>Complete</td><td>medium Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-500</td><td>בתוספת CSC JetFuel</td></tr><tr><td>בינוני ללא סרום</td><td>תאגיד מערכות תאים</td><td>SF-4Z0-500</td><td>בתוספת CSC RocketFue</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 עם 15 מ"מ HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>תוסף צמיחת תאי אנדותל (ממקור בקר)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סיליקון חיצוניים</td><td>ווטסון-מרלו</td><td>913.A080.016</td><td>מותג Pumpsil, קוטר פנימי 8 מ"מ, סרום עגל עובר בקיר 1.6 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulfate</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>הפרין נתרן</td><td>פייזר</td><td></td><td>1,000 U/ml</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4875</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סיליקון פנימיים</td><td>ווטסון-מרלו</td><td>913.A032.016</td><td>מותג Pumpsil, קוטר פנימי 3.2 מ"מ, דופן 1.6 מ"מ</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s תמיסת המטוקסילין</td><td>Amber Scientific</td><td>MH</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי עם ארל' תמיסת מלח מאוזנת</td><td>HyClone Laboratories</td><td>SH30244.01</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>קולגן עכברוש I</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>המותג Cultrex</td></tr><tr><td>מוסיף תרבית רקמות</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3472</td><td>מותג Transwell, בקוטר 6.5 מ"מ, עם קרום נקבובי פוליאסטר, 3 ומיקרו; גודל נקבוביות m</td></tr></tbody></table>

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

מחסום דם המוח (BBB) ​​כולל נימים במוח בלתי חדירים, אבל להתאמה אשר בחוזקה לשלוט בסביבת המוח. כישלון של BBB כבר רמז באטיולוגיה של מחלות רבות במוח, יוצר צורך בפיתוח של אדם במודלי BBB חוץ גופית על מנת לסייע במחקר קליני רלוונטי. בין דגמי BBB הרבים עד כה תיארו, סטטי (ללא זרימה), פנה למודל BBB, שם האסטרוציטים ותאי האנדותל במוח (BECs) הם cocultured בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי, התפתחה מערכת עדיין אותנטית פשוטה כדי לדמות את BBB עם קיבולת הקרנת תפוקה גבוהה. אף על פי כן הדור של מודל כזה מציב אתגרים טכניים כמה. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מודל BBB אדם קשר ניצול שילוב רומן של BECs האנושית הראשונית והאסטרוציטים אנושיים הונצחו. באופן ספציפי, אנחנו פירוט שיטה חדשנית לתא זריעה על מוסיף הפוך, כמו גם לציין inserטכניקות צביעת t ומדגימים כיצד אנו משתמשים במודל שלנו למחקר הקשורים ל-BBB.

כדי להקים אנושי, מודל BBB קשר שהיו לנו לטפח SVGs וBECs על ממברנות נקבוביות עם נקבובית בגודל 3 מיקרומטר, המוצג על מנת לאפשר מעבר של קצה רגליים astrocyte למגע עם תאי האנדותל 14,15,27,28. ייצוג סכמטי של המודל ליצירת קשר המלא מתואר באיור 1 (משמאל איור). האתגר הטכני העיקרי שהוצג על ידי מערכת מגע הוא הצורך זרע האסטרוציטים כנגד כוח הכבידה על פני השטח abluminal של הממברנה. אנו מצליחים במשימה זו על ידי בעיקר יצירת סיליקון נשלף גם על גבי המשטח הממברנה abluminal ת...

הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) ​​יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי.

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

הליך זה נועד לסמלץ in vitro את מחסום הדם-מוח באמצעות תרבית משולבת (co-culturing) של אסטרוציטים ותאי אנדותל על שני צדדים מנוגדים של ממברנה נקבובית. ראשית, יש לצפות את המשטח הלומינלי של הממברנה הנקבובית במטריצה חוץ-תאית. חלבונים כגון קולגן מתאימים לאינסרט ההפוך עם צינור סיליקון חיצוני ופקק סיליקון פנימי, כדי ליצור באר נשלפת מעל המשטח האבלומינלי של הממברנה.כעת זרעו את תאי האסטרוציטים על ההכנסה (insert) ההפוכה, כך שיידבקו למשטח האבלומינלי. לאחר מכן, הסירו את הצינור והניחו את ההכנסה בכיוונה הרגיל בתוך באר מלאה במצע. בשלב הבא, זרעו את התאים האנדותלייליים אל תוך התא הלומנלי של ההכנסה ובצעו תרבית משותפת (co-culture) עם האסטרוציטים שממול.בסופו של דבר, מעבר של סמני פלואורסצנציה או מדידה של התנגדות חשמלית טרנס-אנדותליאלית משמשים למדידת שינויים בחדירות של מחסום הדם-מוח (BBB) במעבדה (in vitro) בתגובה לחומרים מעוררים שונים. מי שידגים הליך זה הוא מר בורי ניגו (Mr.Barry Nigo), פוסט-דוקטור במעבדתי, אשר במהלך לימודי הדוקטורט שלו פיתח את פרוטוקול הזריעה המודגש שבו השתמשנו כדי לדמות את מחסום הדם-מוח. הרעיון להליך זה עלה תחילה לאחר שבחנו שיטות זריעה פשוטות יותר וחווינו תסכול רב עקב דליפת המצע דרך הנקבים, כמו כן בשל נפחי מצע קטנים.דבר זה הוביל לתקופות התיישבות קצרות ובלתי מספיקות של אסטרוציטים, נושא שאנו מנסים לפתור בפרוטוקול שלנו. מקם את תבתי תרבית הרקמה (inserts) בבארות של פלטה בעלת 24 בארות. לאחר מכן, הוסף 50 µL של קולגן של חולדה בריכוז 132 µg/mL, מסוג 1, כדי לצפות את המשטח הלומינלי של התבתים; דגרין בן לילה באינקובטור לח במטמפר של 37 °C על מנת להסיר שאריות חומצה, ושטוף הן את הצד האבלומינלי והן את הצד הלומינלי של התבתים במים מזוקקים פעמיים.לאחר מכן הפכו את המכניסים והלבש בעדינות קטע קצר של צינור סיליקון גמיש מסביב לשוליים של הממברנה נקבובית. פעולה זו יוצרת למעשה באר חדשה מעל השטח האבלומינלי (abluminal), כדי לאטום את הצד התחתון.הכינו פקק העשוי מצינור סיליקון, האיטור בקצהו בוצע באמצעות הקצה הגזור של מבחנה PCR בנפח 0.2 מיליליטר. כעת, בעזרת פינצטה סטרילית, הכניסו את פקק הסיליקון אל תוך החלל הלומינלי והעבירו אותו עד שיגיע למרחק של כמעט 1-2 מילימטרים מהממברנה. לאחר מכן, זרעו 40,000 אסטרוציטים ב-200 מיקרוליטר של מצע התחזוקה שלהם ישירות אל תוך באר הסיליקון שמעל פני השטח של הממברנה האבלומנלית.כדי לנטר את מצב ההיצמדות של האסטרוציטים, השתמשו בלוחית 96 בארות סטנדרטית, מכיוון שיש לה את אותו שטח פנים כמו לה inserts בקוטר 6.5 מילימטר והיא מאפשרת ויזואליזציה קלה יותר של התאים באמצעות מיקרוסקופ בניגודיות של מופע. זרעו נפח זהה של תרחיף תאי האסטרוציטים לתוך לוחית ה-96 בארות. מצב זה ינוטר לאורך זמן כדי לקבוע מתי האסטרוציטים בלוחית ה-96 בארות, ובהמשך לכך גם בממברנת ה-insert, היצמדו מספיק כדי לשמור על סטריליות.העבירו את האינסרטים המורכבים בין שתי פלטות שש-בארות כדי לצמצם את החשיפה לאוויר לא מסונן. הניחו את התאים באינקובטור כדי לאפשר לאסטרוציטים להיצמד. כמו כן, הכניסו את פלטת הבקרה בעלת 96 הבארות לאינקובטור בשלב זה.לאחר כארבע שעות, בדקו את בורר הבקרה בלוח ה-96 כדי לראות אם האסטרוציטים נצמדו. אם כן, העבירו את מכלול המבטנה (insert assembly) בחזרה למנדף תרביות הרקמה. הסירו בעדינות את צינורות הסיליקון החיצוניים ואת הפקקים.לאחר מכן, החזיר את ההכנסות (inserts) למצב זקיף רגיל לתוך בארות המכילות 800 µL לבער של תווך תחזוקה לתאי אנדותל. זרע 20,000 תאי אנדותל מוחיים ב-200 µL על פני השטח הלומנליים המצופים בקולגן לתרבית משותפת למשך שלושה ימים בתווך BEC, ללא החלפת תווך. לפני התחילת הניסוי.שטפו את צינורות הסיליקון ואת הפקקים באתנול לפני עיקור באוטוקלב לשימוש מאוחר יותר. כדי להמריץ את מחסום הדם-מוח in vitro, תחילה, החליפו את המדיומים האבלומינליים והלומינליים ב-600 microliters וב-100 microliters של מצע becs נטול סרום, בהתאמה. שאבו את השטיפה הלומינלית והחליפו ב-100 microliters של מצע נטול סרום המכיל חומרי הגברה.אם משרים את ה-BBB in vitro מהמדור האסטרוציטי, יש לשאוב את המצע האבלומינלי ולהחליפו ב-600 microliters של מצע נטול סרום המכיל חומרי גירוי. המשך בבדיקות חדירות פאראצלולריות או טרנסצלולריות סטנדרטיות של סמני התיוג כדי לבסס מודל של מחסום דם-מוח אנושי במגע. אסטרוציטים ותאי אנדותל מוחיים אנושיים מומתים גודלים על ממברנות נקבוביות של שלושה מיקרון המאפשרות מעבר של רגלי אסטרוציטים למגע עם תאי האנדותל.השיטה אפשרה תקופת זריעה אופטימלית ובלתי פסקית של astrocytes ו-becs, אשר בתורם נצמדים בעוצמה למשטח נקבובי עם איבוד תאים מינימלי ומגיעים להתלכדות (confluency) תוך שלושה ימים לאחר הזריעה. שני סוגי התאים שומרים על הסממנים הספציפיים לתא על גבי קרומים נקבוביים, כפי שמעידי דפוסי הביטוי של glial fibrillary acidic protein GFAP ב-SVGs ו-von Willebrand factor VWF ב-NECs.בהתאם למאפיין הבסיסי ביותר של מודל BBB במגע, ה-NFE האסטרוציטי יכול לעבור דרך נקביים בגודל שלושה מיקרון אל תוך המדור הלומנלי. לפיכך, ייתכן מגע בין SVGs ל-BES השוכבים על נקביים בממדים אלו. יתרה מכך, דימוי ה-SEM מעיד כי SVGs ו-BBCs היו מסוגלים לגדול ישירות מעל נקבי הממברנה, תופעה התורמת באופן מלאכותי לתפקוד מחסום הפיזי של מודלים של BBB במגע in vitro.במחקר זה, נעשה שימוש במודל מעבר דם-מוח (BBB) במגע אנושי כדי לבחון את ההשפעה של חומר פיברינוליטי מסוג TPAA על ה-BBB. מחקרים אלו in vitro מאשרים כי TPA אכן הגביר את חדירות ה-BBB השלם באופן התלוי בריכוז ובזמן, שניהם היו בטווח רלוונטי פרמקולוגית. שינויים מורפולוגיים דרמטיים של אסטרוציטים מסוג SVG ניכרים על הקרומים נקבוביים לאחר חשיפה ל-TPA, דבר המצביע על כך שהתגובה האסטרוציטית ל-TPA עומדת בבסיס פתיחת ה-BBB המוהוית על ידי TPA.שיטה זו מילאה תפקיד מרכזי במחקר שלנו, אשר נועד לבחון כיצד מחסום הדם-מוח מגיב לתרופה התרומבוליטית TPAA המשמשת בחולי שבץ מוחי להמסת קרישי דם. זוהי ההדגמה הראשונה של שיטה זו בספרות, ואנו מקווים שחוקרים אחרים יאמצו אותה למטרותיהם שלהם.

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגים את ההתרבות המשותפת של פריציט במוח האנושי, אסטרוציטים ותאי אנדותל. כל שכבת תא נוצרת בנפרד ולאחר מכן מתורבתת יחד, מה שיוצר מערכת תלת שכבתית המחקה את הסידור התאי של מחסום...

פיתוח מודל תרבית תאים משולשת של מחסום הדם-מוח האנושי

תאי האפיתל של מקלעת הכורואיד (CP) יוצרים את מחסום נוזל הדם-מוח (BCSFB). מודל חוץ גופי של BCSFB משתמש בתאי פפילומה מקלעת כורואיד אנושיים (HIBCPP). מאמר זה מתאר תרבית וזיהום בסיסי של תאי HIBCPP באמצעות מערכת הכנסת מסנן תרבית תאים.

מודל אפיתל דמה מקלעת מבוססת תאים של הגדר ודם-השדרתי נוזל לחקר זיהום חיידקים מצד basolateral

כאן, אנו מתארים מודל עכברי במבחנה של מחסום הדם-מוח העושה שימוש בספקטרוסקופיה של תאי עכבה, תוך התמקדות בהשלכות על שלמות תאי האנדותל וחדירות באינטראקציה עם תאי T מופעלים.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

המטרה של הפרוטוקול היא להציג את הליך בלתי אופטימליים להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח (BBB) מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי הראשי (pBECs). המודל מראה הפארמצבטית גבוהה, אטימות גבוהה, מתאים ללימודי תחבורה, וגדילת גילוי סמים.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

המוח מבודדים נימים מרקמות המוח האנושי יכול לשמש כמודל פרה ללמוד מכשול הפונקציה תחת מצבים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת כדי לבודד את המוח נימים מרקמות המוח האנושי טריים.

בידוד של נימים מוחי מרקמות המוח האנושי טריים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר את ההגדרה של cellulo ב BBB (מחסום הדם-מוח)-Minibrain פוליאסטר נקבובי ממברנה תרבות להוסיף מערכת על מנת להעריך את התחבורה של מולקולות או מדבקים BBB האנושית שלהם ההשפעה הפיזיולוגית על תאי המוח שכנות.

מודל ממשק מוח-דם אנושי ללמוד מכשול המעברים על ידי פתוגנים או תרופות והאינטראקציה שלהם עם המוח

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא יחידת נוירונימי-דם הדוקה באופן הדוק הומאוסטזיס מוחי. על ידי שילוב האדם iPSCs והעוגב-על-שבב טכנולוגיות, יצרנו שבב BBB אישי, מתאים למידול מחלות ותחזיות החדירה לתרופות של הפונקציה. פרוטוקול מפורט מתואר לדור ותפעול של שבב BBB.

הדור של המוח האנושי מבוסס על-ידי שבב דם-מחסום

פרוטוקול זה מתאר שיטה להקמת מחסום דם-מוח אנושי (BBB) במודל מבחנה . תאי האנדותל והפריציטים נזרעים בכל צד של מסנן הכנסה (תא דם), ואסטרוציטים נזרעים בבאר התחתונה (תא המוח). המודל שאפיין שימש לניסויים בהובלת ננו-חלקיקים.

מערכת תאי תרבית משולשת המדגימה את מחסום הדם-מוח האנושי

במאמר זה נתאר את השיטה לביסוס מודל של תרבית תאים משולשת של מחסום הדם-מוח המבוסס על תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח האנושי, אסטרוציטים ופריציטים. מודל רב-תאי זה מתאים למחקרים על תפקוד לקוי של יחידות נוירו-וסקולריות במהלך שבץ איסכמי במבחנה או לסינון מועמדים לתרופות.

מודל תלת-תאי ראשוני של מחסום הדם-מוח האנושי לחקר שבץ איסכמי במבחנה

דוח זה מספק פרוטוקולים להרכבה, תרבית תאים ובדיקות על פלטפורמת μSiM לבניית מודלים של מחסום דם-מוח.

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

למחסום הדם-מוח (BBB) יש תפקיד מכריע בשמירה על סביבת מוח יציבה ובריאה. תפקוד לקוי של BBB קשור למחלות נוירולוגיות רבות. פיתחנו מודל תלת-ממדי, הנגזר מתאי גזע של BBB כדי לחקור פתולוגיה של כלי דם במוח, שלמות BBB, וכיצד BBB משתנה על ידי גנטיקה ומחלות.

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

חקור שיטה משופרת להכנת מודל מגע של מחסום דם-מוח אנושי בתרבית משותפת של אסטרוציטים ותאי אנדותל מוחיים. המודל מאפשר מחקר של חדירות מחסום הדם-מוח ומסירת תרופות.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

גלה סרטונים נוספים