Name: הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: למדו את פרוטוקול הבידוד של פירופוספטי אינוזיטול באיכות גבוהה באמצעות תגובות אנזימטיות וג'ל אלקטרופורזה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לייצר ולנקות IP7 לחקר מסלולי סיגנל בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים א ריקיו להערות מועיל לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה במימון רפואי (MRC) מחקר ליחידת ביולוגיה של התא ועל ידי האדם Frontier Science Program גרנט (RGP0048/2009-C).

1. תגובת אנזימתי - יום 1 (1 שעה אחר הצהריים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הראשון הוא להכין 10-20 תגובות אנזימטיות עצמאית שבה IP 6 K1 או VIP1 להמיר IP 6 ל isoforms pyrophosphorylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים ב-IP שלו 6 K1 ו-GST Vip1 אנזימים מטוהרים מן E. coli לפי הפרוטוקול קודם לכן תיאר 17,18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 תגובות μL המכיל 1X חיץ תגובה (30 mM Hepes pH 6.8, 50 mM NaCl, 6 מ"מ MgSO 4, 1 mM DTT), 6 PhosphoCreatine מ"מ (PCR), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg מלח), 0.3 mM IP6, 0.05-0.1 מיקרוגרם-IP שלו 6 K1 או GST-Vip1. כוונן את עוצמת הקול עם MiliQ DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה ספין התגובה לדגור על 37 מעלות צלזיוס לילה עם רוטציה. </li></ol> 2. ג'ל polyacrylamide הליהוק וטעינה - יום 2 (4 שעות אחר הצהריים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הג'ל polyacrylamide מוכן באמצעות 24 ס"מ אורך, 18 ס"מ צלחות זכוכית רחב 1.5 מפרידי רחב מ"מ. בדרך כלל בסמטה 16 או מסרק נתיב יחיד preparative משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת (50 mL / ג'ל) המכיל את הדברים הבאים: 35.5% (w / v) Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:01, 1X טריס / borate / EDTA (TBE), 0.05% (w / v) persulfate אמוניום (APS ), 0.05% (w / v) Temed. יוצקים את תערובת בין טרום casted לוחות זכוכית, הכנס את המסרק ולתת לפלמר במשך 30-60 דקות בכל RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג'ל יש polymerized, להעביר את מנגנון לחדר קר מראש לרוץ TBE 1X למשך כ 30-60 דקות ב 200-300 וולט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1X של OrangeG צבען (10 mM טריס-HCl pH7.0, 1 mM EDTA, גליצרול 30%, 0.1 OrangeG%) לתגובה כל אחד. הכן מדגם המכיל 2 nmol IP של 6 כדי לטעון כביקורת רגילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו ביסודיות עם כל טוב מפעיל המאגר באמצעות מזרק ומחט 21G להסיר כל המשקע, ואז לטעון את הג'ל. הימנע טעינה על בארות לוואי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ג'ל לילה בבית 450-550 וולט (7 mAmp / ג'ל), עד שהלהקה לצבוע OrangeG הוא בתוך 10 ס"מ האחרונה מתחתית הג'ל. </li></ol> 3. בידוד ה-IP של 7 - יום 3 (4 שעות) יום 4 (07/06 SpeedVac שעה תהליך הייבוש) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את המנגנון ג'ל ובזהירות להסיר את אחד צלחת זכוכית עוזב את הג'ל על השני. חותכים חלק קטן מן הג'ל מעל הלהקה לצבוע OrangeG לתחתית המכיל את תקן ה-IP 6 ואחד במסלול מדגם, כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם לחתוך את החלק של הג'ל עם Toluidine כחול (0.1% (w / v) toluidine כחול, 20% (w / v) מתנול, 2% (w / v) גליצרול) במשך כמה דקות (1-3 דקות) או עד pyrophosphate אינוסיטול הלהקה מופיעה. שים את צלחת זכוכית הוסרו בעבר חזרה על גבי ג'ל כדי למנוע את הג'ל בלא כתם מהתייבשות. </li></ol> להקת ה-IP 7 צריך להיות גלוי מאז הוא פועל מעט איטי יותר מאשר תקן ה-IP 6. ה-ATP, אשר פועל מהר יותר מאשר 6 IP, צריך גם להיות גלוי (איור 1). מעבירים את החלק המוכתם של הג'ל בתמיסה דה מכתים (20% (w / v) מתנול) במשך כמה דקות, לשטוף את כל העולה על Toluidine כחול למקם את הג'ל עם הג'ל בלא כתם. אם להדמיה של יותר isoforms אינוסיטול pyrophosphorylated (IP ו-IP 8 9) נדרש, הכתם ג'ל עם פתרון מכתים כחול Toluidine במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את בלו Toluidine עם פתרון דה מכתים במשך כ -15 דקות. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם סכין גילוח לחתוך את להקת ה-IP 7 על החלק בלא כתם של ג'ל באמצעות כהפניה את עמדת ה-IP 7 נודדות נקבע עם הג'ל צבעונית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את להקת ה-IP 7 כי נחתך מן הג'ל על שפופרת 15 מ"ל והוסף 10 מ"ל של MilliQ DDH 2 O. שים צינורות סיבוב במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מחק את הנוזל כדי להסיר עודף של חלקיקי acrylamide TBE ו מיקרוסקופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לבצע שתי התייבשות-הידרציה מחזורים. הוסף 5 מ"ל של 50% (w / v) מתנול אל הצינור עם ג'ל המכיל 7 IP ולסובב בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. מעבירים את הפרוסה ג'ל לצינור חדש 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של MilliQ DDH 2 O ולסובב בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. אין להשליך את מתנול MilliQ H 2 O מן הצינורות. חזור על מחזור התייבשות-הידרציה עוד פעם מחדש על ידי העברת ג'ל polyacrylamide ב 15 צינורות מ"ל השתמשו בעבר. אחד שוטף יכול להתבצע במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכז את ה-IP eluted 7, יבש 10 מ"ל יחד (5 מ"ל MilliQddH 2 O ו - 5 מ"ל 50% (w / v) מתנול) באמצעות SpeedVac מחומם על 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגימות הם כמעט יבש, להעביר את הנוזל הנותר (300-600 μl) אל צינור a1.5 מ"ל צנטריפוגות ספין 2 דקות בסל"ד 5000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ולהעביר לתוך צינור צנטריפוגות טריים 1.5 מ"ל; לעזובμL התחתונה 20-30 שכן הוא עשוי להכיל חלקיקים acrylamide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך להמשיך את תהליך הייבוש באמצעות SpeedVac מוסק. ההתאוששות של ה-IP 7 מצטמצם באופן דרמטי אם הדגימות להתייבש לחלוטין, ולכן לסיים את תהליך הייבוש כאשר הדגימות להגיע נפח μL 100-300. </li></ol> 4. קביעת ריכוז 7 טוהר ה-IP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2-5 μL של המדגם התאושש IP 7 לרוץ על ג'ל דף, בדומה סעיפים 2.2-2.5. טען דילולים מספר 6 של ה-IP (כלומר, 0.5, 1, 2, 4 nmol) כסטנדרט ריכוז 4 nmol של סמן Poly-P. לאחר הפעלת ג'ל, לדמיין את isoforms pyrophosphate אינוסיטול ידי מכתים ו-de מכתים את הג'ל שלם עם פתרון Toluidine כחול, בעקבות ההליך המתואר בסעיף 3.2 (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכתים Toluidine, ריכוזי ניתן לקבוע על ידי סריקת הג'ל ומשווה את ההבדלים בעוצמת בין 6 IP ו-IP 7, באמצעות תוכנת הדמיה כגון J-תמונה, כפי שמוצג באיור 2B. </li></ol> 5. נציג תוצאות: ההמרה preparative האנזימטית של ה-IP ל-IP 6 7 IP באמצעות אנזימים 6 K1 ו VIP1 ניתן לפתור בקלות באמצעות ניתוח PAGE (איור 1). הטעינה של 6 IP כביקורת גודל יחד עם מכתים ג'ל כחול Toluidine מאפשר זיהוי derivates pyrophosphorylated, שכן הם לרוץ לאט בהתאם למספר קבוצות פוספט הנוכחי על הטבעת אינוסיטול. ההליך המתואר לעיל מאפשרת טיהור קל של 7 IP. ניתוח pyrophosphate אינוסיטול מטוהרים על ידי גילה את הטוהר של ה-IP שלנו 7 (איור 2 א). מעניין, 5 1/3PP-IP האיזומר של מוצר ה-IP של 7 VIP1 נודד מעט איטי יותר מאשר האיזומר 5 5PP-IP של 7 IP שנוצר על ידי ה-IP 6 K1. שימוש של 6 תקנים IP היתר כימות קל של ריכוז ה-IP מטוהרים 7 (איור 2B). לפני השימוש 7 IP עבור ניסויים נוספים, הפעילות הביולוגית שלו ניתן להעריך (איור 3). 5PP IP-5 הוא מודגרות עם VIP1 ועם phosphatase 7 IP DDP1 (phosphohydrolase diphosphoinositol polyphosphate). באופן שגרתי, את ה-IP מטוהרים 7 מומר IP 8 על ידי VIP1 ו-IP 6 על ידי DDP1 (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1:. מכתים Toluidine הדף ובידוד של הלהקה 7 IP החלק של ג'ל המכיל את תקן (IP 6) נחתך ומוכתמת באמצעות פתרון כחול Toluidine. שלוש להקות מייצגים (מלמעלה למטה) IP 7, 6 ו - IP-ATP. החלק המוכתם של ג'ל היה מיושר אז עם הנותרים של הג'ל. זה מאפשר לוקליזציה של החלק של ג'ל המכיל 7-IP, אשר לאחר מכן ניתן לחתוך מטוהרים (תיבת מקווקו). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: ניתוח עמוד של מוצרים 6 K1 ו VIP1 IP התגובה. א) ניתוח של ה-IP 6 (4, 2, 1, 0.5 nmol) על ידי מכתים Toluidine כחול היה בשימוש על מנת לקבוע את ריכוז ה-IP 7 מטוהרים משני 6 K1 IP (IP 5PP-5) ו VIP1 (1/3PP-IP 5) התגובות. B) העלילה ניתוח פיזור כדי לקבוע את ריכוז ה-IP מטוהרים 7. ריכוזים נקבעו לפי עוצמת הלהקה, מחושב באמצעות תוכנת imageJ, לעומת מראש כמויות של 6 IP. ציר ה-X מייצג את עוצמות; ציר Y מייצג את ריכוזי לידי ביטוי nmol. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3:. ניתוח הפעילות הביולוגית 7-IP כדי לקבוע את איכות ה-IP מטוהרים 7 אנו מודגרות 5PP-IP 5 (IP 6 K1 IP שנוצר 7) עם VIP1 או עם phosphatase 7 IP DDP1 והחליט אז התגובה בדף. מכתים DAPI ו Toluidine חשף את הייצור הצפוי של 8 IP ידי VIP1 ואת ההמרה של ה-IP ל-IP 7 6 על ידי DDP1.

<ol><li>Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+metabolism+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).</li>
<li>Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+inositol+pyrophosphates+signalling+molecules%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Are inositol pyrophosphates signalling molecules?</a> J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).</li>
<li>Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates%3A+structure%2C+enzymology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).</li>
<li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphosphoinositol+polyphosphates%3A+metabolic+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers.</a> Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).</li>
<li>Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate+by+a+newly+identified+family+of+higher+inositol+polyphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases.</a> Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).</li>
<li>Draskovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+hexakisphosphate+kinase+products+contain+diphosphate+and+triphosphate+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups.</a> Chem Biol. 15, 274-286 (2008).</li>
<li>Mulugu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+family+of+enzymes+that+phosphorylate+inositol+hexakisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate.</a> Science. 316, 106-109 (2007).</li>
<li>Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+two+human+VIP1-like+inositol+hexakisphosphate+and+diphosphoinositol+pentakisphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases.</a> J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).</li>
<li>Illies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+inositol+pyrophosphates+for+full+exocytotic+capacity+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells.</a> Science. 318, 1299-1302 (2007).</li>
<li>Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+cell+death+and+telomere+length+through+phosphoinositide+3-kinase-related+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).</li>
<li>York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+diphosphate+signaling+regulates+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inositol diphosphate signaling regulates telomere length.</a> J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).</li>
<li>Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+mediate+chemotaxis+in+Dictyostelium+via+pleckstrin+homology+domain-PtdIns%283%2C4%2C5%29P3+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions.</a> Cell. 114, 559-572 (2003).</li>
<li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).</li>
<li>Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plc1p%2C+Arg82p%2C+and+Kcs1p%2C+enzymes+involved+in+inositol+pyrophosphate+synthesis%2C+are+essential+for+phosphate+regulation+and+polyphosphate+accumulation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphate+mediated+pyrophosphorylation+of+AP3B1+regulates+HIV-1+Gag+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).</li>
<li>Bhandari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+pyrophosphorylation+by+inositol+pyrophosphates+is+a+posttranslational+event%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).</li>
<li>Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+InsP7+by+the+Inositol+Hexakisphosphate+Kinase+1+%28IP6K1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1).</a> Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).</li>
<li>Otto, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+inositol+phosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of inositol phosphate kinases.</a> Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).</li>
<li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity%3A+analysis+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השימוש pyrophosphate אינוסיטול בביוכימיה מוגבלת בשל זמינותו המסחרי של תרכובות כאלה רגישות העניים של שיטות זיהוי קיימות. השילוב של דף, המאפשר הפרדה של מולקולות בעלי מספר שונה של קבוצות פוספט, וכן Toluidine כחול (איור 1), צבע metachromatic אשר נקשר קבוצות פוספט, מאפשר זיהוי קל של isoforms pyrophoshate אינוסיטול פתיחת אפיקים חדשים של מחקר 20. השימוש בטכנולוגיה המתוארת PAGE לטהר מוצרים pyrophosphate אינוסיטול התגובה האנזימטית נשאו outby או 6 IP K1 או VIP1 היא שיטה פשוטה, כלכלית אמינה המאפשרת ייצור של כמויות גדולות של ה-IP באיכות גבוהה 7. השיטה שתוארה לעיל אינה מוגבלת טיהור הפשוט של ה-IP 7 אבל שינויים קלים של פרוטוקול המתואר עשוי לאפשר טיהור של מגוון שונה של pyrophosphates אינוסיטול. פוספורילציה גבוהה isoforms pyrophosphate אינוסיטול, המכיל יותר משמונה קבוצות פוספט ניתן לאתר באמצעות IP 7 או כמויות שונות של 6 IP כמו מצע 20,6. Pyrophosphates אינוסיטול אלה ניתן לאתר על ידי הגדלת אורך ההליך מכתים ולאחר מכן מטוהרים (סעיף 3.2). יתר על כן, השימוש 5 IP כמו המצע של התגובה האנזימטית תאפשר טיהור PP-IP ו 5 pyrophosphates אינוסיטול אחרים המכילים קבוצת הידרוקסיל על הטבעת אינוסיטול. לסיכום, שיטה זו מאפשרת תובעני לטיהור אמין של כמויות מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול עם מכשירים זמינים באופן נרחב, ובכך פותח אפיקים חדשים בתחום מחקר זה מרגש.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Phytic חומצה (IP 6) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> Poly-P (hexametaphosphate נתרן) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP-Mg 2 + מלח </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> PhosphoCreatine (PCR) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> CreatinePhospho קינאז (CPK) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST-Vip1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> שלו, IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> שלו, Ddp1 </td><td> זמין במעבדה </td><td> זמין במעבדה </td></tr><tr><td> Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:01 (40%) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> אמוניום Persulfate (APS) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> טריס / borate / EDTA (TBE) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T 9060 </td></tr><tr><td> Temed </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> Toluidine כחול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> המשיח </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> ג&#39;ל מנגנון </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> אבק סעפת </td><td> המשיח </td><td> אלפא 2-4 </td></tr><tr><td> לשאוב אבק </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

הכנת pyrophosphates אינוסיטול איכות

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

מיו-אינוסיטול נמצא בטבע ללא שינוי או יותר derivates phosphorylated מורכבים. מבין האחרונים, שני הנפוץ ביותר התאים האיקריוטים הם pentakisphosphate אינוסיטול (IP 5) ו hexakisphosphate אינוסיטול (חומצה phytic IP או 6). IP ו-IP 5 6 הם מבשרי של מולקולות pyrophosphate אינוסיטול המכילים אחד או יותר אג&quot;ח pyrophosphate 1. זירחון של ה-IP 6 מייצר diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 או PP-IP 5) ו bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP או 8 (PP) 2-IP 4). Pyrophosphates אינוסיטול היה מבודד מכל אורגניזמים אוקריוטים למד עד כה. בנוסף, שני מעמדות שונים של אנזימים האחראים סינתזה pyrophosphate אינוסיטול שמורים לאורך האבולוציה מאוד 2-4. IP 6 קינאזות (IP 6 Ks) posses גמישות עצומה קטליטי, ממיר ה-IP ו-IP 5 6-4 PP-IP ו-IP 7 בהתאמה, ולאחר מכן, באמצעות מוצרים אלה מצעים, לקדם את הדור של מולקולות מורכבות יותר 5,6 . לאחרונה, בשיעור השני של אנזימים pyrophosphate יצירת זוהה בצורה של החלבון שמרים VIP 1 (התייחס גם PP-IP 5 K), אשר מסוגלים להמיר 6 IP ל-IP ו-IP 7 8 7,8. Pyrophosphates אינוסיטול להסדיר רבים בתהליכים תאיים שונים כגון הפרשת אינסולין 9, אורך הטלומרים 10,11, 12 chemotaxis, סחר שלפוחי 13, הומאוסטזיס פוספט 14 ו-HIV-1 לשחרר איסור פרסום 15. שני המנגנונים של פעולות הוצעו לסוג כזה של מולקולות. הם יכולים להשפיע על התפקוד התאי ידי allosterically אינטראקציה עם חלבונים ספציפיים כמו AKT 16. לחלופין, הקבוצה pyrophosphate יכול לתרום פוספט מראש phosphorylated חלבונים 17. הפוטנציאל העצום של תחום מחקר זה הוא הקשו על ידי בהעדר מקור המסחרי של pyrophosphates אינוסיטול, אשר מונע מדענים רבים ללמוד את המולקולות הללו ואת זה שינוי החדשה שלאחר translational. השיטות הקיימות כיום לבודד pyrophosphates אינוסיטול דורשים מנגנון מתוחכם chromatographic 18,19. נהלים אלה להשתמש תנאים חומציים שעשוי להוביל השפלה pyrophosphate אינוסיטול 20 ובכך התאוששות עניים. יתר על כן, מסורבלת פוסט טור נהלים desalting להגביל את השימוש שלהם במעבדות מיוחדות. במחקר זה אנו מתארים שיטה תובעני לבידוד, הדור וטיהור של המוצרים של kinase-6 IP ו-IP PP-5-קינאזות תגובות. שיטה זו התאפשרה על ידי היכולת של ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד) כדי לפתור polyphosphates אינוסיטול phosphorylated מאוד 20. לאחר 6 IP K1 ו PP-IP 5 תגובות אנזימטיות באמצעות 6 K-IP כמו המצע, PAGE שימש להפריד את pyrophosphates אינוסיטול שנוצר שהיו eluted לאחר מכן במים.

Pyrophosphates אינוסיטול לשחק תפקיד חשוב פתולוגיות אדם כגון סרטן, סוכרת, והשמנה, אך מנגנון הפעולה המדויק אינו עניין של מחלוקת. חוסר pyrophosphates אינוסיטול זמינים מסחרית הופכת מחקרים מפורטים בעייתי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר ולבודד מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול.

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

מיו-אינוזיטול (Myo-inositol) נמצא בטבע במצב לא שעבר שינוי או כנגזרות מאופספורלציה מורכבות יותר. מבין האחרונות, השתיים השכיחות ביותר בתאים איקריוטיים...

המטרה הכללית של הליך זה היא לייצר ולטהר pyrophosphate באיכות גבוהה ובצורה נקייה. הדבר מושג תחילה על ידי שימוש ב-IP six כסובסטרט עבור IP six kinase, אנזים המשמש לייצור IP seven. לאחר מכן, התגובות האנזימטיות נטענות על ג'ל פוליאמיד והפס המתאים ל-IP seven נגזר.לאחר מכן מבודדים את IP seven באמצעות מחזורי התייבשות והידרטציה עוקבים. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא אישור טוהר המוצר וקביעת הריכוז. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את הפעילות הביולוגית של IP seven באמצעות אינקובציה של IP seven.בעזרת קינאז VIP one ובסיוע הפוספטאז IP seven DDP one, תגובות אלו מייצרות IP eight ו-IP six בהתאמה. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי השליח התאי IP seven. ניתן ליישמה גם במערכות אחרות, כגון בחלק מפוספטים דוגמת IP eight או PPIP four הגזורה מ-IP five.פרוטוקול זה מתחיל בהכנת תגובות אנזימטיות שבהן IP six kinase one או VIP one ממירים IP six לאיזופורמים קשורי pyro phospho. לצורך הדגמה זו, אנזימי IP six kinase one מתויגים ב-histamine ואנזימי VIP one מתויגים ב-GST טוהרו מ-e coli על פי נוהל שתואר בעבר. לתחילת העבודה, הכינו 10 עד 20 תגובות אנזימטיות עצמאיות המכילות IP six ו-his IP six kinase one או GST VIP one כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.השלם את הנפח ל-50 µL באמצעות מים מזוקקים פעמיים מסוג milli Q. לאחר סבב קצר של המבנבנות בצנטריפוגה, דגרי את התגובות בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה עם סיבוב.בשלב הבא, כביו תמיסת ג'ל שהוכנה מראש בין לוחות הזכוכית שהוצמדו, בנפח של 50 milliliters לכל ג'ל. הכניסו את המסרק והמתינו לפולימריזציה של הג'ל במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שהג'ל עבר פולימריזציה, העבירו את המכשיר לחדר הקירור.הריצו את הג'ל מראש ב-TBE בריכוז 1x למשך כ-30 עד 60 דקות במתח של 200 עד 300 וולט, ובמקביל צבעו ב-orange G בריכוז 1x. לכל תגובה, הכינו דגימת ביקורת סטנדרטית המכילה 2 mol של IP six. לאחר ההרצה המוקדמת, שטפו היטב כל באר עם תמיסת ריצה.השתמשו במזרק המחובר למחט במידה 21 כדי להסיר כל משקע. לאחר מכן, העמיסו את הדגימות אל הג'ל, תוך הימנעות מהעמסה בשני הנתיבים הראשונים ובשני הנתיבים האחרונים של הג'ל. לבסוף, הריצו את הג'ל למשך הלילה בזרם של 7 mA לכל ג'ל, עד שפס צבע ה-orange G יגיע ל-10 הסנטימטרים האחרונים בתחתית הג'ל.כדי להתחיל בבידוד של IP seven, פרקו את מכשיר הג'ל והסירו בזהירות פלטה אחת מזכוכית, והשאירו את הג'ל על הפלטה השנייה. גזרו חלק קטן מהג'ל החל מרגע מעל פס ה-GD הכתום ועד למטה, כולל את סטנדרט ה-IP six ונתיב דגימה אחד. צבעו את החלק הגזור של הג'ל בצבע toluidine blue למשך מספר דקות עד להופעת פס ה-Anatol Pyrophosphate.בינתיים, החזירו את לוחית הזכוכית שהוסרה קודם לכן אל מעל הג'ל כדי למנוע מהג'ל שאינו צבוע להתייבש. העבירו את החלק הצבוע של הג'ל לתוך תמיסת צביעה DES למשך מספר דקות כדי לשטוף עודפי toluidine blue, ולאחר מכן החזירו את הג'ל למקומו לצד הג'ל שאינו צבוע. פס IP seven אמור להיות גלוי מכיוון שהוא רץ מעט לאט יותר מאשר הסטנדרט IP six; פס TP, שרץ מהר יותר מ-IP six, אמור להיות גלוי גם הוא.בשלב הבא, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך את פס IP seven בחלק הבלתי צבוע של הג'ל. השתמשו במיקום ההגירה של IP seven שנקבע באמצעות הג'ל הצבוע. כדי להעריך את מיקומו של פס IP seven, העבירו את פס IP seven שנגזר מהג'ל למבחנה של 15 milliliter והוסיפו 10 milliliters של מים מזוקקים פעמיים מסוג milli Q.לאחר הדגירה, סובבו את המבחנות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הנוזל על ידי דקנטציה כדי להסיר שאריות של TBE וחלקיקי אקרילאמיד מיקרוסקופיים. לאחר מכן, בצעו שני מחזורי דהידרטציה והידרטציה על ידי הוספה ראשונית של חמישה מיליליטר של 50% methanol למבחנה המכילה את ג'ל ה-IP seven. סובב את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.לאחר מכן, העבירו את פרוסת הג'ל לפסולה חדשה של 15 milliliter המכילה חמישה milliliters של milli Q double distilled water וסובבו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. שמרו את הפסולה המכילה methanol לשימוש עתידי לאחר האינקובציה. חזרו על מחזור הדהידרציה וההידרטציה פעם נוספת כדי לרכז את ה-IP seven שנסח. ערבבו את חמשת המיליליטרים של המים ואת חמשת המיליליטרים של 50% Methanol שהוספו קודם לכן. ייבשו את התמיסה המשולבת באמצעות speed vac המחומם ל-60 °C. כאשר הדגימות כמעט יבשות, העבירו את הנוזל שנותר לפ menutup של מבחנת צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter.סובב את המבחנה במשך שתי דקות במהירות של 5,000 סל"ד. אסוף את ה-SUP natant והשאר את 20 עד 30 המיקרוליטרים התחתונים, מכיוון שהם עשויים להכיל חלקיקי אקרילאמיד. העבר את הדגימה למבחנה צנטריפוגית נקייה בנפח של 1.5 מיליליטר.במידת הצורך, המשיכו את תהליך הייבוש באמצעות speed vac ללא חימום. השחזור של IP seven פוחת באופן דרמטי אם הדגימות מתייבשות לחלוטין. לפיכך, חובה להפסיק את תהליך הייבוש כאשר הדגימות מגיעות לנפח של 100 עד 300 microliters.לאחר שחולץ ה-IP seven, טענו שתיים עד חמש µL מהמדגם על ג'ל עמוד (page gel) כדי לקבוע את ריכוזו ואת טהורתו. טענו מספר דילולים של IP six כסטנדרטים של ריכוז ו-4 mol של סמן פוליפ (polyp marker). לאחר הרצת הג'ל, הדמיחו את איזופורמיו של הפירופוספט הראשוני על ידי צביעה והסרת צבע של הג'ל כולו באמצעות תמיסת toluidine blue.בעקבות הפרוצדורה שתיארה כעת לאחר צביעה בטולואידין, ניתן לקבוע את הריכוזים על ידי סריקת הג'ל והשוואת ההבדלים בעוצמה בין IP six ל-IP seven. באמצעות תוכנת דימוי כגון Image J, ניתן להבחין בקלות בהמרה אנזימטיתpreparative של IP six ל-IP seven באמצעות אנזימי IP six kinase one ו-VIP one, זאת באמצעות אנליזת page.טעינת IP six כביקורת לגודל יחד עם צביעת ג'ל ב-toluidine blue מאפשרת זיהוי של נגזרי הפירו-פוספורילציה. מכיוון שהם נעים לאט יותר, בהתאם למספר קבוצות הפוספט הנוכחות במוצא, הפרוצדורה המתוארת לעיל הובילה לטיהור קל של IP seven. יתרה מכך, ניתוח של pyrophosphate anatol המטוהר באמצעות PAGE חשף את רמת הטוהר של IP seven.מעניין לציין כי האיזומר של IP5 בעל פירופוספט במיקום אחת-שלוש של תוצר ה-IP7 של VIP1 נודד מעט לאט יותר מהאיזומר של IP5 בעל פירופוספט במיקום חמש של VIP7 הנוצר על ידי IP6 kinase 1. השימוש בתקני IP6 מאפשר כימות קל של ריכוז ה-IP7 המופק לפני השימוש ב-IP7. לניסויים נוספים, ניתן להעריך את הפעילות הביולוגית שלו.חמש.מבצעים אינקובציה של Pyrophosphate IP five עם FIP one ועם הפוספטאז IP seven DDP one באופן שגרתי. IP seven מטוהר ממיר ל-IP eight על ידי VIP one ול-IP six על ידי DDP one. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון צביעה ממושכת ב-toluin blue, על מנת להשיב על שאלות נוספות, כמו בידוד של IP eight או צורות איזופורמיות זלפוספטיות אחרות.

preparation-of-quality-inositol-pyrophosphates

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים.

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

פרוטוקול להכנת diastereoselective בסיר אחד של ציס - N-TS-iodoaziridines מתואר. הדור של diiodomethyllithium, בנוסף לaldimines N-Ts וcyclization של אמין פנינה-diiodide ביניים לiodoaziridines מודגם. כן נכלל בפרוטוקול במהירות וכמותית להעריך את השלב נייח המתאים ביותר לטיהור על ידי כרומטוגרפיה.

סינתזה וטיהור של Iodoaziridines עירוב כמותי בחירת האופטימלית נייח השלב לכרומטוגרפיה

Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו 3 H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

כאן אנו מציגים bilayer שומנים בדם בהקשר של פלטפורמת microfluidic ללמוד אינטראקציות חלבון- phosphoinositide בשיטה ללא תווית המבוססת על אפנון pH.

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

פרוטוקול לסינתזה של טוהר גבוהה nonsymmetric dialkylphosphinic extractants חומצה מוצג, לוקח (2, 3-dimethylbutyl) (2,4, 4'-trimethylpentyl) חומצה phosphinic כדוגמה.

סינתזה של טוהר גבוהה חומצה Dialkylphosphinic Nonsymmetric Extractants

מאמר זה מציג את הליך לחקור את ספיחה של phosphonates על גבי חומרי הסינון המכילים ברזל הידרוקסיד ferric פרטנית במיוחד, עם קצת מאמץ ואמינות גבוהה. בפתרון במאגר, פוספונאט הוא הביא במגע עם adsorbent באמצעות מסובב ולאחר מכן נותחו באמצעות שיטה נחישות זרחן ולמחקר.

אופטימיזציה הליך לקביעת ספיחה של Phosphonates על גבי הידרוקסיד Ferric פרטנית באמצעות שיטה נחישות זרחן מיניאטורי

אנו מתארים שיטה פשוטה על כימות מהירה של אי-אורגנית הפוליפוספאט בחיידקים מגוונים, כולל זנים גראם שליליים, גראם חיובי ו- mycobacterial.

Assaying עבור הפוליפוספאט אורגניים של חיידקים

פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של חלבונים התאגד כדי אינוזיטול פוספטים או פוספופנוסיידים. היא משתמשת בכרומטוזיקה באמצעות מלחי הביוטיטול או פוספופנוסידים הנמצאים בדרך streptavidin לחרוזים או חרוזי מגנטים. אינוזיטול פוספט או פוספוליזיסיטייז מחייב חלבונים מזוהים על ידי בלוק מערבי או ספקטרומטריה מאסיבית.

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

כאן אנו מתארים חילופי אניון חזקים כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים של [3H]-מיו-אינוזיטול תווית שתילים אשר היא שיטה רגישה מאוד כדי לזהות ולכומת פוליפוספטים אינוזיטול בצמחים.

מיצוי וכימות של פוליפוספטים לאנוזיטול מסיסים עם תיבול רדיו ממין צמחי שונים באמצעות SAX-HPLC

מתואר הליך לאלקטרופורזה נימית אלקטרופורזה ספקטרומטריית מסת יינון עבור הכמות המוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים מתמציות תאי יונקים.

כמות מוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים על ידי אלקטרופורזה נימית אלקטרוספריי ספקטרומטריית מסה יינון

למדו את פרוטוקול הבידוד של פירופוספטי אינוזיטול באיכות גבוהה באמצעות תגובות אנזימטיות וג'ל אלקטרופורזה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לייצר ולנקות IP7 לחקר מסלולי סיגנל בתאים.

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

גלה סרטונים נוספים