בדיקת מבחנה להערכת ציטוטוקסיות של תאי הרג טבעיים כנגד תאים סרטניים

קח צלחת מרובת בארות המכילה תאי הרג טבעיים, או NK, ותאים סרטניים. בארות בקרה מכילות רק תאים סרטניים.

צנטריפוגה כדי להקל על מגע סלולרי.

דגירה. הפעלת קולטנים על תאי NK נקשרים לליגנדים על פני התא הסרטני, וגורמים לתאי NK לשחרר גרגירים המכילים מולקולות ציטוטוקסיות.

מולקולות אלו יוצרות נקבוביות בקרום התא הסרטני וגורמות לאפופטוזיס המשחרר תוכן תוך תאי, כולל לקטט דהידרוגנאז, או LDH.

הוסף חומר ניקוי כדי ליז את התאים הסרטניים בבארות בקרה לשחרור LDH מקסימלי.

צנטריפוגה והעברת חלק מהסופרנטנטים המכילים LDH ללוחית בדיקה.

הוסף את מגיב הבדיקה ודגירה.

LDH ממיר לקטט לפירובט ומפחית NAD+. דיאפוראז משתמש ב-NADH כדי להפחית מלח טטרזוליום, ויוצר מוצר פורמאזאן בצבע אדום.

הוסף תמיסה חומצית כדי לעצור את התגובה האנזימטית.

השתמש בקורא מיקרו-פלטות כדי למדוד את ספיגת הפורמזן בבארות.

עוצמת הפורמזן פרופורציונלית למספר תאי הסרטן הליזים בבאר הבדיקה, מה שמעיד על ציטוטוקסיות של תאי NK כנגד תאים סרטניים.

ראשית, השג צלחת 96 בארות שטופלה בתרבית עם תחתית עגולה, והגדר אותה כמתואר בטבלה 1 של פרוטוקול הטקסט. צנטריפוגה את לוחית הבדיקה ב-250 פעמים גרם למשך 4 דקות כדי להיות בטוחים שתאי האפקטור ותאי המטרה נמצאים במגע. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 5 שעות.

45 דקות לפני קצירת הסופרנטנטים, הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת ליזה פי 10 לבארות שחרור ה-LDH המקסימליות של תא המטרה, והחזר את הצלחת לתא הלח. בסיום הדגירה, צנטריפוגה את הצלחת ב -250 פעמים גרם למשך 4 דקות. לאחר מכן, השתמש בפיפטור רב-ערוצי כדי להעביר 50 מיקרוליטר מכל באר לצלחת בדיקה טרייה עם תחתית שטוחה של 96 בארות.

הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב בדיקה לכל באר של לוחית הבדיקה. מכסים את הצלחת בנייר כסף כדי להגן עליה מפני אור, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר. הקפד לקרוא את הצלחת תוך שעה מהוספת תמיסת העצירה ורשום את הספיגה ב-490 ננומטר.