Name: סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: למד כיצד למדוד פעילות רשתית בפרוסות קליפת מוח מתפתחות באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן. שיטה זו מאפשרת תיעוד פעילות מסונכרנת של נוירונים ואסטרוציטים ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה במעבדה נתמך על ידי Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) (917.10.372) כדי rmm. JD המזוהה עם האיחוד האירופי FP7 BrainTrain התוכנית ( <a href="http://www.brain-train.nl">www.brain-train.nl</a> ). אנו מודים פיטר לורנס ו-Baljon סבין שמיץ (שניהם CNCR, אוניברסיטת VU באמסטרדם) עבור תמונות של מערך FP multielectrode גל ותרבויות עצבי המשמשים רצף וידאו.

<ol><li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li>
<li>Khazipov, R., Luhmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+patterns+of+electrical+activity+in+the+developing+cerebral+cortex+of+humans+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Early patterns of electrical activity in the developing cerebral cortex of humans and rodents.</a> Trends in Neurosciences. 29, 414-418 (2006).</li>
<li>Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity+in+early+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical activity in early neuronal development.</a> Nature. 444, 707-712 (2006).</li>
<li>Adelsberger, H., Garaschuk, O., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+calcium+waves+in+resting+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical calcium waves in resting newborn mice.</a> Nat. Neurosci. 8, 988-990 (2005).</li>
<li>Garaschuk, O., Linn, J., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+oscillatory+calcium+waves+in+the+immature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale oscillatory calcium waves in the immature cortex.</a> Nat. Neurosci. 3, 452-459 (2000).</li>
<li>Lamblin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroencephalography+of+the+premature+and+term+newborn.+Maturational+aspects+and+glossary%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiol.+Clin%22%5BJournal%5D)">Electroencephalography of the premature and term newborn. Maturational aspects and glossary.</a> Neurophysiol. Clin. 29, 123-219 (1999).</li>
<li>Rakic, P., Komuro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptor%2Fchannel+activity+in+neuronal+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The role of receptor/channel activity in neuronal cell migration.</a> J. Neurobiol. 26, 299-315 (1995).</li>
<li>Spitzer, N. C., Root, C. M., Borodinsky, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+neuronal+differentiation%3A+patterns+of+Ca2%2B+spikes+specify+transmitter+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Orchestrating neuronal differentiation: patterns of Ca2+ spikes specify transmitter choice.</a> Trends. Neurosci. 27, 415-421 (2004).</li>
<li>Canto, C. B., Wouterlood, F. G., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+the+anatomical+organization+of+the+entorhinal+cortex+tell+us%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Plast%22%5BJournal%5D)">What does the anatomical organization of the entorhinal cortex tell us.</a> Neural. Plast. , 381243-381243 (2008).</li>
<li>Bureau, I., Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+development+of+functional+and+anatomical+columns+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Precise development of functional and anatomical columns in the neocortex.</a> Neuron. 42, 789-801 (2004).</li>
<li>Ikegaya, Y., Le Bon-Jego, M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+imaging+of+cortical+network+activity+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Large-scale imaging of cortical network activity with calcium indicators.</a> Neuroscience research. 52, 132-138 (2005).</li>
</ol>

LaVision BIOTEC GmbH (בילפלד, גרמניה) בחסות דמי הגשת כתב היד של מאמר זה.

שיטות אנחנו מדגימים כאן להראות פרוטוקולים מתאימים הדמיה סידן של רשת דינמיקה מתאי לזיהוי בתוך בפיתוח רשתות הקורטיקליים בהיפוקמפוס העכבר גם במוח חולדה. שיטות אלו מספקות רזולוציה מרחבית אופטימלית לדמיין רשת מקומית של somas תא בו זמנית למדידת פעילות suprathreshold. החלטה הזמני של פעילות הרשת יכולים להיות מגוונים, בהתאם למסגרת הרכישה הגדרות מצלמת CCD, כדי לייעל את האות: מדידות רעש לאורך זמן suprathreshold אירועים משך, נמצא בדרך כלל למערכת העצבים המתפתחת. פרוטוקולים אלה אינם מוגבלים לרשתות בהיפוקמפוס קליפת המוח, אלא גם תאים תווית ברחבי מערכת העצבים המתפתחת. המגבלה של שיטה זו הוא כי פעילות suprathreshold רק ניתן להקליט.

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

דפוס סימן ההיכר של פעילות בפיתוח מערכות העצבים היא פעילות ספונטנית, רשת מסונכרן. פעילות מסונכרן נצפתה פגע בחוט השדרה, המוח קליפת המוח, הרשתית ניתק ההכנות תרבות עצביים. בתקופות של פעילות ספונטנית, הנוירונים depolarize לפטר אחד או התפרצויות של הפוטנציאלים לפעולה, הפעלת תעלות יונים רבות. שלילת קוטביות מפעיל מתח מגודרת ערוצי סידן על דנדריטים קוצים לתווך זרימת סידן. הפעילות החשמלית מסונכרן מאוד כבר נמדד מרשתות נוירונים המקומית באמצעות אלקטרודות השדה. טכניקה זו מאפשרת דגימה גבוה שיעורי הזמני אך ברזולוציה מרחבית נמוכה עקב משולב לקריאה מתוך נוירונים מרובים בו אלקטרודה אחת. ברזולוציה של תא יחיד הפעילות העצבית אפשרי באמצעות תיקון-clamp electrophysiology על נוירונים בודדים כדי למדוד פעילות ירי. עם זאת, היכולת למדוד מרשת מוגבל במספר הנוירונים תוקנו simultaneously, ובדרך כלל הוא רק אחד או שניים נוירונים. השימוש סידן תלויי צבעי ניאון אינדיקטור אפשרה מדידה של פעילות מסונכרנת ברשת של תאים. טכניקה זו מאפשרת הן ברזולוציה מרחבית גבוהה הדגימה הזמני מספיק כדי לתעד פעילות ספונטנית של הרשת המתפתחת. תכונה מרכזית של החדש יוצרי רשתות הקורטיקליים בהיפוקמפוס במהלך התפתחות טרום לידה מוקדמת ספונטנית, מסונכרן הפעילות העצבית (כץ &amp; שץ, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). פעילות זו רשת בקורלציה הוא האמין להיות חיונית עבור הדור של מעגלים תפקודית במערכת העצבים המתפתח (שפיצר, 2006). ב הפרימטים וגם המוח מכרסם, חשמל מוקדם רשת גלי סידן הם נצפו מראש ו לאחר הלידה in vivo ו in vitro (Adelsberger et al, 2005;. Garaschuk et al, 2000;.. Lamblin et al, 1999). אלה דפוסי הפעילות המוקדמות, אשר ידועים לשלוט בכמהתהליכים התפתחותיים כולל synaptogenesis העצבית בידול, ואת הפלסטיות (Rakic ​​&amp; Komuro, 1995;. שפיצר et al, 2004) הם בעלי חשיבות קריטית לפיתוח התבגרות נכונה של המעגלים קליפת המוח. בסרטון זה יופיטר, אנו מדגימים את שיטות לפעילות תמונה ספונטנית בפיתוח רשתות קליפת המוח. סידן רגיש אינדיקטורים, כגון Fura 2-AM אסתר מפוזר על פני קרום התא שבו פעילות esterase תאיים cleaves AM אסטרים לעזוב את צורת התא impermeant של צבע אינדיקטור. צורת impermeant של אינדיקטור יש קבוצות חומצה carboxylic אשר מסוגלים לזהות אז לאגד יוני סידן intracellularly .. הקרינה של סידן צבען רגיש משתנה transiently על כבילת סידן. שיטות הדמיה יחיד או רב פוטון משמשים למדידת השינוי הפוטונים הנפלטים להיות צבע, ובכך להצביע על שינוי בסידן תאיים. יתר על כן, אלה סידן-dהאינדיקטורים ependent יכול להיות משולב עם סמנים ניאון אחרים לחקור סוגי תאים בתוך רשת פעיל.

פעילות ספונטנית של פיתוח רשתות נוירונים ניתן למדוד באמצעות AM-אסתר צורות של סידן רגיש צבעים אינדיקטור. שינויים סידן תוך תאי, המציין ההפעלה העצבית, מזוהים כמו שינויים חולפות הקרינה אינדיקטור עם אחד או שני פוטונים הדמיה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאמים עבור מגוון של רשתות נוירונים התפתחותית תלויי<em&gt; במבחנה</em&gt;.

דפוס פעילות אופייני במערכות עצביות מתפתחות הוא פעילות רשתית סנכרונית וספונטנית. פעילות סנכרונית נצפתה ב...

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להדגים כיצד למדוד פעילות רשתית מנתחים של קליפת המוח בהתפתחותה באמצעות אינדיקטור פלואורסצנטי הרגיש לסידן. נתחי מוח DY מוכנים מקליפת המוח הפנימית המתפתחת של עכבר צעיר. הן נוירונים והן אסטרוציטים נטענים בסמנים התלויים בסידן.שינויים בפלואורסצנציה של צבעים תלויי סידן משקפים שינויים בפעילות התאית. ניתן לצבוע תאים שאינם נוירונליים, כולל אסטרוציטים, מיקרוגליה ותאי אנדותל, באמצעות צבעי סמן ספציפיים. פעילות של רשת קורטקלית מוקלטת באמצעות דימיון רב-פוטוני בשיטת time-lapse; תאים מזוהים בתוך הרשת על ידי יצירת ערימת תמונות תלת-ממדית (3D stack) דרך אזור העניין.ניתן לנתח שינויים בפלואורסצנציה תאית על פני תאים מרובים כדי לקרוא את הפעילות של הרשת הקורטיקלית המתפתחת. תבנית מאפיינת של פעילות במערכת העצבים המתפתחת היא פעילות רשתית סינכרונית ספונטנית. פעילות סינכרונית נצפתה באזורים נוירונליים מתפתחים רבים ושונים, כולל קורטקס של חוט שדרה שלם והכנות של תרביות נוירונים מפוזלים במהלך תקופות של פעילות ספונטנית, שבהם נוירונים עוברים דפולריזציה כדי להוציא פוטנציאלי פעולה בודדים או פרצים של פוטנציאלי פעולה המפעילים תעלות יונים רבות, כולל תעלות סידן תלויות-מתח המובילות להזרמת סידן.פעילות מסונכרנת ברמה גבוהה נמדדה מרשתות מקומיות באמצעות אלקטרודות שדה או מערכי רב-אלקטרודות. אלו מאפשרים קצבי דגימה זמניים גבוהים, אך מספקים רזולוציה מרחבית נמוכה יותר בשל הקריאה המשולבת של פעילות התאים. רזולוציה של תא בודד של פעילות עצבית אפשרית באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של patch clamp של נוירונים בודדים למדידת קצבי פריקה.עם זאת, היכולת למדוד מרשת מוגבלת למספר הנוירונים שנמצאים ב-patch בו-זמנית, ובדרך כלל מדובר בנוירון אחד או שניים בלבד. השימוש בצבעי סמן פלואורסצנטיים תלויי סידן אפשר את מדידת פעילות מסונכרנת על פני רשת של תאים. טכניקה זו מעניקה הן רזולוציה מרחבית גבוהה והן דגימה זמנית מספקת כדי להקליט פעילות ספונטנית של הרשת המתפתחת.אינדיקטורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן, כגון URA 2:00 AM ester, מכילים קבוצות חומצה קרבוקסית המסוגלות לקשור יוני סידן. צבעים פלואורסצנטיים אלו מופעלים על ידי אורכי גל ספציפיים של אור, באמצעות מיקרוסקופיית פוטון בודד או מיקרוסקופיית שני פוטונים. מספר הפוטונים הנפלטים מהצבע משתנה באופן זמני בעת קישור של סידן.שינוי זה במספר הפוטונים או בפלואורסצנציה מדווח כאות ה-delta FF ומת corresponds לשינוי ברמת הסידן בתוך הנוירון. מדידה של שינויים באינדיקטורים הרגישים לסידן היא מדד קריאה שימושי של דפוסי פעילות רשת בתאים מתפתחים. שלום, אני ריאנה מורטי, ושמי ג'ולי אבוטס.אנו מהמחלקה לנוירופיזיולוגיה פרשנית מהאוניברסיטה באמסטרדם. השתמשנו בדימות סידן כדי לחקור פעילות תפקודית ברקמה מתפתחת בקליפת המוח של עכבר, באמצעות אינדיקטורים רגישים לסידן בדימות מולטפוקאלי. מטרתו של סרטון קצר זה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש בשיטות אלו כדי למדוד דפוסי פעילות ספונטניים ומעוררים ברשתות מתפתחות במערכת העצבים.הוצא את המוח במהירות מגולגולתו של עכבר צעיר כדי לצמצם את הנזק למעגלים העצביים. בצע דיסקציה של המוח בתוך תמיסת פרוסות קרה (קרח). תמיסת הפרוסות מכילה coline chloride במקום הנתרן המשמש בדרך כלל ב-A TSF להקלטות עצביות.בניסויים אלו, אנו מכינים פרוסות מוח מהקליפה האנטרלית (enteral cortex) של מוח עכבר בשלבי התפתחות. הניחו פיסת נייר סינון על פלטת פטרי והרטיבו אותה בכמה מיליליטרים של A TSF. העבירו את המוח אל פיסת נייר הסינון.חצאי את ההמיספרים באמצעות להב תער בעל קצה יחיד. הפריד בין שני ההמיספרים. החזר את אחד מהם לתוך תמיסת הפריסה הקרה יחד עם ההמיספר הנותר.הסר את המוח הקטן (cerebellum) באמצעות להב תער. הפוך המיספרה אחת על קו האמצע שלה, ובצע חיתוך של כ-1 millimeter מהפני השגב (dorsal surface) בזווית קלה של הלהב לכיוון הקצה הרוסטרלי (rostral end). הפוך את המוח על.נקה את פני השטח שנגזרו לאחרונה באמצעות מקל צמר ושפכטל מתכת. העבר את המוח לבלוק החיתוך המתכתי. דחף בעדינות את המוח מהשפכטל באמצעות מקל צמר אל על המשטח המודבק.פרוסות מוח בעובי 300 Micrometer נחתכות; עבור רקמה צעירה, מהירויות החיתוך ותדירות הלהב הן בדרך כלל נמוכות יותר מאלו המשמשות לרקמה בוגרת יותר. לאחר החיתוך, העבר כל פרוסה באמצעות פיפטת זכוכית; הפרוסות מועברות לתא ההחזקה, המכיל A TSF מחומצן בטמפרטורת החדר. ה-A CSF מכיל יחס גבוה יותר של מגנזיום לסידן מאשר תמיסת ה-A CSF.הפרוסות המשמשות להקלטה נשארות למשך שעה אחת כדי להתאושש. כדי להעמיס לתאים אינדיקטור תלוי סידן או סמן ספציפי לתאים, יש להעביר את הפרוסות לתא לצורך הליך הצביעה. למרות שקיימים תאים מסחריים, ניתן להרכיב תא בקלות מציוד מעבדה סטנדרטי בעלות נמוכה מאוד.כדי להכין תא צביעה, תזדקקו לציוד מעבדה בסיסי הכולל שתי צלחות פטרי מפלסטיק, מזרק אחד של 10 milliliter, קטע של צינור סיליקה, תבנית להכנסת תרבית תאים בעלת ממברנה חדירה למחצה, דבק מהיר, שלושה מחברי צינורות קטנים ומחט דקה. קחו את צלחת הפטרי הגדולה וצרו חור קטן בדופן הצד באמצעות מוט מחומם. קחו את צלחת הפטרי הקטנה וצרו חור בעל קוטר דומה, שיהיה גדול מספיק כדי שצינור הסיליקון יוכל לעבור דרכו.העבירו קטע של צינור סיליקון דרך החור וצרו לולאה בתוך הצלחת הקטנה. השתמשו בדבק מהיר (super glue) כדי לאטום את הקצה הפתוח של הצינור. לאחר מכן, הדביקו את שאר הצינור לדופן הפנימית של צלחת הפטרי הקטנה.הניחו את פטריית השגב הקטנה במרכז הפטריה הגדולה והדביקו אותה במקומה. קחו את הקצה הנותר של צינור הסיליקון והעבירו אותו דרך החור הקטן בדופן פטריית השגב. השתמשו במחט עדינה כדי ליצור חורים קטנים בצינור הסיליקון בתוך פטריית השגב.בצעו את החורים במרווחי זמן שווים כדי להבטיח היתוך gasper אחיד. קחו באר לתרבית תאים עם ממברנה חדירה למחצה והשתמשו בסכין מנתחים מחוממת. חתכו את הסנטימטר העליון של הבאר כדי להשאיר צלחת רדודה להחזקת הפרוסות במהלך הדגירה.הניחו את הצלחת הרדודה במרכז הצלחת הקטנה, כך שתהיה מוקפת בצינורית הסיליקון נקבובית. צרו חור בקוטר של כחצי עד סנטימטר אחד במכסה של הצלחת הגדולה. קחו מזרק פלסטיק של 10 milliliter באמצעות סקלפל מחומם.בצעו חיתוך אלכסוני כדי להסיר את קצה המזרק. מרחו דבק מהיר (super glue) על פני השטח החתוכים של צינור המזרק. הדביקו זאת ישירות מעל החור במכסה של צלחת הפטרי הגדולה.חבר מחבר צינורית לקצה קצה המזרק. הנח את הצלחת הרדודה במרכז צלחת הפטרי הקטנה, תוך וידוא שצינורית הגז נקבובית מונחת מסביב לצלחת. צינורית זו מחוברת לאחר מכן לאספקת גז קרבוגן להחמצת החתכים בחמצן.במהלך האינקובציה, החזיר את המכסה של הצלחת הגדולה, המחוברת היא גם באופן ישיר לאספקת הגז באמצעות קצה המזרק. פעולה זו תבטיח אספקה של פחמן וגז מעל הפרוסות במהלך האינקובציה כדי למנוע דהייה של הצבע. כל הפרוצדורות מבוצעות בתנאי תאורה מינימליים ככל האפשר, והן הצבע והן הפרוסות נשמרים בחושך.מלאו את תא הצביעה בכ-1.5 milliliters של A TSF מתוך מחזיק הפרוסות. הכניסו את תא הממשק פנימה ומלאו אותו ב-1 milliliter נוסף של A TSF. חשוב לשמור על אספקת חמצן טובה כדי לשמור על בריאות הרקמה ולהבטיח טעינה טובה של הפרוסה.הצביעה מתבצעת בטמפרטורה של כ-35 °C כדי להקל על ספיגת הצבע לתאי העצב בזמן שתא הצביעה מתחמם. הכין את צבע האינדיקטור עבור fira 2:00 AM Ester. הוסף 9 µL של DMSO עם 1 µL של onic acid לבקבוקון של 50 µg.DMSO וחומצה אולאית. משמשים כחומרי חדירה (permeation agents) המאפשרים לצבע להיספג דרך ממברנת הליפידים. ערבבו את הבקבוק במערבל Vortex למשך 15 דקות כדי להבטיח שהצבע התמוסס לחלוטין. לצורך צביעה, העבירו כל פרוסה לממשק. הכניסו לתא הצביעה. טפטפו את הצבע ישירות על האזור הרלוונטי מעל הפרוסות, וסגרו את מכסה תא הצביעה.השאירו את הפרוסות לדגירה בחושך למשך 20 עד 40 דקות, בהתאם לגיל העכבר שבו נעשה שימוש. לאחר הדגירה, העבירו את הפרוסות בחזרה למחזיק הפרוסות כדי לשטוף שאריות של צבע עודף. ניתן להתאים את פרוטוקולי הצביעה עבור דימוי סידן גם לרקמות מבוגרות יותר.שלב זה דורש דגירה מקדימה נוספת. העבירו את הפרוסות הישנות לכלי דגירה מקדימה רדוד המכיל 3 mL של CSF ושמונה µL של תמיסת crema four בריכוז 0.5%. חממו ל-35 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לממשק (interface), הכניסו לתא הצביעה ופעלו לפי נהלי הצביעה הרגילים.ניתן לצבוע פרוסות אלו גם עבור תאים שאינם נוירונליים, דהיינו אסטרוציטים, מיקרוגליה ותאים אנדותלליים. ניתן להשתמש ב-Sulfur rumine 1 0 1 כדי לצבוע אסטרוציטים עבור sulfur domine. הכינו תמיסה בריכוז 10 µM וטפטפו את הצבע הסגול על האזור הרלוונטי בפרוסות.השאירו לדגירה למשך 15 דקות. העבירו את הפרוסות חזרה לתא ההחזקה כדי להסיר שאריות צבע עודפות. הצמיד FSE של לקטין עגבנייה יכול לצבוע מיקרוגליה ותאים אנדותליאליים.עבור לקטין עגבנייה, הכין תמיסה בריכוז של 20 micrograms per milliliter. טפטף את הצבע על אזור העניין בתוך הפרוסות. השאר את הפרוסות להדגרה למשך 45 דקות.לאחר מכן, העבירו את הפרוסות בחזרה לתא ההמתנה. במהלך ההדמיה, הפרוסות חייבות להיות יציבות תחת המיקרוסקופ. בדרך כלל מניחים נבל מתכת (metal harp) כדי להחזיק את הרקמה, אולם הוא עלול לעוות את פני השטח של הפרוסה באופן לא אחיד, מה שיוביל לשטח ראייה מוגבל שנמצא בפוקוס להדמיה, דבר שיש להימנע ממנו.פרוסות אלו נצמדות לתא ההקלטה באמצעות פוליאתילן או תמיסת PEI. PEI הוא פולימר המשמש לשיפור היצמדות תאים למשטח למשך שעה אחת לפחות. לפני הנחת הפרוסות בתאי ההקלטה, מלאו תאים אלו בכמה מיליליטרים של תמיסת PEI כדי לכסות את רצפת התא.ראשית, שטפו את ה-PEI מהתא באמצעות מים מזוקקים, ולאחר מכן תמיסת CSF. העבירו פרוסה לתא ההקלטה והסירו עודפי תמיסת A CSF. מקמו את הפרוסה במרכז התא בעזרת מכחול עדין.הסרו את כל שארית ה-A CSF באמצעות פיסות קטנות של נייר סינון סופג. הקפידו לוודא שאין עוד A CSF סביב קצוות הפרוסה. לבסוף, טפטפו בעדינות 0.5 mL של A CSF על הפרוסה מבלי לשחרר אותה מהתא.הנח את התאים בתוך מכל ממשק גדול ומאוורר בחמצן והשאר אותם למשך שעה אחת נוספת בחשיכה. ניתן לתעד שינויים בצבעי אינדיקטור רגישים לסידן באמצעות מיקרוסקופיית פוטון אחד או שני פוטונים. אנו משתמשים בלייזר טיטניום-ספיר coupled למיקרוסקופ Olympus כדי לאפשר דימוי של שני פוטונים ברשתות הנוירונליות שלנו.בנוסף, אנו משתמשים במערכת trim scope של L Vision biotech עם מצלמת EM CCD hammer MATSU להגדלת קצבי סריקת הפריימים. מקמו את תא הפרוסות מתחת למיקרוסקופ עם זרימה יציבה של A-T-S-F מחומצן המכיל 1.6 millimolar סידן ו-1.5 millimolar מגנזיום, המוחמם בערך ל-30 °C בהתקנה באמצעות אור לבן.אתר את אזור העניין בתוך הפרוסה ומקד את המיקוד על פני השטח. כבה את האורות וסגור את דלת ארון ההקלטה, כדי להפחית את רמות תאורת הרקע.חבילות תוכנה מסחריות או פתוחות רבות זמינות להקלטה וניתוח של תמונות. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בתוכנת inspector של Lavis Biotech לצורך רכישת תמונות. כדי להתחיל בצילום, בחרו במצב מצלמת CCD לגילוי. הגדירו את אורך הגל הרלוונטי לאינדיקטור שלכם.עבור fira 2:00 AM Ester, הגדרנו את העירור ל-820 nanometers בתוכנת ה-trim scope. בחרו במצב סריקה 64 B. בחרו את גודל שדה הראייה והרזולוציה לפיקסל האופטימליים עבור אזור העניין שלכם.בחר קצב פריימים וסיבוב פיקסלים (pixel spinning) מתאימים במידה והם נדרשים לדגימת התמונה שלך. פתח את תריס הלייזר כדי להיות מוכן לדימוי רציף. השתמש במצב דימוי רציף.כווננו את ההגבר ועוצמת הלייזר והתמקדו ברשת הנוירונלית שברצונכם לדגום. הפסיקו את הסריקה. בחרו את הגדרות ה-time-lapse עבור קצב הפריימים ומשך הרצף.לאחר בדימות בשיטת time-lapse, צרו Z stack של תמונות המקיף 20 microns מעל ו-20 microns מתחת, במרווחים של micron אחד. Z stack זה משמש לזיהוי תאים במהלך הניתוח. ייצאו את הקבצים שהוקלטו כסטה של תמונות TIFF.לסיכום, הדגמנו את השימוש באינדיקטורים לסידן למדידת פעילות רשתית ספונטנית וסנכרונית בקליפה המוחית המתפתחת. פרטים נוספים על המתודולוגיה והריאגנטים ניתן למצוא בגיליונות הנתונים המלווים סרטון זה, כדי לאפשר לכם להקים את הטכניקה במעבדה שלכם.

functional-calcium-imaging-in-developing-cortical-networks

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

אותות סידן משחקת תפקיד חשוב בתהליכים תאיים רבים, כולל הישרדות ביטוי גנים בידול. כאן אנו מדגימים כיצד לבצע הדמיה סידן באמצעות Fura, 02:00. הדמיה סידן הוא כלי רב ערך כדי ללמוד את ויסות סידן תוך תאי בזמן אמת ורגולציה של מפלי איתות.

סידן הדמיה של נוירונים קליפתיים באמצעות Fura, 02:00

שיטה לטעון אזור תאי subventricular (SVZ) עם צבעי סיד חיווי לפעילות הסידן הקלטה מתוארת. SVZ לאחר הלידה מכיל תאים צפופים, כולל תאי אב עצביים וneuroblasts. במקום להשתמש בטעינת אמבטיה אנו מזריקים צבע בלחץ בתוך הרקמה המאפשרת דיפוזיה צבע טובה יותר.

הכנת Slices האזור Subventricular החריף להדמית סיד

מקור: Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultures by Membrane-Targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019)הסרטון מדגים הדמיה פלואורסצנטית כדי לצפות בדינמיקת סידן ספונטנית ספציפית לתא באסטרוציטים על ידי ניטור רציף של חלבונים רגישים לסידן הממוקמים על קרום הפלזמה והרטיקולום האנדופלזמי.

הדמיית סידן ספונטנית עבור דינמיקה ספציפית לתא באסטרוציטים

כאן, אנו מציגים הליך לביצוע בקנה מידה גדול Ca 2 + הדמיה עם רזולוציה הסלולר על פני שכבות קליפת המוח מרובים בעכברים נעים באופן חופשי. מאות תאים פעילים ניתן לצפות בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ מיניאטורי, ראש רכוב יחד עם בדיקה מנסר פריזמה.

רב שכבתיים Ca קליפת המוח<sup&gt; 2+</sup&gt; הדמיה בחופשיות העברת עכברים עם בדיקות פריזמה מיקרוסקופית פלואורסצנטי מיניאטורי

אנו מתארים תהליך ניסוי למדידת פעילות. עצבית מבעד לחלונות אופטי כפול מעל הדו-צדדיים העיקרי המגע corticies (S1) ב- Thy1-GCaMP6s העכברים הטרנסגניים באמצעות 2-פוטון (2p) מיקרוסקופיה ויוו.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

אנו מציגים שיטת שילוב תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות והדמיה שני הפוטונים להקליט את Ca2 + שנחשולי דנדריטים עצביים במוח חריפה פרוסות.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

הדמיית סידן תאים היא מתודולוגיה רב-תכליתית לחקר איתות דינמי של תאים בודדים, על אוכלוסיות מעורבות בתרבית או אפילו על בעלי חיים מתעוררים, המבוססת על הביטוי של ערוצים / קולטנים חדירים לסידן המעניקים חתימות פונקציונליות ייחודיות.

הדמיה של שינויים במעגל נוירון-גליה בטכניקת הדמיית הסידן

אזורים חושיים ראשוניים בניאוקורטקס מפגינים פעילויות ספונטניות ייחודיות במהלך ההתפתחות. מאמר זה מתאר כיצד לדמיין פעילויות נוירונים בודדות ואזורי חישה ראשוניים כדי לנתח פעילויות סינכרוניות ספציפיות לאזור בעכברים ילודים in vivo.

בהדמיה של פעילות ספונטנית בקליפת המוח החושית של עכבר יילודים ברזולוציה של נוירון יחיד

למד כיצד למדוד פעילות רשתית בפרוסות קליפת מוח מתפתחות באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן. שיטה זו מאפשרת תיעוד פעילות מסונכרנת של נוירונים ואסטרוציטים ברזולוציה גבוהה.

סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים

גלה סרטונים נוספים