סידן הדמיה תפקודית בפיתוח רשתות קליפתיים
October 22nd, 2011
פעילות ספונטנית של פיתוח רשתות נוירונים ניתן למדוד באמצעות AM-אסתר צורות של סידן רגיש צבעים אינדיקטור. שינויים סידן תוך תאי, המציין ההפעלה העצבית, מזוהים כמו שינויים חולפות הקרינה אינדיקטור עם אחד או שני פוטונים הדמיה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאמים עבור מגוון של רשתות נוירונים התפתחותית תלויי במבחנה.
המטרה הכוללת של הסרט הזה היא להדגים כיצד למדוד את פעילות הרשת מפיתוח פרוסות מוח קליפת המוח באמצעות אינדיקטור פלואורסצנטי רגיש לסידן. פרוסות מוח DY עשויות מקליפת המוח האנטרלית המתפתחת של עכבר צעיר. גם תאי עצב וגם אסטרוציטים עמוסים בסמנים תלויי סידן.
שינויים בקרינה של צבעים תלויי סידן משקפים שינויים בפעילות התאית. ניתן לצבוע תאים שאינם עצביים, כולל אסטרוציטים, מיקרוגליה ותאי אנדותל באמצעות צבעי סמן ספציפיים. פעילות הרשת בקליפת המוח נרשמת באמצעות זמן-lapse תאי הדמיה מרובי פוטונים מזוהים בתוך הרשת על ידי יצירת ערימה תלת מימדית של תמונות דרך אזור העניין.
לאחר מכן ניתן לנתח שינויים בקרינה התאית על פני תאים מרובים כדי לקרוא את הפעילות של הרשת המתפתחת בקליפת המוח. דפוס סימן היכר של פעילות במערכת העצבים המתפתחת הוא פעילות רשת מסונכרנת ספונטנית. פעילות מסונכרנת נצפתה באזורים עצביים רבים ומתפתחים, כולל קליפת חוט השדרה השלמה ותכשירי תרבית עצבית מנותקים בתקופות של נוירונים פעילים ספונטניים, דה-פולריזציה לאש, קוצים בודדים או התפרצויות של פוטנציאל פעולה המפעילים תעלות ברזל רבות, כולל תעלות סידן מגודרות מתח המובילות לזרם סידן.
פעילות מסונכרנת מאוד נמדדה מרשתות מקומיות באמצעות אלקטרודות שדה או מערכי אלקטרודות מרובות. אלה מאפשרים שיעורי דגימה זמניים גבוהים, אך נותנים רזולוציה מרחבית נמוכה יותר עקב הקריאה המשולבת של פעילות התא. רזולוציה של פעילות עצבית של תא בודד אפשרית באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי של נוירונים בודדים כדי למדוד את קצב הירי.
עם זאת, היכולת למדוד מרשת מוגבלת למספר הנוירונים המוטלאים בו זמנית, ובדרך כלל היא רק נוירון אחד או שניים. השימוש בצבעי אינדיקטור פלואורסצנטיים תלויי סידן איפשר מדידה של פעילות מסונכרנת על פני רשת תאים. טכניקה זו נותנת הן רזולוציה מרחבית גבוהה והן דגימה זמנית מספקת כדי לתעד פעילות ספונטנית של הרשת המתפתחת.
אינדיקטורים רגישים לסידן פלואורסצנטי כגון URA 2:00 AM ester מכילים קבוצות חומצה קרבוקסילית המסוגלות לקשור מכרות סידן. צבעים פלואורסצנטיים אלה מופעלים על ידי אורכי גל אור ספציפיים באמצעות פוטון אחד או שני מיקרוסקופ פוטונים. מספר הפוטונים הנפלטים מהצבע משתנה באופן זמני עם קשירת הסידן.
שינוי זה במספר הפוטון או הקרינה מדווח כאות דלתא FF ומתאים לשינוי ברמת הסידן בתוך הנוירון. מדידת שינויים באינדיקטורים רגישים לסידן היא מדד קריאה שימושי של דפוסי פעילות הרשת בתאים מתפתחים. שלום, אני ריאנה מורטי, ושמי ג'ולי אבוטס.
אנו מהמחלקה לנוירופיזיולוגיה פרשנית ומהאוניברסיטה באמסטרדם. אנו משתמשים בהדמיית סידן כדי לחקור פעילות תפקודית בפיתוח רקמות בקליפת העכבר באמצעות אינדיקטורים רגישים לסידן בהדמיה מולטיפוקל. מטרת הסרט הקצר הזה היא להדגים כיצד ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי למדוד דפוסי פעילות ספונטניים ולעורר דפוסי פעילות ברשתות מתפתחות במערכת העצבים.
הסר את המוח במהירות מהגולגולת של עכבר צעיר כדי להפחית את הנזק למעגלים העצביים. נתחו את המוח בתמיסת פרוסות קרות כקרח. תמיסת הפרוסה מכילה קולין כלוריד במקום הנתרן הנפוץ ב- TSF להקלטות עצביות.
בניסויים האלה אנו מייצרים פרוסות מוח מקליפת המוח האנטרלית של מוח העכבר המתפתח. מניחים פיסת נייר פילטר על גבי צלחת פטרו ומרטיבים בכמה מיליליטר של A TSF. העבירו את המוח לפיסת נייר המסנן.
חצו את חצאי הכדור באמצעות סכין גילוח בקצה יחיד. הפרד בין שתי ההמיספרות. מניחים אחד בחזרה לתמיסת הפרוסה הקפואה עם חצי הכדור הנותר.
הסר את המוח הקטן בעזרת סכין הגילוח. הפוך חצי כדור אחד על קו האמצע שלו, ובצע חתך של כמילימטר אחד מהמשטח הגבי עם זווית קלה של הלהב לכיוון הקצה הרוסטרלי. הפוך את המוח.
המשטח שנחתך לאחרונה באמצעות ציפור כותנה ומרית מתכת. העבירו את המוח לבלוק חיתוך המתכת. דחף בעדינות את המוח מהמרית בעזרת ציפור כותנה על המשטח המודבק.
פרוסות מוח של 300 מיקרומטר נחתכות למהירויות חיתוך רקמות צעירות ותדירות הלהבים בדרך כלל איטית יותר מאלה המשמשות לרקמות בוגרות יותר. לאחר החיתוך, מעבירים כל פרוסה באמצעות פיפטת זכוכית פרוסות מועברות לתא האחזקה, המכיל TSF מחומצן בטמפרטורת החדר. A CSF מכיל יחס גבוה יותר של מגנזיום לסידן מאשר תמיסת A CSF.
משמש להקלטת פרוסות נותרות למשך שעה להתאוששות. כדי לטעון את התאים עם מחוון תלוי סידן או סמן ספציפי לתא, יש להעביר פרוסות לתא לצורך הליך הצביעה. למרות שתאים מסחריים זמינים, ניתן להרכיב אחד בקלות מציוד מעבדה סטנדרטי בעלות נמוכה מאוד.
כדי ליצור תא מכתים, תזדקק לציוד המעבדה הבסיסי הבא, שתי צלחות פטרי מפלסטיק, מזרק אחד של 10 מיליליטר, קטע של צינורות סיליקה, תוספת תרבית תאים עם דבק סופר ממברנה חדיר למחצה, שלושה מחברי צינורות קטנים ומחט נישאת עדינה. קח את צלחת הפטרי הגדולה ועשה חור קטן עם מוט מחומם דרך הדופן. קח את צלחת הפטרי הקטנה וצור חור בקוטר בגודל דומה גדול מספיק כדי שצינור הסיליקון יעבור דרכו.
העבירו קטע של צינורות סיליקון דרך החור וצרו לולאה בתוך הכלי הקטן. השתמש בדבק סופר כדי לאטום את הקצה הפתוח של הצינור. לאחר מכן הדביקו את שארית הצינור לדופן הפנימית של צלחת הפטרי הקטנה.
מניחים את צלחת הפטרי הקטנה במרכז הגדולה ומדביקים במקום. קח את הקצה הנותר של צינור הסיליקון והעביר אותו דרך החור הקטן בדופן צלחת הפטרי. קח מחט דקה ועשה חורים קטנים בצינור הסיליקון בתוך צלחת הפטרי.
צור את החורים במרווחים שווים לאיחוי גז אחיד. קח תרבית תאים היטב עם קרום חדיר למחצה בעזרת אזמל מחומם. חותכים את הסנטימטר העליון של הבאר כדי להשאיר צלחת רדודה שתחזיק את הפרוסות במהלך הדגירה.
מניחים את הכלי הרדוד במרכז הכלי הקטן המוקף בצינור הסיליקון הנקבובי. יוצרים חור בקוטר של כחצי עד סנטימטר במכסה הכלי הגדול. קח מזרק פלסטיק של 10 מיליליטר בעזרת אזמל מחומם.
בצע חתך זוויתי כדי להסיר את קצה המזרק. מרחו דבק סופר על המשטח החתוך של צינור המזרק. הדביקו את זה ישירות מעל החור במכסה צלחת הפטרי הגדול.
חבר מחבר צינור לקצה קצה המזרק. הניחו את הכלי הרדוד במרכז צלחת הפטרי הקטנה וודאו שצינור הגז הנקבובי מונח סביב הצלחת. לאחר מכן צינור זה מחובר לאספקת גז קרבוגן כדי לחמצן את הפרוסות.
במהלך הדגירה יש להחזיר את מכסה המנה הגדולה, המחוברת גם ישירות לאספקת הגז דרך קצה המזרק. זה יביא אספקה של מכונית וגז על הפרוסות במהלך הדגירה כדי למנוע הלבנה של הצבע. כל ההליכים מתבצעים עם כמה שפחות אור, וגם הצבע וגם הפרוסות נשמרים בחושך.
מלאו את תא הצביעה בכמיליליטר וחצי של A TSF ממחזיק הפרוסה. הנח את תא הממשק בפנים ומלא במיליליטר נוסף של A TSF. חשוב לשמור על אספקת חמצן טובה כדי לשמור על בריאות הרקמה ולהעמסת פרוסה טובה.
הצביעה מתרחשת בסביבות 35 מעלות צלזיוס כדי להקל על ספיגת הצבע לתאי העצב בזמן שתא הצביעה מתחמם. הכן את צבע המחוון לפירה 2:00 AM אסתר. הוסף תשעה מיקרוליטר של DMSO עם מיקרוליטר אחד של חומצה אונית לבקבוקון של 50 מיקרוגרם.
DMSO וחומצה אונית. פועלים כסוכני סלסול כדי לאפשר לצבע להיקלט דרך קרום השומנים. מערבל את הבקבוקון למשך 15 דקות כדי להבטיח שהצבע מומס לחלוטין.
לצורך מכתים, העבירו כל פרוסה לממשק. הכנס לתא הצביעה. לטפו את הצבע ישירות על אזור העניין שמעל הפרוסות, סגרו את מכסה תא הצביעה.
השאירו את הפרוסות מודגרות בחושך למשך 20 עד 40 דקות, תלוי בגיל המאוס המשמש. לאחר הדגירה, העבירו את הפרוסות בחזרה למחזיק הפרוסות כדי לשטוף את כל עודפי הצבע שנותרו. ניתן להתאים את פרוטוקולי הצביעה להדמיית סידן גם לרקמות ישנות יותר.
זה דורש שלב נוסף של דגירה מוקדמת. מעבירים את הפרוסות הישנות לתבנית רדודה לפני הדגירה מלאה בשלושה מיליליטר CSF ושמונה מיקרוליטר קרמה ארבע תמיסה ב -0.5% מחממים ל -35 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר מכן העבירו את הפרוסות לממשק, הכניסו לתא הצביעה ובצעו את הליכי הצביעה הרגילים.
אפשר גם לצבוע את הפרוסות הללו עבור תאים שאינם עצביים, כלומר אסטרוציטים, מיקרוגליה ותאי אנדותל. ניתן להשתמש ברומין גופרית 1 0 1 כדי להכתים אסטרוציטים עבור דומין גופרית. הכינו תמיסה של 10 צינורות מיקרו-מולאריים את הצבע הסגול על אזור העניין בפרוסות.
השאירו לדגירה למשך 15 דקות. העבירו את הפרוסות בחזרה לתא ההחזקה כדי להסיר עודפי צבע. מצומד ה-FSE של לקטין עגבניות יכול להכתים תאי מיקרוגליה ותאי אנדותל.
עבור לקטין עגבניות, הכינו תמיסה של 20 מיקרוגרם למיליליטר. לטפו את הצבע על אזור העניין בפרוסות. השאירו את הפרוסות לדגור למשך 45 דקות.
לאחר מכן העבירו את הפרוסות בחזרה לתא ההחזקה. במהלך ההדמיה פרוסות צריכות להיות יציבות מתחת למיקרוסקופ. בדרך כלל מניחים נבל מתכת כדי להחזיק את הרקמה, אולם הוא יכול לעוות בצורה לא אחידה את פני השטח של הפרוסה ולתת רק שדה ראייה מוגבל בפוקוס כדי להימנע מההדמיה.
פרוסות אלה מודבקות לתא ההקלטה באמצעות תמיסת POLYETHALINE או PEI. PEI הוא פולימר המשמש לשיפור ההצמדה של תאים למשטח לפחות שעה אחת. לפני שמכניסים את הפרוסות לתאי ההקלטה, מלאו את התאים הללו בכמה מיליליטר של תמיסת PEI כדי לכסות את רצפת החדר.
ראשית, שטפו את PEI מהתא במים מזוקקים, ולאחר מכן תמיסת CSF. העבירו פרוסה לתא ההקלטה והוציאו עודפי תמיסת CSF. מקם את הפרוסה במרכז החדר באמצעות מברשת עדינה.
הסר עוד CSF באמצעות חתיכות קטנות של נייר סינון סופג. הקפד לוודא שלפרוסה אין יותר CSF סביב הקצוות שלה. לבסוף, לטפו בעדינות חצי מיליליטר של CSF על הפרוסה מבלי לשחרר אותה מהתא.
הכניסו את התאים למיכל ממשק מחומצן גדול והשאירו למשך שעה נוספת בחושך. ניתן לרשום שינויים בצבעי אינדיקטור רגישים לסידן באמצעות מיקרוסקופ פוטון אחד או שניים. אנו משתמשים בלייזר ספיר טיטניום המחובר למיקרוסקופ אולימפוס כדי לאפשר הדמיה של שני פוטונים ברשתות העצביות שלנו.
בנוסף, אנו עושים שימוש במערכת היקף גימור ביוטק של L Vision עם מצלמת פטיש EM CCD MATSU לקצבי סריקת פריימים מוגברים. מקם את תא הפרוסות מתחת למיקרוסקופ עם זרימה יציבה של A-T-S-F-A-T-S-F מחומצן המכיל 1.6 מילי-מולרי סידן ו-1.5 מילי-מולר. מגנזיום מחומם לכ-30 מעלות צלזיוס בהתקנה באמצעות אור לבן.
אתר את אזור העניין בפרוסה והתמקד במשטח. כבה את האורות וסגור את דלת ארון ההקלטה. כדי להפחית את רמות תאורת הרקע.
חבילות תוכנה מסחריות או פתוחות רבות זמינות להקלטה וניתוח תמונות במעבדה שלנו, אנו משתמשים בתוכנת מפקח לרכישה מ-Lavis Biotech. כדי להתחיל בהדמיה, בחר את מצב מצלמת CCD לזיהוי. הגדר את אורך הגל הרלוונטי למחוון שלך.
עבור fira 2:00 AM Ester, הגדרנו את העירור ל-820 ננומטר בתוכנת היקף החיתוך. בחר את מצב הסריקה של 64 B. בחר את הגודל, שדה הראייה ורזולוציית הפיקסלים האופטימליים עבור אזור העניין שלך.
בחרו קצב מסגרות וסיבוב פיקסלים מתאימים אם הם נדרשים לדגימת התמונה. פתח את תריס הלייזר מוכן להדמיה רציפה. שימוש במצב הדמיה רציפה.
התאם את הרווח ועוצמת הלייזר והתמקד ברשת העצבית שברצונך לצלם. הפסק את הסריקה. בחר את הגדרות קיטועי הזמן עבור קצב הפריימים ומשך הרצף.
לאחר הדמיית זמן-lapse, צור ערימת Z של תמונות המסמנות 20 מיקרון מעל ו-20 מיקרון מתחת בצעדים של מיקרון אחד. מחסנית Z זו משמשת לזיהוי תאים במהלך הניתוח. ייצא את הקבצים המוקלטים כערימה של תמונות TIFF.
לסיכום, הראינו את השימוש במדדי סידן למדידת פעילות רשת ספונטנית סינכרונית בקליפת המוח המתפתחת. פרטים נוספים על המתודולוגיה והריאגנטים ניתן למצוא בדפי הנתונים המלווים את הסרט הזה כדי לאפשר לך להגדיר את הטכניקה במעבדה שלך.
סקירה
מחקר זה מדגים שיטה למדידת פעילות רשתית בפרוסות מוח קליפתיות מתפתחות באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן. הפרוטוקול מאפשר תצפית בפעילות ספונטנית מסונכרנת ברשתות עצביות באמצעות טכניקות הדמיה מתקדמות.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי העצב
- ביולוגיה תאית
- טכניקות הדמיה
רקע
- אינדיקטורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן משמשים למדידת פעילות עצבית.
- פעילות ספונטנית מסונכרנת היא סימן היכר של רשתות עצביות מתפתחות.
- סוגים שונים של תאים, כולל נוירונים ותאי תמך, ניתנים לצביעה לצורך הדמיה.
- צילום רב-פוטונים ברווח זמן מאפשר תצפית ברזולוציה גבוהה של פעילות רשתית.
מטרת המחקר
- להדגים את השימוש בצילום סידן בחקר פעילות תפקודית ברקמות קליפת המוח של עכברים מתפתחים.
- להמחיש שיטות למדידת דפוסי פעילות ספונטנית ומעוררת.
- לספק פרוטוקול להכנת והדמיית פרוסות מוח.
שיטות ששימשו
- הכנת פרוסות מוח מקליפת המוח המתפתחת של העכבר.
- טעינת תאים באינדיקטורים תלויי סידן.
- צילום רב-פוטונים ברווח זמן להקלטת פעילות רשתית.
- ניתוח שינויים בפלואורסצנציה להערכת פעילות תאית.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של פעילות מסונכרנת ברשתות עצביות.
- הוכחת יעילותם של צבעים רגישים לסידן בלכידת שינויים דינמיים בפלואורסצנציה.
- זיהוי דפוסי פעילות ספונטנית ברשתות קליפת המוח המתפתחות.
- רזולוציה מרחבית גבוהה שהושגה באמצעות טכניקות הדמיה מתקדמות.
מסקנות
- השימוש בצילום סידן מספק תובנות חשובות לגבי הפעילות התפקודית של רשתות עצביות מתפתחות.
- שיטה זו ניתנת להתאמה לתרבית עצבים שונות ולשלבי התפתחות שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל את הטכניקות הללו כדי לחקור את דינמיקת הרשתות העצביות עוד יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Functional calcium imaging enables high-resolution mapping of spontaneous synchronized activity in developing cortical networks, a key process in early neurodevelopment. This approach supports target validation by linking network dynamics to circuit formation mechanisms relevant to neuropsychiatric disorder models. The technique provides predictive confidence in preclinical models by capturing functional readouts that correlate with synaptic maturation and plasticity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring network-level calcium flux as a proxy for neuronal excitability and synaptic connectivity.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantification of synchronized activity patterns that reflect functional circuit maturation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate network synchrony in disease-relevant developing cortical systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with cell-type-specific labeling (neurons and astrocytes) for downstream compound screening.
- Quantitative Output: Delivers high-spatial-resolution, temporally sampled delta F/F signals enabling detection of activity changes across multicellular networks.
- Screening Scalability: Facilitates reliable compound evaluation by capturing network-wide responses rather than single-cell measurements, improving assay physiological relevance.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models early cortical network dysfunction implicated in neurodevelopmental disorders, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by providing a functional readout of network activity that can be tracked across developmental stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by measuring compound effects on spontaneous network synchrony, a mechanistic indicator of circuit integrity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional network activity data that informs target engagement and lead optimization decisions prior to in vivo validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neurodevelopmental targets by measuring changes in network synchrony as a functional biomarker of circuit formation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible calcium flux readouts with cellular resolution, enabling comparison of drug effects across neuronal and glial populations.
- Analytics: Generates quantitative delta F/F measurements that allow teams to compare conditions and assess compound-induced modulation of network dynamics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling activity patterns known to regulate synaptogenesis and plasticity, processes disrupted in neuropsychiatric conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal study of network development across genetic and pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of network-level activity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined slice preparation, dye loading, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets based on functional network phenotypes rather than molecular binding alone.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that rescue or modulate pathological network synchrony in developing cortical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, multiphoton microscopy, and calcium imaging probe handling.
- Depends on access to titanium sapphire lasers, multiphoton systems, and environmental control for slice viability.
- Necessitates cross-team standardization between neurobiology and imaging teams for consistent slice preparation and data analysis.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different developmental stages or disease models.
- Limited by photobleaching and dye toxicity during prolonged imaging, requiring optimization of excitation intensity and incubation conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:03
Title
3:00
Step 1 Making horizontal hippocampal/cortical slices from young mouse brain
5:57
Step 2 Preparation of the staining chamber
8:48
Step 3 Staining of slices
10:21
Step 4 Non-neuronal dyes and older tissue
12:02
Step 5 Attaching slice to recording chamber
13:36
Step 6 Imaging
15:58
Conclusion
