Name: מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות Aplysia (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: למד מעקב סימולטני אחר ריכוז סידן תאי ויעילות סינפטית ברכיכות Aplysia באמצעות Calcium Orange ואלקטרודות תוך-תאיות. שיטה זו מאפשרת חקר פלסטיות סינפטית במערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

גרנט PHS (MH51393) תמך עבודה זו. חלק מAplysia אנו משתמשים מסופקים על ידי המשאבים הלאומיים לAplysia של אוניברסיטת מיאמי תחת גרנט RR10294 מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר, NIH.

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם את החיה על ידי הזרקת תמיסת 75-100 מ&quot;ל איזוטוני מגנזיום כלוריד. Aplysia אנו משתמשים להדמיה הן בדרך כלל 150-200 גרם והם מתקבלים ממרינוס המדעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד את החיה המורדמת לצלחת מכוסית שעווה. מחטי מזרקים לעבוד היטב למטרה זו; טכניקות סטריליות אינן נחוצות. שימוש במלקחי ברוטו ומספריים רגילים עושה חתך ברגלו של בעל החיים ולחשוף את מסת buccal. אתר גנגליון buccal. בעזרת מספרי האביב ומלקחיים עדינים, בזהירות חופשיה גנגליון על ידי חיתוך את כל עצבי buccal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מרכז העצבים ולמקם אותו בצלחת מצופית Sylgard המכילה מי ים מלאכותי. הנח כמה סיכות חרקים דרך עצבי buccal לייצב גנגליון. Desheath גנגליון buccal באמצעות מלקחיים ומספריים ultrafine אביב, כדי לחשוף את תאי העצב להקלטה תאית. ואז שוב להצמיד גנגליון באמצעות כ 15 חרקים בסדר (דקותסיכות) utien. גנגליון חייב להיות מוחזק היטב במקומו כמו כל תנועה תהיה בעייתית במהלך ההדמיה. </li></ol> 2. הכן אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך האלקטרודות באמצעות צינור נימי זכוכית עם נימה (למשל WPI TW100F-4) ומושך. הגדרות צריכות להיקבע בנפרד כדי ליצור אלקטרודות של ההתנגדות הנדרשת. כאשר התמלא M 3 KAC (יצטט אשלגן) התנגדות האלקטרודה שלנו היא בדרך כלל כ 10 MOhms אם האלקטרודות הן להיות משופעות, או כ 5 MOhms אם הצעד המשופע מושמט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא קבוצה אחת של אלקטרודות עם תמיסה המכילה KCl M 3 KAc/30 mM שימוש במזרק ומחט microfil. אלקטרודות אלה ישמשו לelectrophysiology. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא סט שני של אלקטרודות עם צבע מחוון הסידן על ידי טבילת הקצה האחורי של האלקטרודה בצבע, בעבר מחדש עם כ. 40 מים מזוקקים μl לצבע 500μg. כאשר הקצה של האלקטרודה מלא, חזרה למלא כ 1/4 אינץ&#39;בסופו של אלקטרודה עם 200 מ&quot;מ KCl כדי להבטיח מגע חשמלי טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה מועיל לפוע האלקטרודות, כמו זו מאפשרת הזרקת צבע ומקטינה על ידי חדירות הממברנה מרובות הניזק. אנו משתמשים beveler מותאם אישית שיוצר זרם של השעית מים / מלח אבקת אלומינה. אלקטרודה היא רכובה בבעל וקצו נכנס לזרם בזווית ° 45. התנגדות אלקטרודה מנוטרת באופן רציף והמשופעת הסתיים כאשר ההתנגדות מגיעה כ 5 MOhm לKAC אלקטרודות מלאות. האלקטרודות המלאות הצבע הם משופעים לכמות שווה של זמן ובדרך כלל יש התנגדויות של MOhm 15-20. </li></ol> 3. טוען דיי אינדיקטור סידן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ההכנה על אסדת electrophysiology וחזותי לאתר נוירון presynaptic של עניין. רבים מהניסויים שלנו נעשים עם נוירון חושי זיהה מנוצל במהלך האכלה, 5 B21, 6. Positio הקבוע יחסיתn, גודל (~ 100 מיקרומטר), וצורתו המוארכת של סומה של B21 לעשות את זה קל לאתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשפד נוירון עניינים עם אלקטרודה המכילה צבע מחוון סידן. זהותו של B21 יכולה להיות מאומתת על ידי impaling נוירון B8 הפוסט סינפטי. שלילת קוטביות של B21 עם 8 ~ נוכחי Na תפעיל קוצים ואת התוצאה בהנחיית PSPs ב7 B8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזריק צבע בנוירון presynaptic של עניין על ידי העברת פולסים hyperpolarizing (בדרך כלל -15 Na, 1 הרץ, 75% המחזור) למשך כ 30 דקות. אם טעינת צבע היא מוצלחת, סומה של נוירון תרכוש צבע ורוד חיוור. הסר את האלקטרודה צבע המכיל על ידי נסיגתו באיטיות מתא העצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר הכנות לכ 30 דקות על מנת לאפשר לצבע כדי לפזר לתוך התהליכים העדינים שהופכים את קשר הסינפטי עם הנוירונים חסיד. </li></ol> 4. דימות סידן והקלטת אלקטרו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ההכנה על הדמית microscאופ. הצלחת עם ההכנה מתקיימת על פלטפורמת קירור עם חתיכות של כבל האיטום Permagum אשר, בניגוד חימר, נותרת דביק כאשר רטוב. מיקרוסקופ הבמה הקבועה מתמקד ידי הזזה האובייקטיבית. השלב נשאר נייח, המאפשר חיבור המניפולטורים מגנט רכוב. כהגדלה הגבוהה הופכת את התנודות (תנועה לרוחב בעיקר) בעייתית, התקנת ההדמיה כולו צריכה להיות ממוקמת על פלטפורמת בידוד רעידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשפד את הנוירונים presynaptic וpostsynaptic עם אלקטרודות המכילות תמיסת אלקטרוליט נורמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בלוק מתאים לתמונת סידן אורנג&#39; מסנן (עירור 549 ננומטר, 576 ננומטר פליטה) 8 ולהתאים את המצלמה. מצלמות CCD המדעיות ביותר את החוקר לבחור תת קבוצה של תאי CCD, כי הם נקראו החוצה. בנוסף, תאים יכולים להיות משולבים (זרק לפח). בחירה קטנה יותר מהירות עליות משנה, תוך רגישות עליות binning. שתי הגדרות אלה, ועם זמן החשיפה, לקבועקצב הפריימים כלומר כמה תמונות ניתן לרכוש בשנייה. הגדרות מתאימות יהיה תמונה על שטח של 350 מיקרומטר 580 x 2 עם 500 x 300 פיקסלים (באמצעות עדשת 10x ומתאם מצלמה 0.5x). הוסף מסנני צפיפות ניטראליות לנתיב האור כדי להתאים את עוצמת התאורה לכמות המינימאלית המספקת חשיפה נכונה בזמן חשיפה &lt;25 אלפיות שני. הגדרות אלה צריכות לגרום לקצב פריימים של 30 רץ - אשר בAplysia מספיק מהיר כדי תמונה האחת ספייק עורר שינויי סידן. לבסוף, לסגור את צמצם השדה כך שרק אזור ההדמיה דולקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת ההדמיה לסמן האזורים של נוירון אתה רוצה למדוד. באלמנטי AR התוכנה זה נעשה בסעיף &quot;מדידת הזמן&quot; על ידי צבת אזורים של עניין (Rois). B21 הוא דו קוטבי ונוירון עבודה קודמת הוכיחה כי מגעי התהליך הרוחביים שלה נוירון postsynaptic עניין 9. אנחנו בדרך כלל תמונה ראשונית, שניונית, שליישוני חזייהnches של התהליך הרוחבי על ידי צבת ROI על כל חלק של תא העצב. החזר על השקעה נוספת בסמוך לנוירון המלא הצבע נמדד כדי לספק ערך רקע שנגרע מאוחר יותר מכל נקודתי נתונים האחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להורות לרכישת electrophysiology (בניסויים אלה ספייק השני) כדי לחכות לאות הדק מסופקת על ידי האות &quot;מסגרת readout&quot; של המצלמה. התחל רכישת התמונה (האלמנטים AR); ספייק השני עכשיו אוטומטית להתחיל להקליט כאשר המצלמה המצלמת הפריים הראשון שלה. ניתן גם להשתמש בפלט TTL של המעצמה 1401 בקצרה כדי להפעיל LED רכוב ביציאת המצלמה של מיקרוסקופ. זה יספק אות לאחר מכן לסנכרן את נתוני הדמיה ואלקטרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרות את הנוירון presynaptic ידי הזרקת סדרה של פולסים הנוכחיים depolarizing קצרים בתדירות הרצויה. חשוב לעקוב אחר דופק בכל (למשל עם אוסצילוסקופ גירוי מופעל) כדי לקבוע אם פוטנציאל פעולה הוא successfנוצר ully. בעוד אורנג&#39; סידן הוא מאוד צילום יציב בהשוואה לצבעים אחרים, זה רעיון טוב להקליט משפט שליטה ללא גירוי לבדוק כמה לצבוע הלבנה מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים שבם ריכוז יוני הסידן התאי הוא מניפולציה, תרופה כגון EGTA מוחדרת לתא עצב presynaptic ואת פעולות רכישת הגירוי ונתונים שתוארו לעיל חוזרת על עצמם. </li></ol> 5. ניתוח של נתונים יציגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את נתוני ההדמיה (רשימת הערכים שנמדדו בעצמה לכל החזר על השקעה) על ידי כתיבה אותו לקובץ טקסט. תסריט מותאם אישית בספייק השני יכול לאחר מכן לייבא את קובץ הטקסט. סקריפט זה גם מנרמל את הערכים באזור של הבדיקה הפרטנית, ומחסיר את הערך של בדיקת הרקע. נקודתי הנתונים אז הם זממו לצד נתוני electrophysiology כערוץ &quot;וירטואלי RealWave&quot;. &quot;תהליך / תפקוד היסט זמן הערוץ&quot; בספייק השני משמש בדיוק ליישר הדמית הנתונים פויNTS, תוך שימוש באות LED כנקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל ערכים כמו שינוי אחוזים, לנתח את נתוני הדמיה על ידי חישוב השינוי היחסי בפלואורסצנטי כDF / F = o (FF o) / F o. F o מציינת את רמת פלואורסצנטי ממש לפני הגירוי וF פלואורסצנטי במהלך הגירוי. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. תכנית כוללת של הניסוי. ניסויים נערך בהכנת גנגליון של Aplysia. שינויים בסידן תוך תאי הם צלמו בצבע זרחני, שהציג iontophoretically לתוך הנוירון סינפטי. הנוירונים מראש וpostsynaptic מכן משופדים עם אלקטרודות חדות כל כך יכולה להיגרם כי העברה הסינפטית ופיקוח. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="איור 2" /> <strאונג&gt; איור 2. הדמית סידן והקלטה תאית מתא עצב שזוהה בגנגליון buccal של Aplysia. (א) תמונה של הענף הצדדי ההדמיה של נוירון B21. התיבה מציינת את האזור המדוד של ריבית. גירוי (B1) תאי של B21 מעורר פוטנציאל פעולה (עקבות תחתונות) ופוטנציאלי postsynaptic הקלה (PSPs) בחסיד postsynaptic נוירון B8 (באמצע עקבות) גורם לו גם לירות פוטנציאלי פעולה. עליות בפלואורסצנטי הסיד presynaptic מוצגות בשמץ העליון. אפקט (B2) של EGTA presynaptic בהנחיית homosynaptic. EGTA הוזרק לתוך intracellularly B21 ~ 15 דקות לפני הגירוי תאי. הוא חשב כי EGTA הוא chelator איטי פועל הסיד, אשר בריכוזים נמוכים הוא לא מהיר מספיק כדי לדכא את ההולכה סינפטית. שים לב לירידה באות הסיד הנרחבת וירידה המקבילה בPSP משרעת. (ג) משרעת PSP קורלציה עם calciu presynapticמ &#39;אות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<ol><li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li>
<li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators%3A+Calcium+green%2C+calcium+orange+and+calcium+crimson%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophysical+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li>
<li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators%3A+rapid+transient+response+to+flash+photolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li>
<li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2%2B+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li>
<li>Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li>
<li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22The+Handbook%22">The Handbook</a>. , 10th edition, Invitrogen. (2005).</li>
<li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li>
<li>Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldberg%2C+JH+%22Imaging+in+Neuroscience+and+Development%22">Imaging in Neuroscience and Development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

אנו מדגימים טכניקות שניתן להשתמש בו זמנית לפקח על ריכוז הסידן התוך התאי ולהעריך את היעילות של העברה הסינפטית. שיטות אלה מועילות לקביעה כיצד צורות שונות של פלסטיות לטווח קצר מתווכות. ההדמיה מבוצעת עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצלמת CCD. דרישות ציוד אלה הן צנועות יחסית בהשוואה ללהגדיר קופצים הדמיה פונקציונלית ביותר. הטכניקה היא פשוטה וקלה ללמידה. בעוד הדמיה עם מצלמת CCD מאפשרת הדמיה של שטח גדול עם רזולוציה של זמן טוב,...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> הערה </td></tr><tr><td> הסיד אורנג&#39; </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> סיגמא </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> ערכת חיץ כיול סידן </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> שימושי לבדיקת הרגישות והטווח דינמי של האות </td></tr><tr><td> hexahydrate מגנזיום כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> M0250 </td><td> השתמש בתמיסת 0.33 M להרדים בעלי חיים </td></tr></tbody></table> לוח 1. ריאגנטים שימוש. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם ציוד </td><td> חברה </td><td> הערה </td></tr><tr><td> FN-1 מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף </td><td> ניקון מכשירים </td><td> עם Narishige-FN1 ITS השלב </td></tr><tr><td> לענ-21 המניפולטורים </td><td> Narishige </td><td> רכוב על במה עם מגנטים </td></tr><tr><td> מצלמת 2 CoolSNAP HQ CCD </td><td> Photometrics </td><td></td></tr><tr><td> ח האלמנטים AR (גרסה 3.22) </td><td> ניקון מכשירים </td><td> תוכנת הדמיה משמשת לרכישת נתוני קרינה </td></tr><tr><td> 10X/0.3w תכנית פלואוריד אובייקטיבי </td><td> ניקון מכשירים </td><td> עדשת טבילה במים זה יש מרחק עבודה ארוך מאוד של 3.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> X-Cite מנורה הליד מתכת מחשב 120 </td><td> EXFO </td><td> משמש לדימות פלואורסצנטי </td></tr><tr><td> LS-DWL מנורת הלוגן </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> קבוצת ET-CY3 מסנן </td><td> טכנולוגית Chroma </td><td>; </td></tr><tr><td> כוח 1401 / D ממיר </td><td> עיצוב קיימברידג&#39; אלקטרונית </td><td> הדגימה נעשתה ב 3 קילוהרץ </td></tr><tr><td> ספייק השני (גרסה 7.07) </td><td> עיצוב קיימברידג&#39; אלקטרונית </td><td> תוכנה המשמשת לאיסוף נתוני electrophysiology </td></tr><tr><td> SEC LX-10 מגבר </td><td> NPI אלקטרוניקה </td><td> בשימוש עם headstage 10X </td></tr><tr><td> 410 מגבר דגם </td><td> ראונלי דיוק </td><td> משמש כדי להגביר את האות ולסנן </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> מינוס k טכנולוגיה </td><td> בידוד רעידות הדמיה </td></tr><tr><td> פלטפורמת קירור </td><td> המנהג עשה </td><td> לוחית הנחושת שדרכו מי קרח נשאבים בשיעור משתנה </td></tr></tbody></table> טבלה 2. ציוד משומש.

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; aplysia</em

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

היה מי שהציע כי שינויים בסידן תאי לתווך אינדוקציה של מספר הצורות חשובות של פלסטיות הסינפטית (הנחיית למשל, homosynaptic) 1. השערות אלה ניתן לבדוק על ידי ניטור שינויים בסידן תוך תאי ושינויים ביעילות הסינפטית בו זמנית. אנו מדגימים כיצד זה יכול להתבצע על ידי שילוב הדמית סידן עם טכניקות הקלטה תאיות. הניסויים שלנו מתנהלים בגנגליון buccal של Aplysia californica הרכיכה. הכנה זו כוללת מספר התכונות מועילות בניסוי: גרעינים ניתן להסיר בקלות מAplysia וניסויים להשתמש תאי עצב בוגרים המרכיבים קשרים סינפטיים רגילים ויש לי ערוץ הפצת יון רגילה. בשל שיעור הנמוך מטבולים של בעלי החיים והטמפרטורות הנמוכות יחסית (14-16 מעלות צלזיוס) שהנם טבעיים לAplysia, הכנות הן יציבות לפרקי זמן ארוכים. &gt; אף אוזן גרון &quot;כדי לזהות שינויים בסידן חופשי תאי אנו משתמשים בגרסת impermeant התא של סידן אורנג&#39; 2 אשר בקלות&quot; נטען &quot;לנוירון באמצעות iontophoresis. כאשר צבע אורך גל ניאון ארוך זה נקשר לסידן, עולה עוצמת קרינה. הסיד אורנג&#39; יש תכונות מהירות הקינטית 3 ו, בניגוד לצבעי ratiometric (למשל, Fura 2), לא דורשות גלגל מסנן עבור הדמיה. זה די תמונה יציבה ופחות phototoxic מצבעים אחרים (למשל, Fluo-3) 2,4. כמו כל הלא ratiometric צבעים, סידן אורנג&#39; מציין שינויים יחסיים בריכוז הסידן. אבל, מכיוון שלא ניתן להסביר את השינויים בריכוז צבע עקב טעינה ודיפוזיה, זה לא יכול להיות מכויל לספק ריכוז יוני הסידן מוחלט. במה, מיקרוסקופ זקוף, קבוע מתחם שמש לנוירונים תמונה עם מצלמה מסוגלת להקליט סביב 30 מסגרות לשנייה CCD. בAplysia הרזולוציה של הזמן הזההוא יותר ממספק כדי לזהות אפילו שינוי מושרה ספייק יחיד בריכוז הסידן התוך התאי. אלקטרודות שארפ משמשות בו זמנית כדי לגרום ולהקליט שידור סינפטי בנוירונים לפני וpostsynaptic מזוהים. בסיומו של כל משפט, תסריט מותאם אישית משלב נתוני ההדמיה electrophysiology ו. כדי להבטיח סינכרון ראוי אנו משתמשים דופק אור LED הרכוב בנמל המצלמה של המיקרוסקופ. מניפולציה של רמות הסידן presynaptic (למשל, באמצעות הזרקת EGTA תאית) מאפשרת לנו לבחון את השערות ספציפיות, הנוגע לתפקידו של הסידן תוך תאי בתיווך צורות שונות של פלסטיות.

אנו מראים כיצד שינויים בריכוז התאי החופשיים הסיד ויעילות הסינפטית ניתן לפקח במקביל בהכנה של גנגליון<em&gt; Aplysia</em&gt;. אנחנו תמונת הסידן תוך תאי באמצעות צבע פלואורסצנטי, אורנג&#39; סידן, ולעורר ולפקח על העברה הסינפטית עם אלקטרודות חדות (תאי).

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; Aplysia</em

הוצע כי שינויים בריכוז הסידן התוך-תאי מתווכים את ההשראה של מספר צורות חשובות של פלסטיות סינפטית (למשל, ...

סידן תוך-תאי נחשב לחלק חשוב ממספר מנגנונים של פלסטיות סינפטית. ניתן לבחון רעיונות אלו על ידי ניטור סימולטני של שינויים ברמות הסידן ושינויים ביעילות הסינפטית. כאן אנו מדגימים כיצד ניתן להשיג זאת על ידי שילוב של דימות סידן יחד עם רישום תוך-תאי.הניסויים שלנו נערכים עם גנגליון של רכיבל מסוג Aplysia Cahora. להכנה זו מספר יתרונות, כגון נוירונים מזוהים גדולים, טמפרטורות נמוכות הטבעיות ל-apia, ואותות איטיים המקלים על הדימות, אך הטכניקות הכלליות שאנו מדגימים ניתנות להעברה בקלות למערכות אחרים. שלום, אני קולין אוונס מהמעבדה של אליזבת קרופר במחלקה למדעי העצבים פישבורג ובמכון פרידמן למוח בבית הספר לרפואה מאונט סיני בניו יורק.היום נדגים הדמיה סימולטנית של שינויים בריכוז הסידן התוך-תאי ובביעילות סינפטית בגנגליון הפה (buccal ganglion) של הרכיכה Aplysia cahora. כדי לזהות סידן תוך-תאי, נזריק לנוירון פרה-סינפטי את צבע האינדיקטור לסידן calcium orange, החודר דרך ממברנת התא. לאחר מכן, הדגימה תועבר אל מתחת למיקרוסקופ, ונוירונים פרה- ופוסט-סינפטיים יינעצו באמצעות אלקטרודות חדות.גירוי פרה-סינפטי חוזר גורם לתגובה פוסט-סינפטית מוגברת, הנראית כעלייה בפוטנציאל הפוסט-סינפטי או באמפליטודה של ה-PSP. מדידת האות הפלואורסצנטי של צבע המחוון לסידן תאפשר לנו לזהות שינויים סימולטניים בריכוז הסידן התוך-תאי בטרמינל הפרה-סינפטי. לתחילת הפעולה, הרדימו בעל חיים בוגר השוקל כ-150 גרם על ידי הזרקה של 75 mils של תמיסת מגנזיום כלוריד איזוטונית, הצמידו את בעל החיים המורדם לצלחת מצופה בשעווה, ולאחר מכן, באמצעות פינצטה ומספריים, בצעו חתך בכף הרגל של בעל החיים וחשפו את ה-buccal mass.הגנגליון הפהי (buccal ganglion) נמצא בצדו הגבון של מסת הפה ומורכב משני חצאי גנגליונים מחוברים. הוא מכיל כמה מאות נוירונים שביחד עם נוירונים בגנגליונים אחרים תורמים ליצירה ולבקרה של התנהגות ההאכלה של בעל החיים. שחררו בזהירות את הגנגליון על ידי חיתוך כל העצבים הפהיים עם מספריים עדינים והוציאו אותו מהבעל החיים.לאחר מכן, הצמיד את הגנגליון המשוחרר לבסיס של צלחת מצופה ב-sil guard ומלאה במי ים מלאכותיים. הגנגליון עטוף בנדן של רקמה חיבורית, שיש להסירה כדי לחשוף את הנוירונים הבודדים. השתמש בפינצטה עדינה, במספרי איריס ובזהירות רבה כדי לחתוך ולהסיר נדן זה.כדי למנוע פגיעה בנוירונים, ייסבו את הגנגליון לאחר הסרת המעטפת בעזרת סיכות למשך כ-15 דקות, שכן כל תזוזה תהיה בעייתית במהלך הדימוי. כדי להכין אלקטרודות חדות להקלטה תוך-תאית ולהזרקת צבע, משכו צינוריות קפילריות באמצעות מושך מיקרו-אלקטרודות. אנו משתמשים בזכוכית בורוסיליקט בעלת דפנות דקות עם קוטר חיצוני של 1 מילימטר.לאלקטרודות ההקלטה צריכה להיות התנגדות של כ-10 mega כאשר הן מלאות באסטט פוטסיום בריכוז של three molar, ולכן אנו מכוונים את השובך (puller) בהתאם כדי למלא את אלקטרודות ה-D. טבלו את החלק האחורי של האלקטרודה שנשבכה לתוך תמיסה של צבע calcium orange בריכוז 10 millimolar; פעולת נימיות לאורך סיב הזכוכית בתוך האלקטרודה תמשוך את הצבע אל הקצה, ולאחר מכן מלאו שוב את האלקטרודה ב-potassium chloride בריכוז 200 millimolar כדי להבטיח מגע חשמלי טוב. אנו משתמשים ב-Bela שנבנה בהתאמה אישית כדי לשפר את תכונות האלקטרודה ולהנמיך את התנגדות אלקטרודת ההקלטה לכ-five mega.האלקטרודה מוחזקת בזווית של 45 מעלות בתוך זרם של תמיסת אלומינה (aluminum oxide). ערבוב של sodium chloride לתוך התמיסה וחיבור של מד עכבה (ohmmeter) מאפשרים ניטור של התנגדות האלקטרודה. במהלך תהליך השיוף (beveling), אנו מעבירים את הצלחת המכילה את ganglion-ים של ה-buckle המבודדים למערך אלקטרופיזיולוגי ומאתרים את הנוירונים הרלוונטיים על ידי דקירה שלהם באלקטרודות ואימות זהותם.כדי להכין נוירון לדימות סידן, אנו מחדירים תחילה אלקטרודה ממולאת בצבע אל גוף התא (soma) וטוענים את הצבע באופן אלקטרופורטי באמצעות פולסי זרם של 15 nano amp בהיפר-פולריזציה למשך 30 דקות. עם כניסת ה-D calcium orange לתא, ה-SOR יקבל גוון ורוד חלש. לאחר מכן, אנו מושכים בזהירות את אלקטרודות ההקלטה ומשאירים את הדגימה למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר לצבע להתפשט אל תוך התהליכים העדינים של הנוירון.בשלב הבא, העבירו את הצלחת עם הדגימה למיקרוסקופ פלואורסצנטי. אנו משתמשים בעדשת טבילה במים עם הגדלה של 10 פעמים ו-NA 0.3 במיקרוסקופ עם שולחן קיבוע אנכי, הממקד את התמונה על ידי הזזת העדשה ולא את השולחן. דבר זה מקל על התקנת המניפולטורים.עבור אלקטרודות ההקלטה, בחרו בלוק סינון מתאים. בלוק סינון SI three יספק את מסנני העירור והפליטה הנכונים עבור calcium orange; כווןו את פרמטרי המצלמה ואת עוצמת התאורה באמצעות מסנני צפיפות ניטרלית ומפתח השדה. תאורה חזקה יותר תביא לרעש נמוך יותר, אך עלולה לגרום להלבנה (bleaching) של הדגימה.מצלמת ה-CCD מסוג cool snap יכולה ללכוד שדה של 500 על 300 פיקסלים בקצב פריימים של כ-30 פריימים לשנייה, וביחס אות לרעש טוב. יש לצמצם את התאורה של נוירוני ה-fil על ידי השארת תריס מקורות האור סגור ככל הניתן. בתוכנת הדימות, בחרו אזורי עניין (regions of interest) או RoIs.אזורים אלה מגדירים היכן התוכנה תבצע מדידות עוצמה. בדרך כלל אנו מדמיינים ענפים ראשוניים, שניוניים ושלישוניים של הנוירון הפרה-סינפטי. מקמו ROI נוסף לצד הנוירון ה-difi כדי לקבל ערך רקע שיסורק מאוחר יותר מכל שאר נקודות הנתונים.אלקטרודות להקלטה תוך-תאית בנוירונים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים משמשות להשראה ולניטור של תמסורת סינפטית. ניתן להבטיח סנכרון בין רכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיים לבין רכישת נתוני דימוי אם משתמשים באות הטריגר (frame out trigger) של המצלמה כדי להפעיל את התוכנה לרכישת נתונים. דרך נוספת להבטחת סנכרון היא התקנת LED בתוך פתח המצלמה.נורת LED זו נדלקת לזמן קצר בתחילת סשן ההקלטה, ובכך מספקת סימן לסנכרון. במהלך ניסוי טיפוסי, מעוררים פוטנציאלי פעולה בנוירון הפרה-סינפטי על ידי הזרקה של פולסי זרם קצרים. בדוגמה זו, אנו מראים פרץ של ספייקים (spikes) ועליות תואמות באות הסידן כדי לבחון היפותזות ספציפיות.ניתן להשפיע על אות הסידן ולקבוע את השפעותיו על ההעברה הסינפטית. לדוגמה, ניתן להזריק באופן פרה-סינפטי או להחדיר באמצעות מערכת הפרופוזיה תרופות כגון הצ'לטור של סידן EGTA. הנתונים מנותחים על ידי ייצואם מתוכנת הדימוג לקובץ טקסט ולאחר מכן לתוכנה ששימשה לרכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים, שבמקרה שלנו היא spike two של Cambridge Electronic Design.אנו משתמשים בסקריפט שנכתב בהתאמה אישית כדי להוציא גרף של ערכי העוצמה של ה-ROI והשינויים התואמים בפוטנציאל הממברנה, ולכמת שינויים באות הסידן על ידי חיסור אות הרקע שהתקבל מ-ROI הרקע וחישוב השינוי היחסי באמצעות המשוואה המוצגת. F zero הוא הפלואורסצנציה רגע לפני הגירוי, ו-F הוא הפלואורסצנציה במהלך הגירוי. כאן אנו מציגים תוצאות של ניסוי שבו דימנו שינויים בפלואורסצנציית סידן בנוירון B 21 שזוהה.האזור שצילמנו מסומן ב-A; ב-B 1, השרנו פרץ של פוטנציאלי פעולה (spikes) ב-B 21, אשר גרמו לפוטנציאלים פוסט-סינפטיים ב-B 8 ולשינוי באות הסידן. B 2 מראה את ההשפעה של הזרקת קלטור הסידן EGTA; פוטנציאלי פעולה ב-B 21 אינם גורמים עוד לעליות נרחבות בפלואורסצנציית הסידן, ואמפליטודת הפוטנציאל הפוסט-סינפטי פחתה.לסיכום, הדגמנו טכניקות שניתן להשתמש בהן כדי לנטר בו-זמנית את ריכוז הסידן התוך-תאי ולהעריך את יעילות התמסורת הסינפטית. טכניקות אלו דורשות ציוד צנוע בלבד בהשוואה לרוב שיטות הדימות התפקודי, והן קלות ומהירות ללמידה.

monitoring-changes-intracellular-calcium-concentration-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית

הטכניקה מתוארת עבור השתלה...

אלקטרודה ייצור השרשה ב Aplysia californica עבור הקלטות רב ערוצי עצבית ושרירי ב, חיים שלמים חופשי מתנהג

הניסויים להפגין גישה נוחה לסטודנטים לצבור ניסיון לבחינת מבנה השריר, תגובות הסינפטי, את ההשפעות של הדרגתיים יונים חדירות על פוטנציאל הממברנה. כמו כן, חושית-CNS-מנוע שריר מעגל מוצג להראות אמצעי לבחון השפעות של חומרים במעגל עצבי.

ממברנה פוטנציאלים, התגובות Synaptic, המעגלים הנוירונים, Neuromodulation ו היסטולוגיה שרירים שימוש סרטן הנהרות: מעבדה תרגילים סטודנטים

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת...

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

חילזון ימי Aplysia californica כבר בשימוש נרחב כמודל נוירוביולוגיה למחקרים על בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות. כאן מתוארת מתודולוגיה לחקר מערכת העצבים של Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים של מעגלים עצביים מזוהים.

אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

הפרוטוקול מתאר את השיטה של העמסת צבע סידן פלואורסצנטי דרך העצב החתוך לתוך מסופי העצבים המוטוריים של העכבר. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לרישום ארעי סידן מהירים בקצות העצבים ההיקפיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

רישום של סידן חולף בצומת נוירומוסקולרי עכבר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

למד מעקב סימולטני אחר ריכוז סידן תאי ויעילות סינפטית ברכיכות Aplysia באמצעות Calcium Orange ואלקטרודות תוך-תאיות. שיטה זו מאפשרת חקר פלסטיות סינפטית במערכת העצבים.

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות

גלה סרטונים נוספים