מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות Aplysia

סידן תוך-תאי נרמז כחלק חשוב ממספר מנגנונים של פלסטיות סינפטית. ניתן לבחון רעיונות אלה על ידי ניטור בו-זמני של שינויים בסידן ושינויים ביעילות הסינפטית. כאן אנו מדגימים כיצד זה מושג על ידי שילוב הדמיית סידן עם הקלטה תוך-תאית.

הניסויים שלנו נערכים עם גנגליון של הרכיכה Aplysia Cahora. לתכשיר זה יש מספר יתרונות כמו נוירונים מזוהים גדולים, הטמפרטורות הנמוכות הטבעיות לאפיה, אותות איטיים ומקלים על הדמיה, אך הטכניקות הכלליות שאנו מדגימים מועברות בקלות למערכות אחרות. שלום, אני קולין אוונס במעבדה של אליזבת קרופר במחלקה למדעי המוח של פישבורג ובמכון פרידמן למוח בבית הספר לרפואה של הר סיני בניו יורק.

היום, אנו הולכים להדגים הדמיה סימולטנית של שינויים בריכוז הסידן התוך תאי וביעילות הסינפטית בגנגליון הבוקאלי של הרכיכה Aplysia cahora. כדי לזהות סידן תוך תאי, נזריק לנוירון פרה-סינפטי את צבע הסידן הקבוע של התא IMP בצבע כתום. לאחר מכן התכשיר מועבר תחת מיקרוסקופ ונוירונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים מוטבעים באלקטרודות חדות.

גירוי פרה-סינפטי חוזר מביא לתגובה פוסט-סינפטית מוגברת הנראית כהגדלת הפוטנציאל הפוסט-סינפטי או משרעת PSP. מדידת האות הפלואורסצנטי של צבע אינדיקטור הסידן תאפשר לנו לזהות שינויים בו זמנית בסידן תוך-תאי פרה-סינפטי. כדי להתחיל להרדים בעל חיים בוגר במשקל של כ-150 גרם על ידי הזרקת 75 מיל של תמיסת מגנזיום כלוריד איזוטונית, הצמד את החיה המורדמת לכלי מכוסה שעווה, ולאחר מכן באמצעות מלקחיים גסים ומספריים, בצע חתך בכף הרגל של החיה וחשוף את המסה הבוקאלית.

הגנגליון הבוקאלי שוכן בצד הגחון של המסה הבוקלית ומורכב משני גרעיני המי מחוברים. הוא מכיל כמה מאות נוירונים שיחד עם נוירונים בגרעינים אחרים תורמים לייצור ולשליטה בהתנהגות האכילה של החיה. שחרר בזהירות את הגנגליון על ידי חיתוך כל העצבים הקשורים במספריים עדינים והסר אותו מהחיה.

לאחר מכן הצמידו את הגנגליון המשוחרר לבסיס צלחת מצופה סיל גארד מלאה במי ים מלאכותיים. הגנגליון עטוף במעטפת של רקמת חיבור, אותה יש להסיר כדי לחשוף את הנוירונים הבודדים. השתמש במלקחיים מאמתים, מספריים לקשתית ובזהירות רבה כדי לחתוך את הנדן הזה.

כדי להימנע מפגיעה בנוירונים, ייצב את גנגליון הנדן עם סיכות של כ-15 דקות מכיוון שכל תנועה תהיה בעייתית במהלך ההדמיה. כדי להכין אלקטרודות חדות להקלטה תוך תאית והזרקת צבע, משוך צינורות נימיים בעזרת מושך מיקרו אלקטרודות. אנו משתמשים בזכוכית סיליקט נימה דקה בקוטר חיצוני של מילימטר אחד.

אלקטרודות ההקלטה צריכות להיות בעלות התנגדות של כ -10 מגה כאשר הן מלאות בשלוש אצטט אשלגן מולארי, ולכן אנו מכוונים את המושך בהתאם למילוי אלקטרודות D. טבלו את החלק האחורי של האלקטרודה הנמשכת בתמיסה של 10 מילי-מולרית של פעולת נימי הצבע הכתום של הסידן לאורך חוט הזכוכית בתוך האלקטרודה תמשוך צבע לקצה, ולאחר מכן מלאו מחדש את האלקטרודה באשלגן כלורי של 200 מילי-מולרי כדי להבטיח מגע חשמלי טוב. אנו משתמשים בבלה שנבנתה בהתאמה אישית כדי לשפר את תכונות האלקטרודה ולהוריד את התנגדות אלקטרודות ההקלטה לכחמישה מגה.

האלקטרודה מוחזקת בזווית של 45 מעלות לתוך זרם של מתלה תחמוצת אלומיניום. ערבוב נתרן כלורי לתוך המתלה וחיבור מד ome מאפשר ניטור של התנגדות האלקטרודה. במהלך תהליך השיפוע, אנו מעבירים את הצלחת המכילה את גרעיני האבזם המרומים למתקן אלקטרופיזיולוגיה ומאתרים את הנוירונים המעניינים על ידי הדבקתם באלקטרודות ואימות זהותם.

כדי להכין נוירון להדמיית סידן, אנו מכניסים תחילה אלקטרודה מלאה בצבע לתוך התא וטוענים את אלקטרו הצבע באופן תיאורטי עם 30 דקות של פולסים של זרם היפרפולריזציה של 15 ננו-אמפר. כאשר תפוז הסידן D נכנס לתא, ה-SOR יקבל צבע ורוד קלוש. לאחר מכן אנו מושכים בזהירות את אלקטרודות ההקלטה ומשאירים את התכשיר יושב לפחות 30 דקות כדי לאפשר לצבע להתפזר לתוך התהליכים העדינים של הנוירון.

לאחר מכן, העבירו את המנה עם התכשיר למיקרוסקופ פלורסנט. אנו משתמשים בעדשת טבילה במים פי 10 NA 0.3 במיקרוסקופ שלב קבוע זקוף, המתמקד על ידי הזזת העדשה ולא על הבמה. זה מקל על הרכבת מניפולטורים.

עבור אלקטרודות ההקלטה בחר בלוק פילטר מתאים. בלוק SI שלושה מסננים יספק את מסנני העירור והפליטה הנכונים עבור סידן כתום, יתאים את פרמטרי המצלמה ואת עוצמת התאורה עם מסנני צפיפות ניטרלית וצמצם השדה. יותר אור יגרום לפחות רעש, אך עלול להלבין את התכשיר.

מצלמת ה-CCD המגניבה יכולה ללכוד שדה של 500 על 300 פיקסלים בקצב פריימים של כ-30 פריימים לשנייה, ויחס אות לרעש טוב. צמצם את התאורה של נוירוני הפיל על ידי שמירה על תריס מקורות האור סגור במידת האפשר. בתוכנת ההדמיה, בחר אזורי עניין או R ois.

אזורים אלה מגדירים היכן התוכנה תבצע מדידות עוצמה. בדרך כלל אנו מדמים ענפים ראשוניים, משניים ושלישוניים של הנוירון הפרה-סינפטי. מקם החזר ROI נוסף ליד נוירון ה-difi כדי לקבל ערך רקע שמופחת מאוחר יותר מכל נקודות הנתונים האחרות.

אלקטרודות הקלטה תוך-תאיות בנוירונים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים משמשות לגרימה ולניטור של העברה סינפטית. אתה יכול להבטיח סנכרון בין רכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיים והדמיה אם אתה משתמש באות ההדק של המצלמה כדי להפעיל את תוכנת רכישת הנתונים. דרך נוספת להבטיח סנכרון היא הרכבת LED בתוך יציאת המצלמה.

נורית זו נדלקת לזמן קצר בתחילת ההקלטה, ובכך מספקת סימן סנכרון. במהלך ניסוי טיפוסי, אתה מפעיל פוטנציאל פעולה בנוירון הפרה-סינפטי על ידי הזרקת פולסים קצרים של זרם. בדוגמה זו, אנו מראים פרץ של קוצים ועלייה מקבילה באות הסידן כדי לבחון השערות ספציפיות.

ניתן לתפעל את אות הסידן ולקבוע את ההשפעות על ההעברה הסינפטית. לדוגמה, ניתן להזריק או ליישם תרופות כגון כלטור הסידן EGTA באופן פרה-סינפטי דרך מערכת הזילוף. הנתונים מנותחים על ידי ייצואם מתוכנת ההדמיה לקובץ טקסט ולאחר מכן לתוכנה ששימשה לרכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים, שבמקרה שלנו הם ספייק 2 על ידי קיימברידג' אלקטרוניק דיזיין.

אנו משתמשים בתסריט כתוב מותאם אישית כדי לשרטט את ערכי עוצמת ה-ROI והשינויים המתאימים בפוטנציאל הממברנה מכמתים שינויים באות הסידן על ידי הפחתת אות הרקע המתקבל מה-ROI ברקע וחישוב השינוי היחסי עם המשוואה המוצגת. F אפס הוא הקרינה ממש לפני הגירוי, ו-F היא הקרינה במהלך הגירוי. כאן אנו מראים תוצאות של ניסוי שבו הדמיינו שינויים בפלואורסצנטיות הסידן בתא העצב המזוהה B 21.

האזור שצילמנו מצוין ב-A, ב-B אחד, גרמנו לפרץ של קוצים ב-B 21, מה שגרם לפוטנציאלים פוסט-סינפטיים ב-B 8 ולשינוי באות הסידן. B 2 מראה את השפעת הזרקת כלטור הסידן. עליות EGTA ב-B 21 כבר לא גורמות לעלייה נרחבת בפלואורסצנטיות הסידן ומשרעת הפוטנציאל הפוסט-סינפטי פוחתת.

לסיכום, הדגמנו טכניקות שניתן להשתמש בהן כדי לנטר בו זמנית את ריכוז הסידן התוך תאי ולהעריך את יעילות ההעברה הסינפטית. טכניקות אלו דורשות ציוד צנוע בלבד בהשוואה לרוב ההדמיה הפונקציונלית והן קלות ומהירות ללמידה.