Name: ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנא ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: למדו פרוטוקול לניתוח מתילציה DNA וביטוי גנים בעכברים לאחר לחות מוקדמת בחיים. השיטה כוללת הפרדה אימהית, בידוד DNA ו-RNA מנקודות רקמת מוח, וריצוף ביסולפיט לזיהוי שינויים אפיגנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו מומנה על ידי ממכון מקס פלנק לפסיכיאטריה מארי האיחוד האירופי רשת קירי ההכשרה הראשונית (חוזה NINA 238665).

<ol><li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li>
<li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis%3A+Early+life+decides%5BTitle%5D)+AND+%22Stress+%28Amsterdam%2C+Netherlands%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li>
<li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li>
<li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li>
<li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockmühl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+learn+from+stress%3A+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%2C+Compact%3A+The+Coronal+Plates+and+Diagrams%3A+Compact.+The+Coronal+Plates+and+Diagrams%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams</a>. , Elsevier Science Publishing Co Inc. (2008).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+research+notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li>
</ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

תכנות epigenetic מוכרת יותר ויותר לבריאות מנגנון חשוב הבסיס לבין המחלה. כאן אנו מציגים שיטה מעודנת לבידוד בו זמנית של DNA ו-RNA מ micropunches ואת הצעדים הבאים כדי לקבל פרופילים מתילציה דנ&quot;א באמצעות רצף bisulfite. עבודה אופטימיזציה מאפשר ניתוח נוח של תכנות epigenetic במוח בתגובה לגירויים סביבתיים. יתר על כן, גישה זו מקלה על חקירת הקשר הפונקציונלי בין מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים כמו גם מנותחים מדגם זהה. לבסוף, מספר בעלי החיים הדרושים לניסוי ניתן לצמצם באופן משמעותי. אמצעי זהירות מסוימים והנחיות חייבות לבוא בעת ביצוע העבודה שהוצג. בהתחשב במורכבות יוצאת דופן ההטרוגניות של המוח ומאז דפוס מתילציה והביטוי עשויה להשתנות באופן תאים ורקמות ספציפי זה של מירבכי micropunching חשיבות מתבצע בצורה סטנדרטית. כמו במקרה של הנקודה, תכנות epigenetic של AVP מתגלה paravaventriuclar, אבל לא בגרעין supraoptic (איור 4 ב &#39;, ד), 2 AVP להביע אזורי ההיפותלמוס 4. מבחינה זו, הזמינות של DNA ו-RNA של אגרוף רקמות זהה יש יתרון ביטוי RNA של גנים מסוימים ברקמות ספציפיות סמן יכול לשמש במקרים מסוימים לאשר כי השטח הנכון היה אגרוף. למרות micropunching יכול להפחית ההטרוגניות הסלולר, הוא צריך לזכור כי גישה זו אינה מובילה לבידודה של סוגי תאים בודדים או אוכלוסיות. צעדים נוספים טיהור עשוי להיחשב לטפל בנושא זה. עבור bisulfite רצף עיצוב פריימר האופטימלי לטיפול PCR bisulfite הבאה הגברה חיוני. מוצרי ה-PCR העולה על 400 נ&quot;ב באורך עלולה להיות בעייתית בשל הידרדרות של ה-DNA על ידי בisulfite הטיפול. יש לציין גם כי ה-PCR מקונן יכול לתת תוצאות מוטות אם רק כמה תבניות שלמות כמה לתרום לתהליך ההגברה. זוגות פריימר ספציפיים עבור amplicon שונה צריך להיות מתוכנן, רצפים שלהם לא יכילו dinucleotides CPG על מנת למנוע מתילציה מוטות הגברה. בנוסף, primers צריך להכיל לא CPG cytosines כדי למנוע הגברה של DNA ללא שינוי או המרה באופן חלקי. הגברה של מספר תבניות עשויות להפיק תועלת בניהול חם תחילת PCR. בכל מקרה, התאמת זוגות פריימר צריך להיות מאומת בניסויים הטייס כדי למנוע קלקול של דגימות ניסויים חשובים. סידור bisulfite מייצג שיטה סטנדרטית לניתוח באתר מתילציה ספציפי כפי שהוא מסוגל לזהות באופן אמין ומדויק מתילציה של שאריות CPG יחיד באופן אלל ספציפי 8. רצף ישיר של מוצר ה-PCR לא מומלץ, היות מתילציה o מעורבתשאריות fa CPG יופיעו השיא C / T כפול electropherogram, אשר יכול למנוע כימות של מתילציה באתר מודאג. מסיבה זו הצעד שיבוט ביניים מבוצע שיבוטים כמה הם רצף (~ 20-30) כדי לקבוע את מידת מתילציה. Pyrosequencing מייצג שיטה חלופית לכמת מתילציה בדנ&quot;א. הוא גם מנצל ההמרה bisulfite ו bisulfite PCR אבל במקום השיבוט רצף amplicon נתונה התגובה pyrosequencing ישיר, שבו מצב מתילציה של שאריות CPG נקרא פולימורפיזם כמו C / T נוקלאוטיד יחיד, שניתן לכמת בקלות. שתי השיטות לזהות רמות דומות של מתילציה 9 אבל מאז שיבוט שלב ניתן להשמיט pyrosequencing יותר זמן יעיל. עם זאת, בהתאם לתבנית רק 40-100 נוקלאוטידים יכול להיות רצף בבת אחת, כך מספר סבבי pyrosequencing עם פריימר סידור שונה נחוצים. זוהי מגבלה קריטית, בהתחשב thaסכומים לא גבוהים יותר של ה-DNA (כ 1 מיקרוגרם לכל תגובה) נדרשים, דבר הנראה לעין יעלה על הסכומים הזמינים מן המכות רקמה זעירים במוח. כך סריקה ראשונית של אזורים בטווח של כמה kilobases ידי pyrosequencing נראה פחות מתאים כמו קריאה שיבוט אחד. אף על פי כן, לאחר זיהוי על אזור קטן של pyrosequencing עניין יש לשקול. באופן קולקטיבי, את הפרוטוקול המתואר לעיל מספק גישה מדויק, יעיל יעיל לניתוח מהיר וחסכוני של micropunches המוח לשינויים epigenetic. דגימות מרובות ניתן לעבד בטווח אחת השיטות מתאימות בזמן הרצת דגימות ביניים בגודל ניסויים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> דם DNeasy &amp; ערכת רקמות </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td> Macherey-נגל </td><td> 740,955.50 </td></tr><tr><td> Epitect ערכת bisulfite </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospin חלץ </td><td> Macherey-נגל </td><td> 740,609.50 </td></tr><tr><td> pGEM-T וקטור שיבוט Kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-נגל </td><td> 743,100.50 </td></tr><tr><td> מונטאז רצף 96 ניקוי </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar פולימראז Taq </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq פולימראז </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

חשיפה דיאטה, תרופות מצוקות החיים בשלב מוקדם של Windows רגישים של 1,2 החיים יכולים להוביל לשינויים בר קיימא ביטוי גנים התורמים התצוגה של פנוטיפים פיזיולוגיים והתנהגותיים. תכנות סביבתי כזה עלול להגביר את הרגישות, מחלות מטבוליות לב וכלי דם הנפש 3,4. מתילציה דנ&quot;א שינויים היסטון נחשבים תהליכים מרכזיים בגישור של דיאלוג גנים הסביבה ומופיעות גם רובד תחתון תכנות הסביבה 5. אצל יונקים, מתילציה בדנ&quot;א בדרך כלל כוללת בנוסף קוולנטי של קבוצת מתיל במיקום-5 של ציטוזין בהקשר של dinucleotides CPG. מתילציה CPG מתרחשת באופן רקמות ותאים ספציפי מאוד מה שהופך אותו לאתגר ללמוד בדידים, אזורים קטנים של המוח שבו ההטרוגניות הסלולר הוא גבוה וכמות הרקמה מוגבלת. יתר על כן, בביטוי גנים מתילציה ecause ו מתקיים קשר הדוק אירועים, ערך מוגבר ניתן להשיג על ידי השוואת שני הפרמטרים במדגם זהה. כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד (איור 1) לחקירה של תכנות epigenetic במוח מוצג באמצעות פרדיגמה &quot;הפרידה מן האם&quot; צרה חייו המוקדמים לשם המחשה. הפרוטוקול מתאר את הכנת micropunches של מוחות עכבר דיפרנציאלי בגיל שממנו DNA ו-RNA יכול להיות מבודד בו זמנית, ובכך מאפשר מתילציה בדנ&quot;א וביטוי גנים ניתוחים במדגם זהה.

זרימת עבודה יעילה ללמוד מתילציה דנ&quot;א ביטוי שינויים גנטיים על הלחץ מוקדם בחיים מוצג. החל מ הפרידה מן האם של עכברים בני יומם ובידוד של רקמות מוח נפרדים, אנחנו מייצגים את הפרוטוקול בו זמנית לבודד DNA ו-RNA של אגרופים רקמות המוח רצף bisulfite עתידיים RT-PCR ניתוח.

חשיפה לתזונה, לתרופות ולמצבי דחק בשלבי חיים מוקדמים במהלך חלונות רגישות בחיים 1,2 עלולה להוביל לשינויים מתמשכים בביטוי הגנים, התורמים ל...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור שינויים במתילציה של DNA וביטוי גנים בעקבות סטרס בשלב מוקדם של החיים. דבר זה מושג תחילה על ידי חשיפת גורי עכבר רכים להפרדה מאמם כדי להשרות סטרס בשלב מוקדם של החיים, ובשלב שני מופקים אזורי מוח רלוונטיים, במקרה זה ה-PVN, באמצעות מיקרו-דיסקציה in loco, ו-DNA ו-RNA מבודדים בו-זמנית מדגימה בודדת של רקמה (tissue punch).בשלב הבא, ה-DNA שהתקבל עובר טיפול בסולפיט, והאזור המדובר מועשר באמצעות bi sulfite PCR. לאחר מכן, המקטע מקושר לתוך וקטור ומועבר לתוך חיידקים באמצעות טרנספורמציה. טרנספורמציות מוצלחות מזוהות על ידי ביטוי של סמן ובדיקת גודל פרגמנט ה-PCR.ולבסוף, רצף ביסולפיט משמש להערכת מצב המתילציה. היתרון המרכזי של תהליך עבודה זה הוא שהוא מאפשר ניתוח נוח של תכנות אפיגנטי בתגובה לגירויים סביבתיים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תכנות אפיגנטי כתוצאה מקשיים בשלבי חיים מוקדמים.ניתן ליישם זאת גם על מערכות אחרות. בכל מקרה שבו נבדקים מתילציה וביטוי גנים בסביבה בעלת סגוליות רקמתית גבוהה ובכל מקרה שבו זמינות הרקמה מוגבלת. כדי להשרות סטרס במוקדם של החיים, מתבצעת הפרדה אימהית לגורים של נקבות C 57 black six N בהריון מתואם זמן כדי להשפיע על ההפרדה האימהית.העבירו כל שגר להקליד נקי ומחומם למשך שלוש שעות מדי יום מהיום הפוסטנטלי הראשון ועד היום ה-10; השאירו את גורי הביקורת ללא השפעת גורמי לחץ ללא הפרעה. מלבד ההפרדה למשך שלוש שעות, כל השגרים נשארים עם אמותיהם עד לגמילה ביום הפוסטנטלי ה-21. לאחר מכן, הגורים מאוחסנים בקבוצות תואמות מינית, שלושה עד חמישה עכברים לכל כלוב, תחת תנאי מחיה סטנדרטיים. כדי להתחיל באיסוף רקמת מוח, המוחות של העכברים מוצאים מהגולגולת ומוקפאים מיד בקרח יבש (dry ice) ומאוחסנים בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.כאשר תהיו מוכנים לאיסוף דגימות הרקמה (tissue punches), הוציאו את המוחות מהמקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות והניחו אותם על קרח יבש. התחילו בביצוע חיתוך קריוסטטי (cryosectioning) של המוחות לפרוסות קורונליות בעובי 10 micron, מהחלק הרוסטרלי (rostral) לכיוון הקודלי (caudal). העבירו את הפרוסאות לשקופיות זכוכית מסוג super frosts וייבשו אותן לצורך צביעת כריסטל ויולט (crystal violet).ניתן להכין ולהקפיא סרטיות נוספות בטמפרטורה של 20- מעלות לצורך ניתוחים נוספים, כגון הibridization in situ. כאשר מתחילים בתהליך הדגימה, צבע את הסרטיות ב-crystal violet כדי לזהות את מבני המוח הרלוונטיים. לאחר מכן, בעזרת מחט דגימה, בצע דגימות של 0.8 millimeter מהאזורים הרלוונטיים באמצעות microdissection in loco.יש לאחסן את הדגימות (punches) במינוס 80 מעלות צלזיוס. חשוב ביותר לבצע את הדגימה המיקרוסקופית (micro punching) באופן סטנדרטי, כיוון שביטוי גנים ומתיליזציה הם תלויי-רקמה באופן משמעותי. הומוגניזרו את הדגימות ב-400 µL של תמיפת qadium thiocyanate בעזרת פיפט, ולאחר מכן ערבבו במכשיר vortex בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, העבירו את הליזאט שהתקבל דרך מזרק בכילייב 29. חזרו על הפעולה מספר פעמים עד שהדמעסה (punch) לא תהיה נראית עוד. פצלו את הליזאט לחלקים שווים.אחד לעיבוד RNA, אותו יש לבצע תחילה, והשני לעיבוד DNA, אותו ניתן לשמור בטמפרטורה של החדר עד לסיום עיבוד ה-RNA לטובת טיהור RNA באמצעות נפח של 1/10 סודיום אצטט, נפח אחד של aqua phenol וחצי נפח של כלורופורם לאיזואמיל ביחס של 24:1. ערבבו את התערובת ב-vortex בעוצמה לאחר כל הוספה, והדגירו את התערובת הסופית על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, סבבבו את התערובת בצנטריפוגה.אסוף את הפאזה המימית והוסף לה נפח שווה של 70% ethanol. באמצעות ערכה של עמודי ספין ל-RNA, בצע עיכול של ה-DNA על העמוד, שטוף ואלוט את ה-RNA לתוך 25 microliters של מים.כעת טהרו את ה-DNA באמצעות פרוטוקול של ערכה ששונה כך שיכלול הוספה של עיכול RNase, וחימום של בופר האלוציה ועמודת האלוציה ל-70 °C לפני השימוש בהם. 10 דקות ב-70 °C מספיקות עבור העמודות. לבסוף, השתמשו בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוזי ה-DNA וה-RNA.דגימה טיפוסית של PVN באמצעות punch מניבה כ-600 nanograms של DNA וכ-400 nanograms של RNA; יש להפריש כ-100 nanograms של RNA לצורך ניתוח ביטוי גנים באמצעות quantitative PCR לפני ההגברה באמצעות sulfite. יש לטפל ב-200 nanograms של ה-DNA המבודד באמצעות ערכה זמינה מסחרית להגברת DNA מאזורים מתילתיים. יש להזמין פריימרים שתוכננו במיוחד עבור DNA שעבר המרה ב-bisulfite; תכנון אופטימלי של פריימרים ב-bisulfite PCR הוא חיוני, שכן האיכות והספציפיות של ה-PCR amplicon קובעות את הצלחתו של השלבים הבאים.עם הגעת הפריימרים, קבעו את טמפרטורת הקישור האופטימלית שלהם באמצעות ניסויי פיילוט. השתמשו בשני µL של DNA שעבר טיפול בביסולפיט כתבנית עבור כל תערובת PCR בנפח של 25 µL.בצע הגברה לתערובת החל משלב דנטורציה של שש דקות ב-95 °C, ולאחריו 45 עד 50 מחזורי הגברה, לפני שלב מארכה סופי של חמש דקות ב-72 °C. נתח 7 µL מתוצר ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה בג'ל agarose כדי לוודא את גודל האמפליקון. טהר את תוצר ה-PCR שנותר לצורך ליגציה בהמשך, באמצעות ערכה מסחרית לניקוי PCR.במידה והתקבלו תוצרי PCR לא רצויים, השתמש בטיהור בג'ל כדי לבודד את התוצר הרצוי עבור פרוטוקול זה. נעשה שימוש בערכה מסחרית לשיבוט. יעילות השיבוט תלויה באופן קריטי ברצף המוכנס (insert).לכן, אם מתקבלים שוב ושוב מספרים נמוכים של שיבוטים רקומביננטיים, נסו וקטור שיבוט אחר. הכינו תגובת ליגציה של 10 µL עם 1 µL של וקטור ו-3 µL של תוצר PCR מנוקה. ערבבו את התגובה באמצעות פיפטור והדגרירו אותה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C עד למחרת.נקו את תגובת הליגציה באמצעות שיטה קלאסית של שקיעה באתנול והעבירו את המוצר לחיידקים בתהליך טרנספורמציה. הוסיפו מיליליטר אחד של מצע SOB שחומם מראש מיד לאחר מתן הפולס, והעבירו את החיידקים שעברו טרנספורמציה למבחנה של תגובה. לאחר השבת החיידקים למשך שעה אחת ב-37 °C, פזרו 100 µL מכל תרחיף על צלחת LB עם ampicillin המצופה ב-IPTG.דגרו את הצלחות הגידול למשך לילה עד שניתן יהיה לבודד מושבות. הכינו תגובות colony PCR של 25 microliter בצלחת 96 בארות, תוך שימוש ב-three microliters של 2.5 millimolar magnesium chloride בכל תגובה. בחרו שיבוטים לבנים חיוביים בעזרת טיפ פטה והעבירו אותם לתערובת ה-PCR באמצעות טבילה פשוטה.התחל את תגובת ה-PCR במחזור המסה של ארבע דקות. לאחר מכן, בצע 10 מחזורי הגברה בטמפרטורת annealing של 56 °C. כל שלב במחזורים אלו נמשך 30 שניות.לאחר מכן הנמיכו את טמפרטורת ההדבקה ל-48 °C למשך 30 מחזורי הגברה נוספים. סיימו במחזור הארכה של חמש דקות. כעת טענו 5 µL מכל תוצר על ג'ל agarose וזהו את התגובות המכילות מקטע (insert) בגודל הנכון.השתמשו בערכה זמינה מסחרית לניקוי תוצרי ה-PCR הרצויים, כדי שניתן יהיה לבצע להם ריצוף באמצעות שיטת BigDye Terminator cycling sequencing. בלוחית של 96 בארות, טענו לבארות שלושה µL של תערובת ריאקציה (master mix) של BigDye, ולאחריה שני µL של תוצר colony PCR מנוקה. הריצו את התגובה בטרמוסייקלר, החל מדקה אחת ב-96 °C, ולאחריה 35 מחזורים של 10 שניות ב-96 °C, חמש שניות ב-50 °C, וארבע דקות ב-60 °C.לאחר סיום תגובת ה-big die, נקה את התגובה באמצעות לוח טיהור big die. לאחר קבלת הרצפים, נתח אותם באמצעות ה-big analyzer המקוון או כלי ה-B-I-S-M-A כדי להסיק את תבנית המתילציה של אזור ה-DNA הנחקר, במטרה להבין את השפעת סטרס במוקדם החיים או ELS על ביטוי וסטטוס מתילציה של a VP. עכברים מסוג C 57 black sticks עובדו בהתאם לפרוטוקול המתואר, הגרעין הפרבנטריקולרי והגרעין הסופראופטי נדגרו כדי לבודד DNA ו-R-N-A; ה-D-N-A עבר טיפול בביסולפיט והוגבר עם פריימרים ספציפיים ל-a VP enhancer, ותוצרי ה-PCR שובטו ורוצפו, כאשר לפחות 20 שיבוטים רקומביננטיים מכל עכבר נבדקו.בוצע ניתוח לתוצרי PCR כדי לקבוע את תדירויות המתילציה עבור ה-CPGs הכלולים באמפליקון ה-PCR ברקמה מה-P-V-N-E-L-S, אשר גרם להיפומתילציה משמעותית בארבעה מיקומים במגביר של A VP, מה שמרמז על סימון אפיגנטי של אזור רגולטורי זה דרך חוויות בשלבי החיים המוקדמים. בניגוד ל-PVN, המתילציה של מגביר A VP לא הושפעה מ-ELS ב-SON, מה שממחיש את הספציפיות הרקמתית של האפקט האפיגנטי. בבעלי חיים של קבוצת ביקורת, מצב מתילציית ה-DNA ב-CPG 10 נמצא במתאם שלילי עם ביטוי הגן של a VP, מה שמעיד על תפקידה של מתילציית DNA בכוונון עדין של ביטוי הגן a VP. לאחר הליך זה, ניתן לבצע בקלות שיטות אחרות כמו UPCR על ה-RNA המבודד כדי לענות על שאלות נוספות, כגון שינויים בביטוי גנים ברקמה המנותחת.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן חקירת שינויים במתילציה של DNA בתגובה לגירויים סביבתיים או כאלו התלויים בניסיון.

optimized-analysis-dna-methylation-gene-expression-from-small

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

עד לאחרונה, מחקרים ביטוי על המוח האנושי היו מוגבלים כימות של RNA או חלבון. בעזרת טכניקות immunoprecipitation הכרומטין המתואר במאמר זה, ניתן יהיה למפות מתילציה היסטון ורגולטורים אחרים epigenetic של ביטוי גנים במוח שלאחר המוות.

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

כתב יד זה מתאר פרוטוקול המיישם פרופיל מקיף לניתוח תוכניות שעתוק המושרות בגרעיני מוח ספציפיים של מכרסמים בעקבות פרדיגמות התנהגותיות. כאן, גישה זו מודגמת בהקשר של פרופיל גנים המושרים בגרעין האקומבנס (NAc) של עכברים לאחר חשיפה חריפה לקוקאין, תוך שימוש במערכי qPCR מיקרופלואידיים.

ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות

DNA מתילציה מסוגלת לשמור על רמות יציבות של ביטוי גנים וכן לאפשר שינויים דינמיים בביטוי גנים בתגובה למגוון גירויים. אנו מפרטים טכניקות המאפשרות לחקור שינויים ספציפיים לגנים במתילציה של DNA ואת ההשפעה של שינויים אלה על ביטוי גנים.

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול רצף של methyl-cpG-bonding (MBD) של פרוטוקול רצף וציר חישובי, כדי לזהות אזורים עשירים ב- CpG באופן דיפרנציאלי בחולי לוקמיה כרונית של לימפוציטים (CLL).

ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

חדשות שהתגלו מחמצנים צורות של 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxylcytosine (5caC) עשוי לייצג שינויים ברורים DNA עם תפקידים פונקציונליים ייחודיים. כאן מתוארת זרימת עבודה כמותית למחצה עבור ויזואליזציה של התפוצה המרחבית של oxi-mCs, פרופיל עוצמת האות ו colocalization.

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

להלן, אנו מתארים הליך לניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול. ההליך רלוונטי למחקרים החוקרים קשרים בין דפוסי מתילציה של גנים וגורמים התורמים מסרטן בסרטן מערכת העיכול.

ניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול

אנו מציגים פרוטוקול מהיר, שלב אחר שלב, להסרת מוח עכבר ודיסקציה של אזורים בדידים מרקמת מוח טרייה. השגת אזורי מוח לניתוח מולקולרי הפכה לדבר שבשגרה במעבדות רבות למדעי המוח. אזורי מוח אלה מוקפאים באופן מיידי כדי לקבל נתוני תעתיק באיכות גבוהה לניתוח ברמת המערכת.

מיקרו-דיסקציה של מוח העכבר לאזורים שונים מבחינה תפקודית ואנטומית

המחקר הנוכחי מתאר את זרימת העבודה לניהול נתוני מתילציה DNA המתקבלים על ידי טכנולוגיות microarray. הפרוטוקול מדגים שלבים מהכנה מדגמית לניתוח נתונים. כל ההליכים מתוארים בפירוט, והסרטון מציג את השלבים המשמעותיים.

הכנת מדגם לניתוח ביואינפורמטיקה של מתילציה DNA: אסטרטגיית האגודה להשמנת יתר ומחקרי תכונות נלוות

מחקר זה מציג פרוטוקול מולטיאום מרחבי Trekker–CUT&amp;Tag, המשלב ברקידוד מרחבי ישיר של חתך רקמה עם ניתוח מולטיאום חד-תאים. גישה זו מאפשרת פרופילינג חד-תאי של ביטוי גנים ושינוי ההיסטון H3K27ac בו-זמנית, ומציעה תובנות מכניות על ויסות גנים בהקשר של מיקרואנטומיה של רקמות.

לאחר פתרון מרחבי, פרופיילינג מולטיאומי חד-תאי משולב של מטרות טרנסקריפטום ואפיגנומיה בחתכי רקמה קפואים.

למדו פרוטוקול לניתוח מתילציה DNA וביטוי גנים בעכברים לאחר לחות מוקדמת בחיים. השיטה כוללת הפרדה אימהית, בידוד DNA ו-RNA מנקודות רקמת מוח, וריצוף ביסולפיט לזיהוי שינויים אפיגנטיים.

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ"א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

גלה סרטונים נוספים