ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ"א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור DNA. מתילציה וביטוי גנים משתנים במתח מוקדם בחיים. זה מושג על ידי חשיפה ראשונה של גורי עכברים שזה עתה נולדו להפרדה אימהית כדי לגרום למתח מוקדם בחיים כשלב שני תחומי עניין במוח כאן, ה-PVN מתקבלים על ידי מיקרו-דיסקציה מקומית ו-DNA ו-RNA מבודדים בו זמנית מאגרוף רקמה יחיד.

לאחר מכן, ה-DNA המתקבל מטופל על ידי סולפיט, ואזור העניין מוגבר על ידי PCR דו סולפיט. לאחר מכן זה נקשר לווקטור והופך לחיידקים. טרנספורמציות מוצלחות מזוהות על ידי ביטוי סמן וגודל מקטע PCR.

ולבסוף, ריצוף דו סולפיד משמש להערכת מצב המתילציה. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח נוח של תכנות אפיגנטי בתגובה לגירויים סביבתיים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תכנות אפיגנטי על ידי מצוקה מוקדמת בחיים.

זה יכול להיות ישים גם על מערכות אחרות. בכל מקום שבו מתילציה וביטוי גנים מנותחים בסביבה ספציפית מאוד לרקמות ובכל מקום שבו זמינות הרקמות מוגבלת כדי לגרום ללחץ מוקדם בחיים. הפרדת האם מתבצעת על גורים מסכרים שחורים C 57 בהריון מתוזמן כדי להשפיע על הפרדת האם.

העבירו כל המלטה לכלוב נקי ומחומם למשך שלוש שעות מדי יום מיום 1 עד 10 לאחר הלידה, והשאירו את גורי השליטה ללא לחץ ללא הפרעה. מלבד הפרדה של שלוש שעות, כל ההמלטות נשארות עם אמהותיהן עד הגמילה ביום ה-21 שלאחר הלידה. לאחר מכן שוכנים הגורים בקבוצות תואמות מין, שלושה עד חמישה עכברים לכלוב בתנאי דיור סטנדרטיים כדי להתחיל באיסוף רקמת המוח, מוחות העכברים מוסרים מהגולגולות ומיד מוקפאים בקרח יבש ומאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כאשר מוכנים לאסוף את אגרופי הרקמות, הוציאו את המוחות מהמקפיא במינוס 80 מעלות והניחו אותם על קרח יבש. התחל בהקפאה של המוחות לחלקים עטרתיים של 10 מיקרון מרוסטרל לקודל. הרכיבו את החלקים על שקופיות זכוכית סופר כפור וייבשו אותם לצביעה סגולה של הפסגה.

ניתן לקחת שקופיות נוספות ולאחסן אותן במינוס 20 מעלות לצורך ניתוחים נוספים, כגון הכלאה באתרה של שתי שניות. כשאתם מוכנים לחטוף אגרופים, צבעו את השקופיות בסגול קרסטלי כדי לזהות מבנים במוח מעניינים. לאחר מכן בעזרת מחט ניקוב, קח אגרופים של 0.8 מילימטר מאזורי העניין המשתמשים במיקרו-דיסקציה של לוקו.

יש לאחסן את האגרופים במינוס 80 מעלות צלזיוס. יש חשיבות קריטית לכך שמיקרו ניקוב יבוצע בצורה סטנדרטית מכיוון שביטוי גנים ומתילציה הם מאוד ספציפיים לרקמות. הומוגניזציה של האגרופים ב-400 מיקרוליטר של מאגר קדיום תיוציאנט באמצעות פיפטה ואז מערבולת בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, העבירו את הליזאט שנוצר דרך מזרק בגודל 29. כמה פעמים האגרוף כבר לא אמור להיות גלוי. מחלקים את הליזט לחלקים שווים.

האחד לעיבוד RNA, שצריך להיעשות תחילה והשני לעיבוד DNA, שניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד לעיבוד ה-RNA לטיהור RNA בנפח עשירי של נתרן אצטט, נפח אחד של אקווה פנול וחצי נפח של 24 לכלורופורם אחד למערבולת איזואמיל AML. התערובת נמרצת לאחר כל הוספה ודוגרת את המרקחת הסופית על קרח למשך 10 דקות. ואז צנטריפוגה את התערובת.

אוספים את השלב המימי ומוסיפים לו נפח שווה של 70% אתנול. שימוש בערכת עמודות סיבוב RNA. בצע עיכול DNA על העמודה ושטוף את ה-RNA ב-25 מיקרוליטר מים.

כעת טהר את ה-DNA באמצעות פרוטוקול ערכה ששונה כך שיכלול תוספת של עיכול של RN a, וכדי לחמם את המאגר האלוציאני ואת העמודה האלוציאנית ל-70 מעלות צלזיוס לפני השימוש בהם. 10 דקות ב-70 מעלות צלזיוס מספיקות לעמודות. לבסוף, השתמש בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוזי ה-DNA וה-RNA.

אגרוף PVN טיפוסי מניב כ-600 ננוגרם של DNA וכ-400 ננוגרם של RA בצד, כ-100 ננוגרם של RNA לניתוח ביטוי גנים על ידי PCR כמותי לפני הגברה על ידי סולפיט. טפל ב-200 ננוגרם של ה-DNA המבודד עם ערכה זמינה מסחרית להגברת ה-DNA מהאזורים שעברו מתילציה. הזמנת פריימרים שתוכננו במיוחד עבור DNA שהומר על ידי סולפיט עיצוב פריימר אופטימלי ב-bi PCR הוא חיוני מכיוון שהאיכות והספציפיות של אמפליקון ה-PCR קובעים את הצלחת השלבים הבאים.

כאשר הפריימרים מגיעים, קבעו את הטמפרטורה האופטימלית והכורעת שלהם באמצעות ניסויי פיילוט. השתמש בשני מיקרוליטרים של DNA שטופל ב-bis sulfite כתבנית לכל 25 מיקרוליטר. תערובת PCR.

הגבירו את התערובת החל מדנטורציה של שש דקות ב-95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 45 עד 50 מחזורי הגברה לפני התארכות אחרונה של חמש דקות ב-72 מעלות צלזיוס. נתח שבעה מיקרוליטרים של מוצר ה- PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוס כדי לאמת את גודל המגבר. טהר את מוצר ה-PCR הנותר לקשירה לאחר מכן באמצעות ערכת ניקוי PCR זמינה מסחרית.

אם מתקבלים מוצרי PCR לא רצויים, השתמש בטיהור ג'ל כדי לבודד את המוצר המעניין לפרוטוקול זה. נעשה שימוש בערכת שיבוט מסחרית. יעילות השיבוט תלויה באופן קריטי בתוספת.

אז אם מתקבלים שוב ושוב מספרים נמוכים של שיבוטים רקומביננטיים, נסה וקטור שיבוט אחר. הגדר תגובת קשירה של 10 מיקרוליטר עם מיקרוליטר אחד של וקטור ושלושה מיקרוליטר של מוצר PCR מנוקה. מערבבים את התגובה על ידי פיפטינג ודוגרים אותה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת.

נקה את תגובת הקשירה על ידי משקעי אתנול קלאסיים והפוך את החיידקים עם המוצר. הוסף מיליליטר אחד של מדיום SOB חם מראש מיד לאחר אספקת הדופק והעביר את החיידקים שעברו טרנספורמציה לצינור תגובה. לאחר התאוששות חיידקים במשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מורחים 100 מיקרוליטר מכל תרחיף על צלחת אמפיצילין LB מצופה IPTG.

Xal דוגרים על הצלחות למשך הלילה לאחר שניתן לקטוף מושבות. הגדר 25 תגובות PCR של מושבת מיקרוליטר בצלחת של 96 בארות באמצעות שלושה מיקרוליטרים של מגנזיום כלוריד 2.5 מילי-מולרי בכל תגובה. בחר שיבוטים לבנים חיוביים עם קצה פיפטה והעביר אותם לתערובת PCR עם טבילה פשוטה.

התחל את ה-PCR במחזור התכה של ארבע דקות. עקוב אחר זה עם 10 מחזורי הגברה עם טמפרטורת לינג של 56 מעלות צלזיוס. כל שלב במחזורים אלה הוא 30 שניות.

לאחר מכן הפחיתו את טמפרטורת האילינג ל-48 מעלות צלזיוס למשך 30 מחזורי הגברה נוספים. סיים במחזור התארכות של חמש דקות. כעת טען חמישה מיקרוליטר מכל מוצר על ג'ל ארוס וזהה תגובות המכילות את התוספת בגודל הנכון.

השתמש בערכה זמינה מסחרית כדי לנקות את מוצרי ה-PCR המעניינים כך שניתן יהיה לרצף אותם באמצעות ריצוף מחזור של סיומת צבע גדולה. בבארות עומס של 96 בארות עם שלושה מיקרוליטרים של תערובת מאסטר גדולה של תגובת DI, ואחריהם שני מיקרוליטרים של מוצר PCR מושבה מנוקה. הפעל את התגובה על תרמו-סייקלר החל מדקה אחת ב-96 מעלות צלזיוס, ואחריה 35 מחזורים של 10 שניות ב-96 מעלות צלזיוס, חמש שניות ב-50 מעלות צלזיוס וארבע דקות ב-60 מעלות צלזיוס.

לאחר סיום תגובת הקובייה הגדולה, נקה את התגובה באמצעות צלחת טיהור גדולה. לאחר השגת רצפים, נתח אותם באמצעות המנתח הגדול המקוון או הכלי B-I-S-M-A כדי לגזור את דפוס המתילציה של אזור ה-DNA שנחקר כדי לקבל תובנה לגבי ההשפעה של מתח מוקדם בחיים או ELS על ביטוי VP ומצב מתילציה. מקלות ועכברים שחורים C 57 עובדו על פי הפרוטוקול המתואר, הגרעין הפרה-חדרי והגרעין העל-אופטי נוקבו כדי לבודד DNA ו-R-N-A-D-N-A טופל בבי סולפיט, הוגבר עם פריימרים ספציפיים למשפר ה-VP ותוצרי ה-PCR שובטו ורצפו לפחות 20 שיבוטים רקומביננטיים מכל עכבר.

PCR נותחו כדי לקבוע את תדרי המתילציה עבור ה-CPGs הכלולים באמפליקון ה-PCR ברקמה מה-P-V-N-E-L-S גרמו להיפומתילציה משמעותית בארבעה מיקומים על משפר A VP, מה שמרמז על סימון אפיגנטי של אזור רגולטורי זה באמצעות חוויות חיים מוקדמות. בניגוד למתילציה של PVN של משפר A VP לא הושפעה מ-ELS ב-SON הממחיש את ספציפיות הרקמה של ההשפעה האפיגנטית בחיות ביקורת, מצב מתילציה של DNA ב-CPG 10 נמצא בקורלציה שלילית עם ביטוי גן VP המצביע על תפקיד של מתילציה של DNA בכוונון עדין של ביטוי גן VP. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בקלות שיטות אחרות כמו UPCR על ה-RNA המבודד על מנת לענות על שאלות נוספות כמו שינויים בביטוי גנים ברקמה המנותחת.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לחקור שינויים במתילציה של DNA בתגובה לגירויים סביבתיים או תלויים מנוסים.