ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ללמוד את פרופיל המתילציה הגלובלי ולזהות אזורים עשירים ב-CpG בעלי מתילציה דיפרנציאלית בחולי לוקמיה לימפוציטית כרונית באמצעות רצף דור הבא (next-generation sequencing). שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה, כגון זיהוי גנים בעלי חתימה פוטנציאלית הספציפית ל-CLL, פתוגנזה של המחלה ופרוגנוזה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת כיסוי מלא של מתילציית CpG ברחבי הגנום באופן בלתי מוטה ובאופן שאינו תלוי ב-PCR.

ראשית, השתמשו בערכה זמינה מסחרית להפקת DNA כדי לבודד DNA גנומי מדגימות של החולה ומדגימות תקינות של תאים חד גרעיים של דם פריפרי (PBMC), בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר כימות ה-DNA הגנומי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, דללו 5 מיקרוגרם של DNA גנומי מכל דגימה, לנפח סופי של 200 מיקרוליטר באמצעות באפר TE, כדי להגיע לריכוז סופי של 25 ננוגרם למיקרוליטר. לאחר מכן, בצעו סוניקציה בשפופרות ייעודיות, באמצעות סוניקטור, למשך סה"כ 30 מחזורים של 30 שניות פעילות ו-30 שניות מנוחה.

לאחר כל חמישה מחזורים, סובב קצרות את המבחנות כדי לרכז את הדגימות בתחתית. בדוק את טווח הסוניקציה עבור כל הדגימות באמצעות אלקטרופורזה של DNA כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. להכנת חרוזי הסטריפטאבידין המגנטיים, תחילה השהה אותם מחדש מהמבחנה של תמיסת המקור (stock) שסופקה עם הערכה.

שאיף והזרק בעדינות את החרוזים בעזרת פיפטה כדי לקבל תרחיף הומוגני. עבור כל דגימה של 5 µg DNA מומס, העבר 50 µL מהחרוזים לתוך מבחנות נקיות ומסומנות בנפח 1.5 mL. הוסף 50 µL של 1X bead wash buffer כדי להגיע לנפח סופי של 100 µL.

הניחו את המבחנות על מעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאפשר לכל החרוזיים המגנטיים להתרכז על הדופן הפנימית של המבחנה הפונה למגנט. הסירו את הנוזל בעזרת פיפטה של 200 µL, מבלי לגעת בחרוזיים. לאחר מכן, הסירו את המבחנות מהמעמד המגנטי, הוסיפו 250 µL של 1X bead wash buffer, וערבבו את החרוזיים בעדינות באמצעות פיפטה.

לאחר חזרה על שלבים אלו לפחות ארבע פעמים עבור כל הדגימות, השעו לבסוף את הדגימות ב-250 microliters של 1X bead wash buffer. שמרו את הדגימות על קרח. כדי לקשור את חלבון ה-MBD-biotin לחרוזים השטופים, הוסיפו תחילה 35 microliters של חלבון למבחנות נפרדות והביאו את הנפח הכולל ל-250 microliters באמצעות 1X bead wash buffer.

הוסיפו 250 µL של חלבון MBD מדולל ל-250 µL של חרוזים שטופים והשאירו אותם בסבב קצה-לקצה (end-to-end rotation) בטמפרטורת החדר. לאחר ערבוב החרוזים בחלבון למשך שעה אחת, שטפו את חרוזי הסטRepartitionסטבידין המגנטיים הקשורים לחלבון על ידי הנחת המבחנות על המעמד המגנטי למשך דקה אחת. הסירו את הנוזל באמצעות פיפטה מבלי לגעת בחרוזים.

לאחר מכן, הוסיפו 250 µL של 1X bead wash buffer והניחו את המבחנות על מיקסר סיבובי למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. חזרו על שלב השטיפה פעמיים נוספות לפני ריסוף מחדש של חרוזי ה-MBD-biotin השטופים ב-200 µL של 1X bead wash buffer, כדי להכין את החרוזים ללכידת DNA מתילated. במבחנה נקייה של 1.5 mL, נטולת DNase, הוסיפו 100 µL של bead wash buffer ו-180 µL של ה-genomic DNA המקטע.

השלם את הנפח הסופי ל-500 µL באמצעות מים נקיים מ-DNase. הוסף 380 µL של מים נקיים מ-DNase ל-20 L שנותרו מה-DNA הגנומי המגוזר. הקפא את הדגימות כדי לעבד אותן בהמשך ולהשתמש בהן כבקרות DNA קלט.

הניחו את המבחנות המכילות חרוזי MBD-biotin שטופים על מעמד מגנטי למשך דקה אחת, והספירו את הנוזל מבלי להסיט את החרוזים. לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של DNA גנומי מפורק המדולל בבופר שטיפת חרוזים. אטמו את כל המבחנות היטב באמצעות סרט פאראפין והשאירו אותן למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C על מעמד סיבוב קצה-לקצה במהירות של 8 עד 10 סל"ד.

לאחר תגובת הקישור בין ה-DNA לחרוזי ה-MBD, הנח את המבחנות על המעמד המגנטי למשך דקה אחת כדי לרכז את כל החרוזים על הדופן הפנימית של המבחנה. הסר את הנוזל העליון באמצעות פיפטה מבלי לגעת בחרוזים, ושמור את חלק ה-DNA שאינו קשור זה על קרח. לאחר מכן, הוסף 200 µL של 1X bead wash buffer לחרוזים והנח את המבחנות על מעמד מסובב למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הסרת הנוזל באמצעות המעמד המגנטי, חזרו על השטיפה פעמיים נוספות כדי להסיר את ה-DNA שאינו קשור שנותר. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 200 µL של בופר אלואציה בעל מלח גבוה המסופק בערכה כדי לבצע אלואציה ל-DNA. לאחר מכן, הניחו את המבחנות על המעמד המסתובב למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, הנח אותם על המעמד המגנטי למשך דקה אחת והשתמש בפיפט כדי להעביר בזהירות את העל-משקע לשפופרת נקייה חדשה בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 µL של באפר אלוציה עם ריכוז מלח גבוה לחרוזים, וחזור על פעולת האלוציה על ידי סיבוב השפופרות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות נוספות. הוסף את האלוואט השני לאותה שפופרת המכילה את 200 µL של האלוואט הראשון.

כדי להשקיע את ה-DNA, הוסיפו מיקרוליטר אחד של גליקוגן, 40 מיקרוליטר של נתרן אצטט בריכוז 3 מולארי, pH 5.2, ו-800 מיקרוליטר של אתנול מוחלט קר מאוד ל-400 מיקרוליטר של DNA שחולץ (eluted). הוסיפו את הרכיבים גם לדגימות הבקרה של ה-DNA הראשוני (input DNA control samples) בנפח של 400 מיקרוליטר שהוקפאו קודם לכן. ערבבו היטב את המבחנות באמצעות וורטקס לפני הדגרה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך הלילה.

ביום למחרת, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-12,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. השליכו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע. לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של 70% ethanol וערבבו את המבחנות בוורטקס.

לאחר צנטריפוגציה חוזרת של המבחנות באותם תנאים אך למשך 15 דקות, הסירו את העילאי בעזרת פיפט בזהירות. לאחר מכן, בצעו צנטריפוגציה למבחנות במהירות מקסימלית למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והסירו לחלוטין את שאריות האתנול בעזרת טיפ של פיפט. ייבשו את המשקע באוויר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לבסוף, הוסף 10 µL של מים נקיים מ-DNase לכדור ה-DNA לפני המעבר לכימות ה-DNA המתילטי, ריצוף MBD וניתוח כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הניתוח זיהה מספר אזורים עם היפר- והיפו-מתילציה דיפרנציאלית, שהיו מועשרים בדגימות CLL בהשוואה לבקרי נורמה. אזורים אלו בעלי מתילציה דיפרנציאלית מופו למחלקות שונות של גנים מקודדי חלבון וגנים לא מקודדים.

לבסוף, ניתוח הנתונים הראה חפיפה משמעותית בין האזורים בעלי מתילציה דיפרנציאלית הקשורים ל-CLL שהתקבלו משתי השוואות שונות של ביקורות נורמליות. כאן, כל אתרי ה-CpG הממוקמים באזורי מטרה של שני גנים בעלי מתילציה דיפרנציאלית תוקפו במספר רב של דגימות CLL באמצעות pyrosequencing. טווח הסוניקציה האופטימלי הנדרש לשיטה זו מוצג כאן.

טווח זה של DNA מfragmented הוא אידיאלי ומתאים יותר למטרות של רצף דור הבא (next-generation sequencing). ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך יומיים אם היא מבוצעת כה properly. בעת ביצוע פרוצדורה זו, הגורמים המכריעים המשפיעים על השחזור הסופי של ה-DNA הם האיכות וכמות ה-DNA הראשוני שנעשה בו שימוש, וכן הטווח של ה-DNA ה-fragmented לאחר סוניקציה.

החלטנו להשתמש בשיטה זו מכיוון שזהו מחקר המתילציה הגלובלי הראשון ב-CLL המבוסס על שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) להעשרת DNA מתילated המכסה את כל אזורי המתילציה ברחבי הגנום. להשלכות של טכניקה זו יש משמעות עבור הפרוגנוזה או הטיפול, שכן הגנים בעלי חתימת המתילציה השונה שזוהו עשויים לשמש כביומארקרים נורמליים גלובליים וכמטרות אפיגנטיות לטיפול. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש ב-DNA המתילated המועשר ליישומים המשכיים אחרים, כגון היברידיזציה או ביצוע מערכי מיקרו (microarrays), כדי להשוות בקלות את המטאלומים בין שתי דגימות או ישויות מחלה באמצעות סט קבוע של אתרי CpG המצויים במערכים.

לבסוף, זוהי טכניקה חסכונית לניתוח מספר רב של דגימות מטופלים כדי לזהות רצפים מתילתיים ברחבי הגנום, כולל רצפים מאו annotated המשתרעים על גבי גנים מקודדי חלבון, כמו גם רצפים שאינם annotated המשתרעים על גבי אלמנטים חוזרים ו-long non-coding RNAs.