Name: ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: למדו ניתוח מתילציה גנומית מקיפה באמצעות MBD-seq וצינור עיבוד נתונים חישובי בחולי לוקמיה לימפוציטית כרונית. השיטה מספקת כיסוי גלובלי ללא הטיה של אתרי CpG מתילציה לזיהוי ביומרקרים אפיגנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מועצת המחקר השוודי, האגודה השבדית לסרטן, קרן קנוט ואליס ולנברג (KAW), ו FU VästraGötalandsregionen.

<ol><li>Kanduri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genome-wide+array-based+methylation+profiles+in+prognostic+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 115 (2), 296-305 (2010).</li>
<li>Cahill, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((450K-array+analysis+of+chronic+lymphocytic+leukemia+cells+reveals+global+DNA+methylation+to+be+relatively+stable+over+time+and+similar+in+resting+and+proliferative+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments.</a> Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).</li>
<li>Kanduri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transcriptional+control+in+major+immunogenetic+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+exhibiting+subset-biased+global+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles.</a> Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).</li>
<li>Kulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+analysis+detects+widespread+gene-body+DNA+hypomethylation+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia.</a> Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).</li>
<li>Booth, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+sequencing+of+5-methylcytosine+and+5-hydroxymethylcytosine+at+single-base+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution.</a> Science. 336 (6083), 934-937 (2012).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-resolution+analysis+of+5-hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome.</a> Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).</li>
<li>Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+DNA+methylation+profiling+reveals+new+insights+into+epigenetically+deregulated+protein+coding+and+long+noncoding+RNAs+in+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL.</a> Clin Epigenetics. 8, 106(2016).</li>
<li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+a+report+from+the+International+Workshop+on+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+updating+the+National+Cancer+Institute-Working+Group+1996+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines.</a> Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).</li>
<li>De Meyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+evaluation+of+methyl+binding+domain+based+kits+for+enrichment+DNA-methylation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing.</a> PLoS One. 8 (3), e59068(2013).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2008-9-9-r137">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Subhash, S., Kanduri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneSCF%3A+a+real-time+based+functional+enrichment+tool+with+support+for+multiple+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms.</a> BMC Bioinformatics. 17 (1), 365(2016).</li>
<li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((featureCounts%3A+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Martinelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANGPT2+promoter+methylation+is+strongly+associated+with+gene+expression+and+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).</li>
<li>Kopparapu, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+miR-26A1+in+chronic+lymphocytic+leukemia+and+mantle+cell+lymphoma%3A+Impact+on+EZH2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression.</a> Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).</li>
<li>Robinson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+affinity-based+genome-wide+DNA+methylation+data%3A+effects+of+CpG+density%2C+amplification+bias%2C+and+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation.</a> Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

MBD-seq הוא חסכוני, immunoprecipitation מבוסס טכניקה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד דפוסי מתילציה עם כיסוי גנום רחב כולו. הן MeDIP seq (immunoprecipitation DNA methylated ואחריו רצף) ו- MBD-seq התוצאה העשרה של CpG עשיר DNA methylated. עם זאת, MBD-seq מראה זיקה יותר כלפי מחייב מאוד CpG עשירים אזורים בהשוואה ל MeDIP 19 . באמצעות ערכת העשרה של מתיל, ניתן לחלק את הדנ&quot;א לאזורים עשירים ב- CpG ו- CpG נמוך על-ידי השתלת DNA עם מאגרים של מלח גבוה ומלח נמוך, בהתאמה. ...

השימוש בטכניקות רצף הדור הבא לנתח פרופילים מתילציה דנ&quot;א גלובלי כבר יותר ויותר פופולרי בשנים האחרונות. גנום רחב מבחני מתילציה, כולל microarray- ולא מבוססי שיטות microarray, פותחו על בסיס הבאות: המרה bisulfite של DNA גנומי, מתילציה רגיש הגבלת אנזים עיכול, ואת immunoprecipitation של דנ&quot;א מתילציה באמצעות מתיל CpG ספציפי נוגדנים . מתילציה של דנ&quot;א סוטה היא אחד מסימני ההיכר של לוקמיה ולימפומות, לוקמיה לימפוציטית כוללנית (CLL). מוקדם יותר, כמה קבוצות, כולל שלנו מאופיינים פרופילים מתילציה DNA של קבוצות שונות CLL פרוגנוסטי נורמלי, בריא B- שולטת תאים באמצעות המרה bisulfite של DNA גנומי, ואחריו מיקרו מבוססי מערך שיטות או כל גנום רצף 1 , 2 , 3 , &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 4. המרה bisulfite של הדנ&quot;א הגנומי מוביל deamination של ציטוזינים ללא שינוי כדי uracil, עוזב את ציטוסינים methylated שונה בגנום. לאחר המרה, מצב מתילציה של ה- DNA יכול להיקבע על ידי הגברה PCR ו רצף בשיטות כמותיות או איכותיות שונות, כגון מיקרו מבוסס מערך מבוסס או כל הגנום bisulfite רצף (WGBS). למרות bisulfite שיטות מבוססות המרה יש יתרונות רבים נמצאים בשימוש נרחב סוגים שונים של סרטן לנתח את רמות מתילציה DNA, יש כמה חסרונות הקשורים בטכניקה זו. רצף WGBS מאפשר רזולוציה בסיסית עם זוג אחד עם כמויות נמוכות יותר של DNA והוא האפשרות המתאימה ביותר לניתוח מספר גדול של דגימות. עם זאת, שיטה זו אינה מבדילה את השינויים בין 5 mC ו 5 רמות hmc בגנום 5 , 6 . בנוסף, שיטות מבוססות microarray לא מציעים להשלים גיתר על המידה של הגנום. במחקר שנערך לאחרונה במעבדה שלנו 7 , שיטות immunoprecipitation מבוסס, ולא המרה bisulfite, שימשו לזהות מאוד CpG עשיר, דיפרנציאלי methylated אזורים בקנה מידה עולמי בחולים CLL ובריאים בריא שולט. Inmethyl-CpG- מחייב תחום (MBD) הדור הבא רצף (MBD-seq), העשרה של DNA מקוטעת כפול תקועים תלוי במידת מתילציה CpG. שיטה זו יכולה להתגבר על החסרונות של שיטת המרה bisulfite והוא יכול גם לספק כיסוי גנום רחב של מתילציה CpG בצורה בלתי משוחדת ו- PCR עצמאית. בנוסף, בניגוד לשיטות microarray המבוססות על המרה המבוססות על bisulfite, ניתן להשתמש ב- MBD-seq כדי לנתח את מצב המתילציה של אלמנטים חוזרים, כגון אלמנטים גרעיניים ארוכים (LINE), אלמנטים גרעיניים קצרים (SINE), חוזי מסוף ארוכים (LTRS) וכו &#39; . עם זאת, לעומת שיטות המרה bisulfite,פרוטוקול MBD-seq דורש כמות גדולה יחסית של קלט DNA. כמו כן, איכות רצף קורא את הנתונים תלויים הספציפיות, זיקה, ואיכות של נוגדנים בשימוש. המחקר הנוכחי מסביר פרוטוקול מפורט MBD-Seq להעשרת דנ&quot;א methylated עבור הדור הבא רצף. היא משתמשת methylated דנ&quot;א העשרה העשרה קיט (המפורטים בטבלה חומרים ), כמו גם צינור חישובית לדמיין ולפרש נתונים רצף מתילציה לזהות CLL ספציפיים היפר ו- hypomethylated אזורים לעומת בקרות בריאים נורמליים. ביסודו של דבר, שיטה זו עושה שימוש ביכולת של MBD של אינטראקציה חלבון MBD2 האדם עם CpG מתיל כדי לחלץ דנ&quot;א מועשר עם CpGs מתיל, וזה ואחריו רצף תפוקה גבוהה של DNA מתיל.

<table><tbody><tr><td>ערכת דם ורקמות</td><td>Dneasy Qaigen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת לימפורפ</td><td>A X I S-S H I E L D</td><td></td><td></td></tr> 1114544 <tr><td>ננו טיפה 2000</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE buffer pH 8</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סוניקציה סטנדרטי Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>TPX bioruptor tubes 1.5 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010010-300</td><td></td></tr><tr><td>3 M נתרן אצטט</td><td>דיאגנוד</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>E-gel iBase בטוח ערכת הדמיה משולבת</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G6465EU</td><td></td></tr><tr><td>E-gel 2% ג'ל אגרוז</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G441002</td><td></td></tr><tr><td>Methylminer ערכת העשרת DNA מתילציה</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>שייקר צינור Labquake / מסובבים</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>415110</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-S</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>VWR</td><td>12620-848</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>כל חברה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>כל חברה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA מים חינם</td><td>Milli Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משקע DNA (3M נתרן אצטט)</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>אטם בטוח 1.5 מ"ל צינורות אפנדורף</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0.5 מ"ל צינורות</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת Illumina Hiseq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water&nbsp; באת</td><td>' גרנט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חום</td><td>בלוק מענק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור מסובב</td><td>Labquake</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח מקיף מתילציה dna באמצעות methyl-cpg מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

תפקידם של RNAs ארוך noncoding (lncRNAs) בסרטן מגיע לחזית עקב העניין הגובר בהבנת הפונקציות המכניסטיות שלהם במהלך התפתחות סרטן התקדמות. למרות זאת, הרגולציה האפיגנטית העולמית של lncRNAs ורצפים חוזרים בסרטן לא נחקרה היטב, במיוחד בלוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL). מחקר זה מתמקד בגישה ייחודית: הלכידה המבוססת על immunoprecipitation של שברי דנ&quot;א דו-תקועים, מתילציה, באמצעות חלבונים מסוג Methyl-bond (MBD), ואחריהם רצף הדור הבא (MBD-seq). דגימות CLL המשתייכות לשתי קבוצות משנה פרוגנוסטיות (5 IGVH דגימות מוטציה + 5 IGVH דגימות unmutated) שימשו במחקר זה. ניתוח גילה 5,800 hypermethylated ו 12,570 hypomethylated CLL ספציפיים דיפרנציאלי methylated גנים (cllDMGs) לעומת בקרות בריא נורמלי. חשוב לציין, תוצאות אלה זיהו מספר CLL ספציפי, lncRNAs methylated דיפרנציאלי, מחדשאלמנטים חיוניים, וגנים המקודדים חלבונים בעלי ערך פרוגנוסטי פוטנציאלי. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מפורט עבור צינור MBD-seq ו bioinformatics שפותח עבור ניתוח מקיף של פרופילים מתילציה העולמי באזורים CpG עשיר מאוד באמצעות דגימות החולים CLL. לבסוף, גן מקודד חלבון ו- lncRNA אומתו באמצעות pyrosequencing, שהיא שיטה כמותית מאוד לנתח את רמות מתילציה CpG כדי לאשש את הממצאים מן הפרוטוקול MBD-seq.

MBD-seq בוצע לאחרונה על חולי CLL ומתאים, נורמלי, בריא שולטת לזהות CLL ספציפי דיפרנציאלי היפר ו- hypomethylated גנים 7 . הצינור הניסויי והביואינפורמאטי המשמש לניתוח הנתונים הנוצרים מדגימות CLL ודגימות בריאות תקינות מוצג באיור 1 א &#39; וב -1 ב&#39; . ניתוחים אלה זיהו מספר אזורי CLLDRRR ספציפיים של CLL (CllDMRs), אשר היו היפר / hypomethylated באופן משמעותי מ- IGHV- מוטציה ו- IGHV-...

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול רצף של methyl-cpG-bonding (MBD) של פרוטוקול רצף וציר חישובי, כדי לזהות אזורים עשירים ב- CpG באופן דיפרנציאלי בחולי לוקמיה כרונית של לימפוציטים (CLL).

ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ללמוד את פרופיל המתילציה הגלובלי ולזהות אזורים עשירים ב-CpG בעלי מתילציה דיפרנציאלית בחולי לוקמיה לימפוציטית כרונית באמצעות רצף דור הבא (next-generation sequencing). שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה, כגון זיהוי גנים בעלי חתימה פוטנציאלית הספציפית ל-CLL, פתוגנזה של המחלה ופרוגנוזה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת כיסוי מלא של מתילציית CpG ברחבי הגנום באופן בלתי מוטה ובאופן שאינו תלוי ב-PCR.ראשית, השתמשו בערכה זמינה מסחרית להפקת DNA כדי לבודד DNA גנומי מדגימות של החולה ומדגימות תקינות של תאים חד גרעיים של דם פריפרי (PBMC), בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר כימות ה-DNA הגנומי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, דללו 5 מיקרוגרם של DNA גנומי מכל דגימה, לנפח סופי של 200 מיקרוליטר באמצעות באפר TE, כדי להגיע לריכוז סופי של 25 ננוגרם למיקרוליטר. לאחר מכן, בצעו סוניקציה בשפופרות ייעודיות, באמצעות סוניקטור, למשך סה"כ 30 מחזורים של 30 שניות פעילות ו-30 שניות מנוחה.לאחר כל חמישה מחזורים, סובב קצרות את המבחנות כדי לרכז את הדגימות בתחתית. בדוק את טווח הסוניקציה עבור כל הדגימות באמצעות אלקטרופורזה של DNA כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. להכנת חרוזי הסטריפטאבידין המגנטיים, תחילה השהה אותם מחדש מהמבחנה של תמיסת המקור (stock) שסופקה עם הערכה.שאיף והזרק בעדינות את החרוזים בעזרת פיפטה כדי לקבל תרחיף הומוגני. עבור כל דגימה של 5 µg DNA מומס, העבר 50 µL מהחרוזים לתוך מבחנות נקיות ומסומנות בנפח 1.5 mL. הוסף 50 µL של 1X bead wash buffer כדי להגיע לנפח סופי של 100 µL.הניחו את המבחנות על מעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאפשר לכל החרוזיים המגנטיים להתרכז על הדופן הפנימית של המבחנה הפונה למגנט. הסירו את הנוזל בעזרת פיפטה של 200 µL, מבלי לגעת בחרוזיים. לאחר מכן, הסירו את המבחנות מהמעמד המגנטי, הוסיפו 250 µL של 1X bead wash buffer, וערבבו את החרוזיים בעדינות באמצעות פיפטה.לאחר חזרה על שלבים אלו לפחות ארבע פעמים עבור כל הדגימות, השעו לבסוף את הדגימות ב-250 microliters של 1X bead wash buffer. שמרו את הדגימות על קרח. כדי לקשור את חלבון ה-MBD-biotin לחרוזים השטופים, הוסיפו תחילה 35 microliters של חלבון למבחנות נפרדות והביאו את הנפח הכולל ל-250 microliters באמצעות 1X bead wash buffer.הוסיפו 250 µL של חלבון MBD מדולל ל-250 µL של חרוזים שטופים והשאירו אותם בסבב קצה-לקצה (end-to-end rotation) בטמפרטורת החדר. לאחר ערבוב החרוזים בחלבון למשך שעה אחת, שטפו את חרוזי הסטRepartitionסטבידין המגנטיים הקשורים לחלבון על ידי הנחת המבחנות על המעמד המגנטי למשך דקה אחת. הסירו את הנוזל באמצעות פיפטה מבלי לגעת בחרוזים.לאחר מכן, הוסיפו 250 µL של 1X bead wash buffer והניחו את המבחנות על מיקסר סיבובי למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. חזרו על שלב השטיפה פעמיים נוספות לפני ריסוף מחדש של חרוזי ה-MBD-biotin השטופים ב-200 µL של 1X bead wash buffer, כדי להכין את החרוזים ללכידת DNA מתילated. במבחנה נקייה של 1.5 mL, נטולת DNase, הוסיפו 100 µL של bead wash buffer ו-180 µL של ה-genomic DNA המקטע.השלם את הנפח הסופי ל-500 µL באמצעות מים נקיים מ-DNase. הוסף 380 µL של מים נקיים מ-DNase ל-20 L שנותרו מה-DNA הגנומי המגוזר. הקפא את הדגימות כדי לעבד אותן בהמשך ולהשתמש בהן כבקרות DNA קלט.הניחו את המבחנות המכילות חרוזי MBD-biotin שטופים על מעמד מגנטי למשך דקה אחת, והספירו את הנוזל מבלי להסיט את החרוזים. לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של DNA גנומי מפורק המדולל בבופר שטיפת חרוזים. אטמו את כל המבחנות היטב באמצעות סרט פאראפין והשאירו אותן למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C על מעמד סיבוב קצה-לקצה במהירות של 8 עד 10 סל"ד.לאחר תגובת הקישור בין ה-DNA לחרוזי ה-MBD, הנח את המבחנות על המעמד המגנטי למשך דקה אחת כדי לרכז את כל החרוזים על הדופן הפנימית של המבחנה. הסר את הנוזל העליון באמצעות פיפטה מבלי לגעת בחרוזים, ושמור את חלק ה-DNA שאינו קשור זה על קרח. לאחר מכן, הוסף 200 µL של 1X bead wash buffer לחרוזים והנח את המבחנות על מעמד מסובב למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הסרת הנוזל באמצעות המעמד המגנטי, חזרו על השטיפה פעמיים נוספות כדי להסיר את ה-DNA שאינו קשור שנותר. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו 200 µL של בופר אלואציה בעל מלח גבוה המסופק בערכה כדי לבצע אלואציה ל-DNA. לאחר מכן, הניחו את המבחנות על המעמד המסתובב למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, הנח אותם על המעמד המגנטי למשך דקה אחת והשתמש בפיפט כדי להעביר בזהירות את העל-משקע לשפופרת נקייה חדשה בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 µL של באפר אלוציה עם ריכוז מלח גבוה לחרוזים, וחזור על פעולת האלוציה על ידי סיבוב השפופרות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות נוספות. הוסף את האלוואט השני לאותה שפופרת המכילה את 200 µL של האלוואט הראשון.כדי להשקיע את ה-DNA, הוסיפו מיקרוליטר אחד של גליקוגן, 40 מיקרוליטר של נתרן אצטט בריכוז 3 מולארי, pH 5.2, ו-800 מיקרוליטר של אתנול מוחלט קר מאוד ל-400 מיקרוליטר של DNA שחולץ (eluted). הוסיפו את הרכיבים גם לדגימות הבקרה של ה-DNA הראשוני (input DNA control samples) בנפח של 400 מיקרוליטר שהוקפאו קודם לכן. ערבבו היטב את המבחנות באמצעות וורטקס לפני הדגרה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך הלילה.ביום למחרת, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-12,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. השליכו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע. לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של 70% ethanol וערבבו את המבחנות בוורטקס.לאחר צנטריפוגציה חוזרת של המבחנות באותם תנאים אך למשך 15 דקות, הסירו את העילאי בעזרת פיפט בזהירות. לאחר מכן, בצעו צנטריפוגציה למבחנות במהירות מקסימלית למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והסירו לחלוטין את שאריות האתנול בעזרת טיפ של פיפט. ייבשו את המשקע באוויר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לבסוף, הוסף 10 µL של מים נקיים מ-DNase לכדור ה-DNA לפני המעבר לכימות ה-DNA המתילטי, ריצוף MBD וניתוח כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הניתוח זיהה מספר אזורים עם היפר- והיפו-מתילציה דיפרנציאלית, שהיו מועשרים בדגימות CLL בהשוואה לבקרי נורמה. אזורים אלו בעלי מתילציה דיפרנציאלית מופו למחלקות שונות של גנים מקודדי חלבון וגנים לא מקודדים.לבסוף, ניתוח הנתונים הראה חפיפה משמעותית בין האזורים בעלי מתילציה דיפרנציאלית הקשורים ל-CLL שהתקבלו משתי השוואות שונות של ביקורות נורמליות. כאן, כל אתרי ה-CpG הממוקמים באזורי מטרה של שני גנים בעלי מתילציה דיפרנציאלית תוקפו במספר רב של דגימות CLL באמצעות pyrosequencing. טווח הסוניקציה האופטימלי הנדרש לשיטה זו מוצג כאן.טווח זה של DNA מfragmented הוא אידיאלי ומתאים יותר למטרות של רצף דור הבא (next-generation sequencing). ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך יומיים אם היא מבוצעת כה properly. בעת ביצוע פרוצדורה זו, הגורמים המכריעים המשפיעים על השחזור הסופי של ה-DNA הם האיכות וכמות ה-DNA הראשוני שנעשה בו שימוש, וכן הטווח של ה-DNA ה-fragmented לאחר סוניקציה.החלטנו להשתמש בשיטה זו מכיוון שזהו מחקר המתילציה הגלובלי הראשון ב-CLL המבוסס על שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) להעשרת DNA מתילated המכסה את כל אזורי המתילציה ברחבי הגנום. להשלכות של טכניקה זו יש משמעות עבור הפרוגנוזה או הטיפול, שכן הגנים בעלי חתימת המתילציה השונה שזוהו עשויים לשמש כביומארקרים נורמליים גלובליים וכמטרות אפיגנטיות לטיפול. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש ב-DNA המתילated המועשר ליישומים המשכיים אחרים, כגון היברידיזציה או ביצוע מערכי מיקרו (microarrays), כדי להשוות בקלות את המטאלומים בין שתי דגימות או ישויות מחלה באמצעות סט קבוע של אתרי CpG המצויים במערכים.לבסוף, זוהי טכניקה חסכונית לניתוח מספר רב של דגימות מטופלים כדי לזהות רצפים מתילתיים ברחבי הגנום, כולל רצפים מאו annotated המשתרעים על גבי גנים מקודדי חלבון, כמו גם רצפים שאינם annotated המשתרעים על גבי אלמנטים חוזרים ו-long non-coding RNAs.

comprehensive-dna-methylation-analysis-using-methyl-cpg-binding

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

תקן הזהב עבור ניתוח מתילציה DNA הוא רצף של דנ"א גנומי המרה bisulphite. שיטה זו מנצלת את רגישות מוגברת של ציטוזין, לעומת 5-methylcytosine (5-MEC) כדי bisulphite deamination בתנאים חומציים. Cytosines Unmethylated ניתן להבחין בין cytosines מפוגל לאחר הגברה PCR של הדנ"א הגנומי היעד.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

סרטון זה מדגים את טכניקת תגובת השרשרת של פולימראז טיפות מרובות לכימות סימולטני של אזורי DNA מתילציה באוכלוסיות תאי דם לבנים שונות כסמן ביולוגי מוקדם לאבחון קליני ופרוגנוזה.

תגובת שרשרת של Multiplex Droplet Polymerase לזיהוי מתילציה של DNA בלויקוציטים

ייצוג מופחת משופר ריצוף ביסולפיט הוא שיטה להכנת ספריות ריצוף לניתוח מתילציה של DNA המבוססת על עיכול אנזימי הגבלה בשילוב עם המרת ציטוזין ביסולפיט. פרוטוקול זה דורש 50 ננוגרם של חומר התחלתי ומניב נתוני רזולוציית זוגות בסיסים באזורים גנומיים עשירים ב-GC.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן.

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

חדשות שהתגלו מחמצנים צורות של 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxylcytosine (5caC) עשוי לייצג שינויים ברורים DNA עם תפקידים פונקציונליים ייחודיים. כאן מתוארת זרימת עבודה כמותית למחצה עבור ויזואליזציה של התפוצה המרחבית של oxi-mCs, פרופיל עוצמת האות ו colocalization.

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

המתואר כאן הוא השימוש בשיטה ספציפית הגברה בדיקה כדי לנתח את רמות המטלציה של האלמנטים קו 1 בתאי גזע mesenchymal שטופלו אוסטאוסרקומה נגזר שלפוחיות. בנוסף, הליך פופולרי עבור הפרדת שלפוחיות ושלפוחית של הפרה העובר סרום, הוא הפגינו גם.

קו 1 ניתוח מתילציה בתאי גזע מסנמצ'אל מטופלים עם אוסטאוסרקומה-מסחטות שלפוחיות

להלן, אנו מתארים הליך לניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול. ההליך רלוונטי למחקרים החוקרים קשרים בין דפוסי מתילציה של גנים וגורמים התורמים מסרטן בסרטן מערכת העיכול.

ניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול

סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תא דם לבן (WBC) תת-כמות באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA. פרוטוקול זה מציג שיטת תגובת שרשרת פולימראז טיפות טיפות כפוליות (mdPCR) באמצעות elastomer תרמופלסטי (TPE) מבוסס מיקרופלואידים התקן עבור יצירת droplet המאפשר דיוק ו- multiplex ספציפית מתילציה היעד כימות של ספירות דיפרנציאליות WBC.

מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR באמצעות התקן מחולל טיפות פולימר לאבחון המטולוגי

המחקר הנוכחי מתאר את זרימת העבודה לניהול נתוני מתילציה DNA המתקבלים על ידי טכנולוגיות microarray. הפרוטוקול מדגים שלבים מהכנה מדגמית לניתוח נתונים. כל ההליכים מתוארים בפירוט, והסרטון מציג את השלבים המשמעותיים.

הכנת מדגם לניתוח ביואינפורמטיקה של מתילציה DNA: אסטרטגיית האגודה להשמנת יתר ומחקרי תכונות נלוות

למדו ניתוח מתילציה גנומית מקיפה באמצעות MBD-seq וצינור עיבוד נתונים חישובי בחולי לוקמיה לימפוציטית כרונית. השיטה מספקת כיסוי גלובלי ללא הטיה של אתרי CpG מתילציה לזיהוי ביומרקרים אפיגנטיים.

ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

גלה סרטונים נוספים