ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור פרופיל מתילציה גלובלי ולזהות אזורים עשירים ב-CpG שעברו מתילציה דיפרנציאלית בחולי לוקמיה לימפוציטית כרונית באמצעות ריצוף מהדור הבא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה, כגון זיהוי הגנים החתימה הפוטנציאליים הספציפיים ל-CLL, פתוגנזה של מחלה, ופרוגנוזה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת כיסוי גנומי מלא של מתילציה של CpG בצורה בלתי משוחדת ובלתי תלויה ב-PCR.

כדי להתחיל, השתמש בערכת מיצוי DNA זמינה מסחרית כדי לבודד DNA גנומי מהמטופל ודגימות תאים חד-גרעיניים בדם היקפי רגיל על פי פרוטוקול היצרן. לאחר כימות ה-DNA הגנומי כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש לדלל 5 מיקרוגרם של DNA גנומי מכל דגימה, לסך של 200 מיקרוליטר באמצעות מאגר TE, ולתת ריכוז סופי של 25 ננוגרם למיקרוליטר. לאחר מכן, בצע סוניקציה בצינורות שתוכננו במיוחד, באמצעות סוניקטור, בסך הכל 30 מחזורים של 30 שניות הפעלה ו-30 שניות כיבוי.

לאחר כל חמישה מחזורים, סובב לזמן קצר את הצינורות כדי לאסוף את הדגימות לתחתית. בדוק את טווח הסוניקציה עבור כל הדגימות המשתמשות באלקטרופורזה של DNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להכין את חרוזי הסטרפטווידין המגנטיים, תחילה השעו אותם מחדש מצינור המלאי המסופק על ידי הערכה.

פיפטה בעדינות את החרוזים למעלה ולמטה לקבלת תרחיף הומוגני. עבור כל חמישה מיקרוגרם של דגימת DNA מקוטעת, הניחו 50 מיקרוליטר מהחרוזים בצינורות נפרדים, נקיים ומסומנים של 1.5 מיליליטר. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר שטיפת חרוזים 1X כדי להגיע לנפח סופי של 100 מיקרוליטר.

הנח את הצינורות על מעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאפשר לכל החרוזים המגנטיים להתרכז בדופן הפנימית של הצינור הפונה למגנט. הסר את הנוזל מבלי לגעת בחרוזים, בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר. לאחר מכן, הסר את הצינורות מהמעמד המגנטי, הוסף 250 מיקרוליטר של מאגר שטיפת חרוזים 1X וערבב את החרוזים בעדינות עם פיפטה.

לאחר חזרה על שלבים אלה לפחות ארבע פעמים עבור כל הדגימות, סוף סוף השעו מחדש את הדגימות ב-250 מיקרוליטר של מאגר שטיפת חרוזים 1X. שמור את הדגימות על קרח. כדי לקשור את חלבון ה-MBD-ביוטין לחרוזים השטופים, הוסף תחילה 35 מיקרוליטר חלבון לצינורות נפרדים והביא את הנפח הכולל עד 250 מיקרוליטר באמצעות מאגר שטיפת חרוזים 1X.

הוסף 250 מיקרוליטר של חלבון MBD מדולל ל-250 מיקרוליטר של חרוזים שטופים והשאיר אותם בסיבוב מקצה לקצה בטמפרטורת החדר. לאחר ערבוב החרוזים בחלבון למשך שעה, שטפו את חרוזי הסטרפטווידין המגנטיים הקשורים לחלבון על ידי הנחת הצינורות על המעמד המגנטי למשך דקה אחת. הסר את הנוזל מבלי לגעת בחרוזים באמצעות פיפטה.

לאחר מכן, הוסיפו 250 מיקרוליטר של מאגר שטיפת חרוזים 1X והניחו את הצינורות על מערבל סיבוב למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב הכביסה פעמיים נוספות לפני השעיה מחדש של חרוזי ה-MBD-ביוטין השטופים ב-200 מיקרוליטר של מאגר שטיפת חרוזים 1X, מה שהופך את החרוזים מוכנים ללכידת DNA מתילית. בצינור נקי של 1.5 מיליליטר ללא DNase, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר שטיפת חרוזים מיליליטר ו -180 מיקרוליטר מה- DNA הגנומי המקוטע.

הביאו את הנפח הסופי ל-500 מיקרוליטר באמצעות מים ללא DNase. הוסף 380 מיקרוליטר של מים נטולי DNase ל-20 הליטרים הנותרים של ה-DNA הגנומי המקוטע. הקפיאו את הדגימות כדי לעבד אותן מאוחר יותר ולהשתמש בהן כבקרות DNA קלט.

הניחו את הצינורות המכילים חרוזי MBD-ביוטין שטופים על מעמד מגנטי למשך דקה אחת, והוציאו את הנוזל מבלי להפריע לחרוזים. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של DNA גנומי מקוטע מדולל במאגר שטיפת חרוזים. אוטמים היטב את כל הצינורות עם סרט פרפין ומשאירים אותם למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס על מעמד סיבוב מקצה לקצה ב 8 עד 10 סיבובים לדקה.

לאחר תגובת קשירת חרוזי הדנ"א וה-MBD, הניחו את הצינורות על המדף המגנטי למשך דקה אחת כדי לרכז את כל החרוזים על הדופן הפנימית של הצינור. הסר את נוזל ה-supernatant עם פיפטה מבלי לגעת בחרוזים, ושמור את חלק דגימת ה-DNA הלא קשור הזה על קרח. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר שטיפת חרוזים 1X לחרוזים והנח את הצינורות על המעמד המסתובב למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הסרת הנוזל באמצעות המעמד המגנטי, חזור על הכביסה פעמיים נוספות כדי להסיר את שאריות ה-DNA הלא קשור. לאחר הכביסה הסופית, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר פליטת מלח גבוה המסופק בערכה כדי לסלק את ה-DNA. לאחר מכן, הנח את הצינורות על המעמד המסתובב למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, הניחו אותם על המעמד המגנטי למשך דקה אחת והשתמשו בפיפטה כדי להעביר בזהירות את הסופרנטנט לצינור חדש ונקי של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף לחרוזים 200 מיקרוליטר של מאגר פליטה עתיר מלח, וחזור על הפליטה על ידי סיבוב הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות נוספות. הוסף את האלוט השני לאותו צינור המכיל את 200 המיקרוליטרים של האלוטה הראשונה.

כדי לזרז את ה-DNA, הוסף מיקרוליטר אחד של גליקוגן, 40 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי, pH 5.2 ו-800 מיקרוליטר של אתנול מוחלט קר כקרח ל-400 מיקרוליטר של DNA מופלט. הוסף גם את הריאגנטים ל-400 מיקרוליטר שהוקפאו בעבר של דגימות בקרת DNA קלט. מערבבים היטב את הצינורות על ידי מערבולת לפני הדגירה שלהם במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, צנטריפוגה את הצינורות ב 12, 000 פעמים גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. השליכו את הסופרנטנט בזהירות מבלי להפריע לגלולה. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של אתנול 70% ומערבל את הצינורות.

לאחר צנטריפוגה שוב של הצינורות באותם תנאים אך למשך 15 דקות, הסר את הסופרנטנט על ידי שימוש בזהירות בפיפטה. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות במהירות מקסימלית למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והסר את שאריות האתנול לחלוטין באמצעות קצה פיפטה. יבש את הגלולה באוויר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לבסוף, הוסף 10 מיקרוליטר של מים נטולי DNase לגלולת ה-DNA לפני שתמשיך לכימות ה-DNA המתילי, ריצוף MBD וניתוח כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הניתוח זיהה מספר אזורים היפר-והיפומתילציה דיפרנציאלית המועשרים בדגימות CLL בהשוואה לבקרות רגילות. אזורים אלה שעברו מתילציה דיפרנציאלית מופו לסוגים שונים של גנים מקודדי חלבון ולא מקודדים.

לבסוף, ניתוח הנתונים הראה חפיפה משמעותית בין האזורים הקשורים למתילציה דיפרנציאלית הקשורים ל-CLL שהתקבלו משתי השוואות בקרה נורמליות שונות. כאן, כל אתרי ה-CpG הממוקמים באזורי יעד של שני גנים שעברו מתילציה דיפרנציאלית אומתו במספר רב של דגימות CLL באמצעות pyrosequencing. טווח הסוניקציה האופטימלי הנדרש לשיטה זו מתואר כאן.

טווח זה של DNA מקוטע הוא אידיאלי ומתאים יותר למטרות ריצוף של הדור הבא. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא נעשית כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, הגורמים המכריעים המשפיעים על שחזור ה-DNA הסופי הם איכות וכמות ה-DNA הקלט המשמש וטווח ה-DNA המקוטע לאחר סוניקציה.

החלטנו להשתמש בשיטה זו מכיוון שזהו מחקר המתילציה העולמי הראשון של CLL המבוסס על המשקעים החיסוניים להעשרת DNA שעבר מתילציה המכסה את כל האזורים המתילציה ברחבי הגנום. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון פרוגנוזה או טיפול מכיוון שגנים החתימה שזוהו במתילציה דיפרנציאלית יכולים לשמש כסמנים ביולוגיים נורמליים גלובליים ומטרות אפיגנטיות לטיפול. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש ב-DNA המתילי המועשר ליישומים אחרים במורד הזרם כמו הכלאה או ביצוע מיקרו-מערכים כדי להשוות בקלות את המתכות בין שתי דגימות או ישויות מחלה באמצעות קבוצה קבועה של אתרי CpG הקיימים במערכים.

לבסוף, זוהי טכניקה חסכונית לניתוח מספר רב של דגימות מטופלים עבור רצפים שעברו מתילציה על פני הגנום, כולל רצפים מבוארים המשתרעים על פני גנים מקודדי חלבון וכן רצפים לא מבוארים המשתרעים על פני אלמנטים חוזרים ו-RNA ארוכים שאינם מקודדים.