התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic

המטרה הכוללת של נוהל זה היא להעריך את מצב מתילציית ה-DNA של KCNJ 10 באוכלוסייה מועשרת של אסטרוציטים, ולבצע קורלציה בין שינויים במתילציית ה-DNA של הפרומוטור לבין פעילות שעתוקית אופציונלית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד של אוכלוסייה מועשרת של אסטרוציטים קורטיקליים ממוח של מכרסם באמצעות מיון FACS, ולאחר מכן בידוד DNA מהאוכלוסייה המועשרת של האסטרוציטים. לאחר מכן, מצב מתילציית ה-DNA של KCNJ 10 מוערך באמצעות אנליזת המסת ברזולוציה גבוהה הרגישה למתילציה (MS.HRMA).

לבסוף, מקדם KCNJ 10 הוא בעל מתילציה גבוהה (hypermethylated), ובדיקת לוסיפראז משמשת לקשר בין שינויים במתילציית ה-DNA של המקדם לבין הפעילות התעתוקית. בסופו של דבר, MS-HRMA ובדיקת הלוסיפראז משמשות למדידת מצב מתילציית ה-DNA של KCNJ 10 ולקשירת שינויים במתילציית המקדם לפעילות התעתוקית של הגן. הפרוצדורה תוצג במהלך הסרטון. פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי ביצע את הניסוי; כל בעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות של המכוניים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health), והשימוש בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה לטיפול ובחשיפה בבעלי חיים באוניברסיטת אלבמה בברמינגהאם.

כל הבאפרים והריאגנטים הוכנו בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר הפקת הקורטקס מהראש של בעל חיים שהורדם והומת, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש לחתוך או לקדוח באמצעות דרמל חור בחלקו העליון של מבחנה קונית בנפח 50 milliliter כדי לאפשר את הכנסת הצינוריות אל תוך המבחנה. לאחר מכן, יש להוסיף למבחנה תמיסת papin.

הניחו את הקורטקסים המבודדים בצלחת תרבית של 10 מילימטרים המכילה תוך מפיקה (dissociation medium) המאוזנת ל-95% O2 ו-5% CO2, והשתמשו בלהב תער נקי כדי לקצוץ את הרקמה לחתיכות של מילימטר רבוע אחת. באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר, העבירו את הרקמה לשפופרת של 50 מיליליטר המכילה את תמיסת הפפאין. המתינו עד שהרקמה תשקע לתחתית פיפטת ההעברה לפני השחרורה.

כדי למזער את כמות תמיסת הדיסוציאציה שמועברת ללא ביצוע בועיות (bubbling) לתמיסת הפפאין, יש להחיל זרימה קבועה של 95%O2 ו-5%CO2 באמצעות חילוף גזים על פני השטח, תוך דגירה במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, השתמש בפניפטה של 10 ml כדי לטלטל בעדינות את הרקמה 10 פעמים; סבב במערכת צנטריפוגה את תסחין התאים העכור במהירות של 300 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש להביא את תמיסת מעכב האלבומין של ה-DNA לשיווי משקל באמצעות חילוף גזים על פני השטח, ולסספנד מחדש את משקע התאים בשלושה מיליליטר (3 ml) מהתמיסה.

לאחר מכן, הכין מדרג צפיפות לא רציף מסחרי בהתאם להוראות היצרן. סבב את מדרג הצפיפות הלא רציף ב-70 G למשך שש דקות. לאחר מכן, בדול את התאים המופרדים מתחתית המבחנה באמצעות פיפט לשאיבת המדיום.

השתמשו בשניים עד שלושה מיליליטרים של DPBS עם 0.02% bovine serum albumin ומיליגרם אחד למיליליטר של DNA או במצע מ preferred media. כדי להשתמש מחדש, השעו את התאים המופרדים. העבירו את התאים דרך מסנן של 40 microgram לפני ביצוע מיון תאים ומיצוי DNA או RNA בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

לאחר תכנון פריימרים נגד רצף DNA שעבר המרה בביסולפיט והגברה של ה-DNA לפי הפרוטוקול הכתוב, המירו בביסולפיט 500 עד 1000 nanograms של DNA מכל דגימה וסטנדרטים של DNA מתילציה בטווח שבין 0% ל-100% מאותו מין בעל חיים, תוך שימוש ב-DNA polymerase מועדף ובפריימרים בריכוז 5 µM. הגדירו תגובות בנפח 20 µL להגברת Ms HRM. בהתאם לטבלה זו, הרצו את כל הדגימות, כולל DNA של ביקורת (fax) וסטנדרטים של מתילציה, בשלוש חזרות; בהתאם לתוכנת הניתוח, הגדירו פרמטרים של התחלה וסיום (start and stop) לפני ואחרי המעברים של עקומת ההמסה (melt curve).

הגדירו את הפרמטרים של התחלת ההמסה המוקדמת (prem melt start) וסיום ההמסה המוקדמת (prem melt stop), כך שההפרש ביניהם יהיה 0.2 עד 0.5 °C. הגדירו באופן דומה את נקודות ההתחלה והסיום של ההמסה המאוחרת (post melt), והפיקו נתונים של הפרשי טמפרטורת השיא עבור כל דגימה באמצעות סטנדרטים של אחוזי מתילציה והפרשי טמפרטורות השיא המתאימים להם.

צור משוואת רגרסיה ליניארית. השתמש במשוואת רגרסיה ליניארית זו כדי להעריך את מצב המתילציה של דגימות לא ידועות, לאחר זיהוי איים של CpG בעלי עניין והגברה ושבט של פלסמיד של אי CpG Luke two בהתאם לפרוטוקול הכתוב. השתמש בתוכנת preferred cutter כדי לאמת את האתרים לעיכור רסטריקציה כדי למנוע חיתוכים כפולים, והפוך לליניארי 30 micrograms של פלסמיד לאחר שהדגימה עוכרה עם האנזימים המתאימים.

בצעו אינאקטיבציה תרמית של האנזימים בטמפרטורה ובמשך הזמן המתאימים בתגובות של 50 µL. השתמשו בחמש יחידות של CPG methylate לצורך מתילציה של 700 µg של פלסמידים ליניאריים בטמפרטורה של 30 °C למשך 13 עד 19 שעות.

לאחר ניקוי ה-DNA כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב, בצעו עיכול עם האנזים HPA II על דגימות של 1 µg של DNA מתילטורי על ידי דגירה ב-37 °C למשך שעה אחת. לאחר ניקוי ה-DNA, הריצו את הדגימות על ג'ל אגרוז של 1% ל-DNA במתח של 100 V למשך 45 דקות לצורך ויזואליזציה. לאחר מכן, העבירו פלסמידים מתילטוריים ולא מתילטוריים לעיכול כפול עם אנזימי הגבלה מתאימים למשך הלילה כדי לשחרר את וקטור Luke 2 באורכו המלא ואת פרגמנטים של CpG islands.

בצעו אינאקטיבציה תרמית לאנזימים לאחר העיכול. הריצו את דגימות העיכול הכפול על ג'ל אגרוז 1% DNA במתח של 100 וולט למשך שעה אחת כדי להפריד בין הווקטור למקטע המוכנס (insert); לאחר מכן, בעודכם לובשים מיגון מפני קרינת UV, הניחו את הג'ל תחת אור שחור ובאמצעות להבים כירורגיים נקיים, גזרו את המקטעים הממותילים והבלתי ממותילים. לאחר מיצוי ה-DNA מהג'ל בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו ב-T four DNA Ligase וביחס של 1:4 בין הווקטור למקטע המוכנס כדי ללגט את המקטעים הממותילים והבלתי ממותילים אל תוך ווקטור שאינו ממותיל. לאחר הליגציה, דגרו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס או על קרח למשך הלילה.

נקו את ה-DNA ואמתו את הליגציה מחדש על ידי הרצת דגימות על ג'ל agarose של 1% DNA, והעריכו את ריכוז הפלסמיד שעבר ליגציה מחדש. זרעו תאי CD 54 בצלחת 12 בארות בריכוז של 140,000 תאים לבערה. לאחר 24 שעות, השתמשו בריאגנט טרנספקציה מסחרי כדי לבצע טרנספקציה לתאים בריכוזים שווים של פלסמיד CpG loop 2 שאינו מתיל, בתוספת RAN vanilla או וקטור לוסיפרול שולט אחר, או פלסמיד CpG loop 2 מתיל בתוספת ELLA או וקטור לוסיפרול שולט אחר. המתינו 24 שעות לסיום הטרנספקציה של התאים לפני ביצוע בדיקת לוסיפרול.

בהתאם להוראות היצרן, השתמשו במדי-לומינסנציה (luminometer) לקריאה של כל באר בשלוש חזרות. חשבו את היחס בין הפעילות של לוסיפראז של גחליליות לבין רנבנילה או בקרָה אחרת של פעילות לוסיפראז.

נרמלו את הפעילות של הלוסיפראז של חגב-השדה (firefly) המתילת אל מול הפעילות של הלוסיפראז של חגב-השדה שאינה מתילת, על ידי חלוקת הפעילות המתילת בפעילות הלוסיפראז המתילת. כפי שמוצג כאן, אוכלוסייה מועשירה של אסטרוציטים הושגה באמצעות מיון FACS של בעלי חיים טרנסגניים מסוג E-G-F-P-S 100 beta. אוכלוסייה מוגדרת (gated) נבחרה על בסיס פיזור קדמי וצדי, ואוכלוסיית תאים חיים נקבעה באמצעות אינדיקטור לברומיד לתאים מתים; התמונות המוצגות כאן הן תמונות מייצגות של אסטרוציטים חיוביים ל-EGFP לאחר הדיסוציאציה, אך לפני המיון וכן לאחר המיון. דמות זו מראה אוכלוסייה מבודדת של תאים חיוביים ל-EGFP שהראתה עלייה של 40 מדרגות ב-mRNA עבור הסמן הספציפי לאסטרוציטים.

LDH 1 L 1. בנוסף, למרות ביטוי משותף של S 100 beta ו-NG2 בתאי OPCs ואסטרוציטים חיוביים, נצפתה הפחתה פי ארבעה ב-mRNA של NG2, סמן לתאי אב של אוליגודנדרוציטים, המעידה על בידוד של אוכלוסיית תאים אסטרוציטית מועשרת. טבלה זו מרכזת את סך ה-RNA וה-DNA, שבודדו מבעלי גילים ומספר חיות משתנים, והיא מובאת כייחוס לתשואה הצפויה של מולקולות מולקולריות לאחר העובדות.

לבסוף, נעשה שימוש במבחן לוציפרז כפול (dual luciferase assay) כדי להעריך את הפעילות השעתוקית של אזורים עם היפר-מתילציה בגן הנחקר, לאחר העברת המקטע המתומתיל לווקטור שאינו מתומתיל. אנזים HPA II, המעכל אך ורק DNA שאינו מתומתיל, שימש לאימות מצב המתילציה של הפלסמיד. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים אוכלוסייה מועשרת של אסטרוציטים באמצעות FACS, וכן כיצד למדוד מתילציית DNA של גן ולהקיש על קשר בין שינויים במתילציית ה-DNA של הפרומוטור לבין הפעילות השעתוקית, באמצעות אנליזת HRM (high resolution melt) רגישה למתילציה ומבחן לוציפרז, בהתאמה.