Name: התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic KCNJ10 (Kir4.1) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: למדו להעריך את מצב המתילציה של DNA בגן KCNJ10 באסטרוציטים באמצעות MS.HRMA ומבחן לוציפראז. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לקשר שינויים במתילציה לפעילות תעתיקית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי R01NS075062-01A1. מיון FACS בוצע במתקן UAB Comprehensive Flow Cytometry Core (P30 AR048311, P30 A1027767). ד"ר סקוט פיליפס ממתקן הליבה לנוירוביולוגיה של UAB וד"ר סוזן נוזל מ-UAB CDIB סייעו בהיבטים הטכניים של בדיקת הלוציפראז.

כל בעלי החיים טופלו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות הנחיות. ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש באוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם אישרה שימוש בבעלי חיים. 1. קבלת רנ&quot;א ודנ&quot;א ממועשרת astrocytic אוכלוסייה באמצעות Cell הופעל פלורסנט מיון (FACS) של האסטרוציטים מרקמות המוח כולו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים שקט ורגוע עם CO 2 דקות 1 ולאחר מכן במהירות לערוף. לנתח הקורטקס כמתואר באל אלבוקרקי et, 26.; אין צורך להסיר את קרומי המוח. הערה: חולדות מהונדסות מבטא eGFP תחת S100β (סמן astrocyte) אמרגן נוצרו על ידי Itakura et al 27 ומנוצלות למיון FACS של האסטרוציטים.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן homogenate המוח כולו באמצעות ערכת ניתוק פפאין בתנאים שאינם סטרילי על פי הפרוטוקול של היצרן. חום להפעיל פפאין על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות. הערה:פתרון פפאין מסופק על ידי יצרן ומכיל L-ציסטאין וEDTA (ראה טבלה של חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך או DREMEL חור בחלק העליון של צינור חרוטי 50 מיליליטר כדי לאפשר צינורות ביצוע 95% O 2: 5% CO 2 להיות מוזנים לתוך צינור חרוטי סגור (איור 1 א). הנח הקורטקס גזור בצלחת תרבות 10mm המכיל תקשורת דיסוציאציה (ממ בתוספת גלוקוז 20mm ופניצילין / סטרפטומיצין (500 U / ml) וequilibrated לO 95% 2: 5% CO 2) ולהשתמש בסכין גילוח נקי לברר ברקמה לתוך 1 x 1 מ&quot;מ 2 חתיכות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת העברה באמצעות 10 מיליליטר pipetman הידני לצינור חרוטי 50 מיליליטר מכיל פתרון פפאין. לאפשר לרקמות להתיישב לתחתית פיפטה העברה לפני הפריקה כדי למזער את הכמות של תקשורת ניתוק בוצעה על. שמור פתרון פפאין equilibrated עד 95% O 2: 5% CO 2 באמצעות חילוף גזי משטח למשך הדגירה. האם לא soluti פפאין בועהעל. דגירה רקמה למשך 20 דקות ב -37 ° C אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגירה הבאה בפתרון פפאין, רקמת triturate 10 פעמים עם פיפטה 10 מיליליטר העברה במהירות איטית. השעיה תא מעונן צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות ב RT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן פתרון DNase / אלבומין מעכב (המסופק על ידי יצרן) באמצעות חילוף גזי משטח מחדש להשעות תאי טבליות ב 3 מיליליטר של פתרון / מעכב אלבומין DNase. הכן שיפוע צפיפות רציפה מסחרי בהתאם להוראות יצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין שיפוע צפיפות רציף XG ב 1000 במשך 6 דקות. בודד תאים ניתק מהחלק התחתון של צינור על ידי מציצת גלולה תחתונה בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש תאים ניתק ב2-3 מיליליטר של DPBS עם 0.02% אלבומין בסרום שור ו1 מ&quot;ג / מיליליטר DNase או HEPES העדיף שנאגרו תקשורת והתרבות. עובר דרך 40 מיקרומטר סינון לפני FACS (איור 2 א). שמור את התאים על קרח עד מיון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע FACS 28. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה ב 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הערה: יכולים להיות מנוצלים האסטרוציטים pelleted מייד או נשמרו ב-80 ° C עד מיצוי DNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ RNA ו- DNA בשיטת בידוד מועדף 29 30. להעריך RNA וריכוז ה- DNA ואיכות באמצעות ספקטרופוטומטר וbioanalyzer 31. הערה: לנצל רק RNA באיכות גבוהה וDNA בשלבים הבאים, 260/280 = 2.0-2.2 ו1.8-1.9, בהתאמה. ניתוח bioanalyzer הוא חיוני כדי להעריך לשפלת RNA או פיצול ה- DNA. RNA או DNA יכול להיות מנוצל באופן מיידי או מאוחסן ב-80 ° C או -20 ° C, בהתאמה ללימודים שלאחר מכן. </li></ol> 2. הערכת מצב DNA מתילציה של גן באמצעות מתילציה רגישה רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח (MS-HRMA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את רצף גן של עניין לתוכנת מיפוי מתילציה המקוון העדיפה לזהות כל איי CPG בגןעניין 32. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים עיצוב נגד bisulfite המירו רצף ה- DNA 33 ולהגביר באמצעות DNA פולימרז המועדף על פי הפרוטוקול של היצרן. ודא גודל מוצר מוגבר על ידי פועל 1% ג&#39;ל DNA agarose ב 100 V 45 דקות. פריימרים חנות בריכוז מניות של 20 מיקרומטר ב-20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסולפיט להמיר 500-1,000 ng של DNA של כל דגימת DNA והמפוגל סטנדרטים החל 0-100% מאותו המין של בעלי החיים 34. דגימות Elute לספק ריכוז של 20 ng / μl. ודא ריכוז של ה- DNA המרה bisulfite באמצעות ספקטרופוטומטר 31. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 תגובות μl התקנה להגברת MS-HRM באמצעות DNA פולימרז מועדף ופריימרים בריכוז 5 מיקרומטר לפי טבלת 1 ו -2. הפעילו את כל הדגימות, לרבות תקני ה- DNA ומפוגלים FACS, בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לתוכנת ניתוח, שנקבע לפני ואחרי להתחיל ולהפסיק פרמטריםסביב המעברים של עקום להמיס. התחלה שנקבע מראש להמיס ופרמטרי תחנה מראש להמיס כל כך ההבדל בין השניים הוא 0.2-0.5 מעלות צלזיוס. הגדר תחילת פוסט-להמיס ופוסט-להמיס להפסיק באופן דומה. לחלץ נתונים הבדל טמפרטורת שיא עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתקני אחוזים מפוגלים (y-ערך) והבדלים ביניהם המקבילים ממוצע טמפרטורת שיא (x-ערך) ליצור משוואת רגרסיה ליניארית (איור 3 א-B, שולחן 3-4). השתמש במשוואת רגרסיה ליניארית זה להעריך מצב מתילציה של דגימות ידועות 35. </li></ol> 3. הערכת פעילות יזם מפוגל-Hyper באמצעות השימוש בAssay בלוציפראז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות איי CPG של גן המטרה (שלב 2.1). PCR להגביר אזורים של עניין 36 וכפיל במעלה הזרם של גן הכתב בלוציפראז luc2 Firefly לייצר פלסמידים CPG-אי-luc2 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize 30 מיקרוגרם של פלסמיד CPG-אי-luc2 באמצעות הגבלהעיכול אנזים 38. ודאו אתרים להגבלה לעכל ולהימנע מקיצוצים כפולים באמצעות תוכנה חותך מועדף 38. חום להשבית אנזימים בטמפרטורה מתאימה ומשך הבא עיכול על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסד מינימאלי של DNA מתרחש במהלך שלב linearization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמידים Methylate לינארית באמצעות O methylase CPG (M.Sssl) / N על 30 מעלות צלזיוס או להשאיר פרוטוקול היצרן הבא שלא טופל למעט ההתאמות הבאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 50 תגובות μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5 יחידות של methylase CPG לmethylate 700 ננוגרם של פלסמיד לינארית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תגובות O / N ל13-19 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות תגובת methylase CPG, לבצע ניקוי DNA באמצעות סטנדרטי, מסחרי קרום סיליקה ג&#39;ל זמין לנקות ערכה על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסדים משמעותיים של ה- DNA להתרחש בעקבות תגובת methylase CPG, 30-60% הפסד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא מתילציה של פלסמידים באמצעות הגבלת HPA השני לעכל. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 מיקרוגרם של ה- DNA מפוגל או שאינו מפוגל והגבלה לעכל עם HPA השני עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. השתמש 5-10 יחידות של HPA השני עבור כל ה- DNA מיקרוגרם. בעקבות עיכול HPA השני, לבצע ניקוי DNA באמצעות ערכה לנקות מועדפת, קרום סיליקה ג&#39;ל זמין מסחרי. להפעיל את שני פלסמידים מפוגלים ואינם מפוגלים CPG על 1% ג&#39;ל DNA agarose במאגר טה או TBE ב 100 V 45 דקות להדמיה (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמידים נושא שני מפוגלים ו- מפוגלים שאינו לעיכול כפול עם אנזימי הגבלה מתאימים לשחרר באורך מלא לוק 2 (וקטור) ואי CPG (להוסיף) שברי 38. בצע O הכפול העיכול / N בטמפרטורה מתאימה ואנזימי חום להשבית הבא עיכול על פי הפרוטוקול של היצרן. הפסד מינימאלי של ריכוז ה- DNA מתרחש במהלך הגבלה כפולה לעכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל פלסמידים כפולים מתעכלים על 1% ג&#39;ל agarose DNA ב 100 V עבור שעה 1 כדי לאפשר הפרדה oוקטור f והכנס (איור 4C). זהירות. לובש מגן מגן פנים UV, למקם ג&#39;ל DNA באור שחור שולחן לדמיין להקות. בהתבסס על גודל, הוספה מפוגל ואינו מפוגל בלו ווקטור שאינו מפוגל באמצעות להב כירורגים נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA תמצית ג&#39;ל באמצעות פנול רווי, pH 6.6. בקצרה, שוקל ג&#39;ל DNA המכיל וקטור או להוסיף. שימוש בפנול 100 μl ל0.1 גרם של ג&#39;ל DNA. Homogenize ג&#39;ל DNA בפנול באמצעות homogenizer dounce הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כלורופורם (באמצעות 1/5 של פנול נפח) ולנער דגימות במשך 20 שניות. דגירה דגימות ב RT במשך 2-3 דקות. צנטריפוגה במשך 15 דקות במהירות מקסימלית (16.1 x 1,000 XG) על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תמיסה מימית ולהוסיף 0.1X נפח של נתרן אצטט 3 M ו2.5x נפח של אתנול. דגירה דגימות עבור שעה 1 ב -80 ° C. לאחר דגירה, להסיר אתנול מחדש להשעות DNA ב -30 μl של חיץ מועדף. אובדן משמעותי של ה- DNA מתרחש בידוד של מוסיף ווקטורים הבאים, הנה 30-50%ss. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפוגל-אי מחדש לקשור מוסיף מפוגל ואינו מפוגלים לוקטור באמצעות האנזים T4 DNA 38. להשתמש ביחס של 1: 4 של וקטור להכניס לתגובות קשירה. תגובת התקנה בהתאם להוראות יצרן. השתמש בהיקף כולל של 50 μl לתגובות דגירה O / N ב -20 ° C או על קרח עם מכסה מעל דלי קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות קשירה, לבצע ניקוי DNA באמצעות ערכה לנקות מועדפת, קרום סיליקה ג&#39;ל זמין מסחרי. אובדן משמעותי של ה- DNA להתרחש בעקבות תגובת קשירה, אובדן 30-50% משוער של ה- DNA. ודא מחדש קשירה ידי הפעלה על 1% ג&#39;ל DNA agarose ב 100 V 45 דקות ולהעריך ריכוז של פלסמידים-ligated מחדש (איור 4D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect פלסמידים מפוגלים או שאינו מפוגלים לתאי D54 באמצעות מגיב transfection מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן. תאי זרע D54 לצלחת 12 גם ב0.14 x 10 6 תאים / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , Wi תאי transfect הבא 24 שעותריכוזים שווים ה של שני (1) פלסמיד-methyated אינו CPG-luc2 + Renilla או וקטור לוציפראז שליטה אחר או (2) פלסמיד מפוגל CPG-luc2 + Renilla או וקטור לוציפראז שליטה אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתאי transfect למשך 24 שעות לפני ביצוע assay בלוציפראז הכפול. בצע assay לפי הוראות יצרן. לבצע קריאות באמצעות luminometer. קראו היטב כל בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב יחס בין פעילות לוציפראז גחלילית לRenilla או פעילות לוציפראז שליטה אחרת. לנרמל Firefly מפוגל: פעילות לוציפראז שליטה לFirefly-מפוגל עישון: פעילות לוציפראז שליטה על ידי חלוקת פעילות לוציפראז מפוגל על ידי פעילות בלוציפראז אינה מפוגל </li></ol>

למחברים אין גילוי נאות.

פרוטוקול זה מתאר בידוד של אוכלוסייה מועשרת של אסטרוציטים באמצעות FACS וכן מגוון טכניקות המאפשרות מחקרים מתאמים וסיבתיות בין מתילציה של DNA לביטוי גנים. טכניקות אלה, המשמשות בבידוד או בשילוב, שימושיות במיוחד עבור מעבדות שעובדות עם רקמות בעלות הטרוגניות תאית גבוהה או מעוניינות במצב מתילציה של DNA של גן או אזור גן מסוים לעומת שינויים גלובליים במתילציה של DNA. אתגר ייחודי יחסית בחקר האפיגנום של מערכת העצבים המרכזית הוא מגוון אוכלוסיות התאים. מכיוון שגנים מעניינים עשויים להתבטא בדרגות שונות עם דפוסים ייחודיים מבחינה זמנית ומר...

אפיגנטיקה היא חקר שינויים כימיים שיכולים להשפיע על פעילות השעתוק של הגנום. בעיקרו של דבר, ללא שינוי ברצף ה-DNA, שינויים אפיגנטיים כגון מתילציה של DNA, אצטילציה של היסטון ומתילציה של היסטון מספיקים כדי לשנות באופן הפיך את דפוסי ביטוי הגנים 1. מתילציה של DNA, מווסת חזק של ביטוי גנים, היא השינוי האפיגנטי המאופיין ביותר. מתילציה של DNA היא התקשרות קוולנטית של קבוצות מתיל במיקום C5 של ציטוזין, בדרך כלל הציטוזין של ציטוזין-גואנין דינוקלאוטיד, הידוע גם כאתר CpG. אזורים המכילים צפיפות גבוהה של אתרי CpG ידועים כאיי CpG (CGI). CGIs קשורים לעתים קרובות לאתרי התחלת שעתוק (TSS) ולמקדמי גנים 1-3. לפיכך, בעוד ששינויים במתילציה של DNA ב-CGIs אינם תמיד במקביל לשינויים בביטוי או בתפקוד התאים, שינויים במתילציה של DNA ב-CGIs יכולים להפעיל ויסות רב עוצמה על פעילות השעתוק 2. 
מבחינה היסטורית, מתילציה של DNA נצפתה כחיונית באמבריוגנזה, הטבעה והתפתחות, עם שינויים קטנים ברמות המתילציה של ה-DNA המתרחשים בתאים פוסט-מיטוטיים (למעט שינויים בגנים הקשורים לסרטן) 4,5. עם זאת, תחום הנוירו-אפיגנטיקה הדגיש תפקיד לא התפתחותי חשוב למתילציה של DNA. באופן ספציפי, אפיגנטיקה קוגניטיבית הגדירה מחדש מתילציה של DNA כמנגנון פלסטי ביותר אינטגרלי בתיווך הן הפעלה שעתוק והן דיכוי של גנים החיוניים לתהליך הלמידה והזיכרון 6. מלבד אפיגנטיקה קוגניטיבית, מחקרים המודלים פגיעה איסכמית וכאב נוירופתי מאפיינים מתילציה של DNA כמנגנון גמיש המגיב במהירות למגוון עלבונות במערכת העצבים המרכזית 7-9. בנוגע לאסטרוציטים, מספר קווי ראיות מצביעים על כך שמתילציה של DNA ממלאת תפקיד חשוב באסטרוגליוגנזה. Fan et al., מצאו כי KO מותנה של DNMT1 בתאי אב עצביים (NPCs) הביא להתפתחות מוקדמת של אסטרוציטים התואמים למצב גלובלי של היפומתילציה 10. בנוסף, פריסיק ואחרים, הגיעו למסקנה שרמות דיפרנציאליות של מתילציה של DNA של מקדם GLT-1 תיווכו רמות דיפרנציאליות של ביטוי של טרנספורטר הגלוטמט בקליפת המוח ובמוח הקטן, תוך הדגשת תפקיד במתילציה של DNA בביסוס דפוסים ספציפיים לאזור המוח של ביטוי גנים אסטרוציטיים 11. בסך הכל, מחקרים רבים מדגישים את האופי הדינמי והגמיש של מתילציה של DNA במערכת העצבים המרכזית שכן הסביבה, תרופות ופציעה הוכחו כולם כמשנים מתילציה של DNA ולעתים קרובות, ביטוי גנים 4,9. יחד, מחקרים נוירו-אפיגנטיים אלה מצביעים על מתילציה של DNA כמטרה טיפולית אפשרית עם פוטנציאל להפחית מגוון פתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית.
ככל שתחום האפיגנטיקה מרחיב את הבנתו את תפקידה של מתילציה של DNA בהתפתחות נוירולוגית ומחלות, האתגר של העברת מתילציה של DNA לעבר מטרה טיפולית הוא ביצוע לא רק מחקרים מתאמים, אלא גם מחקרים סיבתיים המגדירים מטרות ואתרים ספציפיים של גנים. בנוסף, סקירת שינויים במתילציה של DNA ספציפית לאזור המוח וסוג התא נותרה אתגר מתמשך וראוי לזמן ייחודי לתחום הנוירו-אפיגנטיקה. פרוטוקול זה משתמש במגוון טכניקות כולל מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) של אסטרוציטים, ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה רגיש למתילציה (MS-HRM), ובדיקת מתילציה של לוציפראז כדי לחקור את מצב המתילציה של ה-DNA של KCNJ10, גן המקודד ל-Kir4.1. Kir4.1 היא תעלת אשלגן ספציפית לגליה המדגימה הן את אזור המוח והן את דפוסי הביטוי הספציפיים לתאים במערכת העצבים המרכזית 12-16. ביטוי Kir4.1 גדל במעבר מאזורי מערכת העצבים המרכזית הרוסטרלית לאזורי מערכת העצבים המרכזית הזנבית, כאשר הביטוי הגבוה ביותר מתרחש בחוט השדרה 15. למרות שהתעלה מתבטאת בתאי אפנדימל, אוליגודנדרוציטים ותאי המבשר שלהם, Kir4.1 מתבטא בעיקר באסטרוציטים ונחשב חיוני לשמירה על רמות הומאוסטטיות של אשלגן וכן לתמיכה בספיגת גלוטמט על ידי הגדרת פוטנציאל קרום המנוחה האסטרוציטית בהיפרפולריזציה -80mV 12,16-19. חשוב לציין, הביטוי של Kir4.1 אינו סטטי הן במהלך ההתפתחות והן לאחר צורות מרובות של פגיעה במערכת העצבים המרכזית 20-25. ביקשנו לבחון את הוויסות האפיגנטי של ערוץ זה, במיוחד באסטרוציטים במהלך ההתפתחות. הטכניקות בהן נעשה שימוש מציעות ניתוחי אתר CpG ספציפיים וממוקדים לגנים המספקים ראיות סיבתיות לתפקיד של מתילציה של DNA בוויסות ביטוי הגנים KCNJ10. ניתן ליישם טכניקות אלה על גנים אחרים.

<table><tbody><tr><td>מערכת דיסוציאציה פפאין</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Primer</td><td>Applied Biosystems</td><td>תוכנה מקוונת</td><td>ללוקליזציה של איי CpG</td></tr><tr><td>ערכת מתילציה של DNA EZ</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>תקן כיול מעורבב מראש של חולדות</td><td>EpiGenDx</td><td>80-8060R-Premix</td><td></td></tr><tr><td>CpG מתילאז (M.SSSL)</td><td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick מיצוי ג'ל&nbsp;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>משמש למיצוי ג'ל וניקוי DNA</td></tr><tr><td>אנזימי הגבלה חותך</td><td>NEB ניו אינגלנד BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חותך NEB</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>מאמת באינטרנט</td><td>אתרי עיכול הגבלה</td></tr><tr><td>מערכת בדיקת מדווח לוציפראז כפול</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>וקטור Luc2, pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>וקטור רנילה, pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 Luminometer</td><td>Turner Designs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX ו-Plus Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>פנול, pH רווי 6.6/6.9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c ספקטרופטומטר</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה להתכה ברזולוציה גבוהה (HRM) v2.0</td><td>Life Technologies</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>AB SDS software v2.3</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB High Resolution Melting מדריך תחילת העבודה&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>באינטרנט</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT טכנולוגיות</td><td></td><td></td> <td>מהירות בזמן אמת לחיי</td> מערכת</tr></tbody></table>

התאמת שינויים גנטיים ספציפי dna מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic<em&gt; kcnj10</em&gt; (kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

מתילציה של DNA משמשת לוויסות ביטוי גנים באמצעות התקשרות קוולנטית של קבוצת מתיל למיקום C5 של ציטוזין בדינוקלאוטיד ציטוזין-גואנין. בעוד שמתילציה של DNA מספקת שינויים ארוכי טווח ויציבים בביטוי גנים, דפוסים ורמות של מתילציה של DNA נתונים גם הם לשינוי על סמך מגוון אותות וגירויים. ככזה, מתילציה של DNA מתפקדת כמווסת חזק ודינמי של ביטוי גנים. חקר הנוירואפיגנטיקה חשף מגוון מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים הקשורים לשינויים גלובליים וספציפיים לגנים במתילציה של DNA. באופן ספציפי, מתאמים בולטים בין שינויים בביטוי גנים ומתילציה של DNA קיימים בהפרעות נוירו-פסיכיאטריות ונוירודגנרטיביות, במהלך פלסטיות סינפטית ובעקבות פגיעה במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, ככל שתחום הנוירואפיגנטיקה ממשיך להרחיב את הבנתו את תפקיד מתילציה של DNA בפיזיולוגיה של מערכת העצבים המרכזית, תיחום קשרים סיבתיים ביחס לשינויים בביטוי גנים ומתילציה של DNA הם חיוניים. יתר על כן, בכל הנוגע לתחום הרחב יותר של מדעי המוח, נוכחותם של הבדלים נרחבים באזור וספציפי לתא דורשת טכניקות המתייחסות לשונות זו בעת חקר הטרנסקריפטום, הפרוטאום והאפיגנום. כאן אנו מתארים מיון FACS של אסטרוציטים בקליפת המוח המאפשר בדיקה עוקבת של שעתוק RNA ומתילציה של DNA. יתר על כן, אנו מפרטים טכניקה לבחינת מתילציה של DNA, ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה רגיש למתילציה (MS-HRMA) וכן בדיקת מקדם לוציפראז. באמצעות שימוש בטכניקות משולבות אלה ניתן לא רק לחקור שינויים מתאמים בין מתילציה של DNA לביטוי גנים, אלא גם להעריך ישירות אם שינויים במצב המתילציה של ה-DNA של אזור גן נתון מספיקים כדי להשפיע על פעילות השעתוק.

אוכלוסייה מועשרת של האסטרוציטים נרכשה באמצעות מיון FACS של בעלי חיים מהונדסים eGFP-S100β 27. בשל ירידה באיכות של תאים ומולקולות מולקולריות מבודדות מבעלי חיים מבוגרים יותר לאחר הלידה היום 50 (P50), בעלי חיים בגילים P0-P40 הם אופטימליים לניסויים כאלה. רקמת קליפת המוח שימשה לניסויים אלה. קליפת מוח משניים עד שישה בעלי חיים היו נקווה יחד. FACS בוצע במתקן UAB המקיף cytometry הזרימה Core. מיון בוצע על קיטון דיקינסון FACSAria השני. עירור eGFP הושג באמצעות לייזר 488 ננומטר; לא ה...

DNA מתילציה מסוגלת לשמור על רמות יציבות של ביטוי גנים וכן לאפשר שינויים דינמיים בביטוי גנים בתגובה למגוון גירויים. אנו מפרטים טכניקות המאפשרות לחקור שינויים ספציפיים לגנים במתילציה של DNA ואת ההשפעה של שינויים אלה על ביטוי גנים.

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

המטרה הכוללת של נוהל זה היא להעריך את מצב מתילציית ה-DNA של KCNJ 10 באוכלוסייה מועשרת של אסטרוציטים, ולבצע קורלציה בין שינויים במתילציית ה-DNA של הפרומוטור לבין פעילות שעתוקית אופציונלית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד של אוכלוסייה מועשרת של אסטרוציטים קורטיקליים ממוח של מכרסם באמצעות מיון FACS, ולאחר מכן בידוד DNA מהאוכלוסייה המועשרת של האסטרוציטים. לאחר מכן, מצב מתילציית ה-DNA של KCNJ 10 מוערך באמצעות אנליזת המסת ברזולוציה גבוהה הרגישה למתילציה (MS.HRMA).לבסוף, מקדם KCNJ 10 הוא בעל מתילציה גבוהה (hypermethylated), ובדיקת לוסיפראז משמשת לקשר בין שינויים במתילציית ה-DNA של המקדם לבין הפעילות התעתוקית. בסופו של דבר, MS-HRMA ובדיקת הלוסיפראז משמשות למדידת מצב מתילציית ה-DNA של KCNJ 10 ולקשירת שינויים במתילציית המקדם לפעילות התעתוקית של הגן. הפרוצדורה תוצג במהלך הסרטון. פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי ביצע את הניסוי; כל בעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות של המכוניים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health), והשימוש בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה לטיפול ובחשיפה בבעלי חיים באוניברסיטת אלבמה בברמינגהאם.כל הבאפרים והריאגנטים הוכנו בהתאם לפרוטוקול הכתוב. לאחר הפקת הקורטקס מהראש של בעל חיים שהורדם והומת, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש לחתוך או לקדוח באמצעות דרמל חור בחלקו העליון של מבחנה קונית בנפח 50 milliliter כדי לאפשר את הכנסת הצינוריות אל תוך המבחנה. לאחר מכן, יש להוסיף למבחנה תמיסת papin.הניחו את הקורטקסים המבודדים בצלחת תרבית של 10 מילימטרים המכילה תוך מפיקה (dissociation medium) המאוזנת ל-95% O2 ו-5% CO2, והשתמשו בלהב תער נקי כדי לקצוץ את הרקמה לחתיכות של מילימטר רבוע אחת. באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר, העבירו את הרקמה לשפופרת של 50 מיליליטר המכילה את תמיסת הפפאין. המתינו עד שהרקמה תשקע לתחתית פיפטת ההעברה לפני השחרורה.כדי למזער את כמות תמיסת הדיסוציאציה שמועברת ללא ביצוע בועיות (bubbling) לתמיסת הפפאין, יש להחיל זרימה קבועה של 95%O2 ו-5%CO2 באמצעות חילוף גזים על פני השטח, תוך דגירה במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, השתמש בפניפטה של 10 ml כדי לטלטל בעדינות את הרקמה 10 פעמים; סבב במערכת צנטריפוגה את תסחין התאים העכור במהירות של 300 G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש להביא את תמיסת מעכב האלבומין של ה-DNA לשיווי משקל באמצעות חילוף גזים על פני השטח, ולסספנד מחדש את משקע התאים בשלושה מיליליטר (3 ml) מהתמיסה.לאחר מכן, הכין מדרג צפיפות לא רציף מסחרי בהתאם להוראות היצרן. סבב את מדרג הצפיפות הלא רציף ב-70 G למשך שש דקות. לאחר מכן, בדול את התאים המופרדים מתחתית המבחנה באמצעות פיפט לשאיבת המדיום.השתמשו בשניים עד שלושה מיליליטרים של DPBS עם 0.02% bovine serum albumin ומיליגרם אחד למיליליטר של DNA או במצע מ preferred media. כדי להשתמש מחדש, השעו את התאים המופרדים. העבירו את התאים דרך מסנן של 40 microgram לפני ביצוע מיון תאים ומיצוי DNA או RNA בהתאם לפרוטוקול הכתוב.לאחר תכנון פריימרים נגד רצף DNA שעבר המרה בביסולפיט והגברה של ה-DNA לפי הפרוטוקול הכתוב, המירו בביסולפיט 500 עד 1000 nanograms של DNA מכל דגימה וסטנדרטים של DNA מתילציה בטווח שבין 0% ל-100% מאותו מין בעל חיים, תוך שימוש ב-DNA polymerase מועדף ובפריימרים בריכוז 5 µM. הגדירו תגובות בנפח 20 µL להגברת Ms HRM. בהתאם לטבלה זו, הרצו את כל הדגימות, כולל DNA של ביקורת (fax) וסטנדרטים של מתילציה, בשלוש חזרות; בהתאם לתוכנת הניתוח, הגדירו פרמטרים של התחלה וסיום (start and stop) לפני ואחרי המעברים של עקומת ההמסה (melt curve).הגדירו את הפרמטרים של התחלת ההמסה המוקדמת (prem melt start) וסיום ההמסה המוקדמת (prem melt stop), כך שההפרש ביניהם יהיה 0.2 עד 0.5 °C. הגדירו באופן דומה את נקודות ההתחלה והסיום של ההמסה המאוחרת (post melt), והפיקו נתונים של הפרשי טמפרטורת השיא עבור כל דגימה באמצעות סטנדרטים של אחוזי מתילציה והפרשי טמפרטורות השיא המתאימים להם.צור משוואת רגרסיה ליניארית. השתמש במשוואת רגרסיה ליניארית זו כדי להעריך את מצב המתילציה של דגימות לא ידועות, לאחר זיהוי איים של CpG בעלי עניין והגברה ושבט של פלסמיד של אי CpG Luke two בהתאם לפרוטוקול הכתוב. השתמש בתוכנת preferred cutter כדי לאמת את האתרים לעיכור רסטריקציה כדי למנוע חיתוכים כפולים, והפוך לליניארי 30 micrograms של פלסמיד לאחר שהדגימה עוכרה עם האנזימים המתאימים.בצעו אינאקטיבציה תרמית של האנזימים בטמפרטורה ובמשך הזמן המתאימים בתגובות של 50 µL. השתמשו בחמש יחידות של CPG methylate לצורך מתילציה של 700 µg של פלסמידים ליניאריים בטמפרטורה של 30 °C למשך 13 עד 19 שעות.לאחר ניקוי ה-DNA כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב, בצעו עיכול עם האנזים HPA II על דגימות של 1 µg של DNA מתילטורי על ידי דגירה ב-37 °C למשך שעה אחת. לאחר ניקוי ה-DNA, הריצו את הדגימות על ג'ל אגרוז של 1% ל-DNA במתח של 100 V למשך 45 דקות לצורך ויזואליזציה. לאחר מכן, העבירו פלסמידים מתילטוריים ולא מתילטוריים לעיכול כפול עם אנזימי הגבלה מתאימים למשך הלילה כדי לשחרר את וקטור Luke 2 באורכו המלא ואת פרגמנטים של CpG islands.בצעו אינאקטיבציה תרמית לאנזימים לאחר העיכול. הריצו את דגימות העיכול הכפול על ג'ל אגרוז 1% DNA במתח של 100 וולט למשך שעה אחת כדי להפריד בין הווקטור למקטע המוכנס (insert); לאחר מכן, בעודכם לובשים מיגון מפני קרינת UV, הניחו את הג'ל תחת אור שחור ובאמצעות להבים כירורגיים נקיים, גזרו את המקטעים הממותילים והבלתי ממותילים. לאחר מיצוי ה-DNA מהג'ל בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמשו ב-T four DNA Ligase וביחס של 1:4 בין הווקטור למקטע המוכנס כדי ללגט את המקטעים הממותילים והבלתי ממותילים אל תוך ווקטור שאינו ממותיל. לאחר הליגציה, דגרו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס או על קרח למשך הלילה.נקו את ה-DNA ואמתו את הליגציה מחדש על ידי הרצת דגימות על ג'ל agarose של 1% DNA, והעריכו את ריכוז הפלסמיד שעבר ליגציה מחדש. זרעו תאי CD 54 בצלחת 12 בארות בריכוז של 140,000 תאים לבערה. לאחר 24 שעות, השתמשו בריאגנט טרנספקציה מסחרי כדי לבצע טרנספקציה לתאים בריכוזים שווים של פלסמיד CpG loop 2 שאינו מתיל, בתוספת RAN vanilla או וקטור לוסיפרול שולט אחר, או פלסמיד CpG loop 2 מתיל בתוספת ELLA או וקטור לוסיפרול שולט אחר. המתינו 24 שעות לסיום הטרנספקציה של התאים לפני ביצוע בדיקת לוסיפרול.בהתאם להוראות היצרן, השתמשו במדי-לומינסנציה (luminometer) לקריאה של כל באר בשלוש חזרות. חשבו את היחס בין הפעילות של לוסיפראז של גחליליות לבין רנבנילה או בקרָה אחרת של פעילות לוסיפראז.נרמלו את הפעילות של הלוסיפראז של חגב-השדה (firefly) המתילת אל מול הפעילות של הלוסיפראז של חגב-השדה שאינה מתילת, על ידי חלוקת הפעילות המתילת בפעילות הלוסיפראז המתילת. כפי שמוצג כאן, אוכלוסייה מועשירה של אסטרוציטים הושגה באמצעות מיון FACS של בעלי חיים טרנסגניים מסוג E-G-F-P-S 100 beta. אוכלוסייה מוגדרת (gated) נבחרה על בסיס פיזור קדמי וצדי, ואוכלוסיית תאים חיים נקבעה באמצעות אינדיקטור לברומיד לתאים מתים; התמונות המוצגות כאן הן תמונות מייצגות של אסטרוציטים חיוביים ל-EGFP לאחר הדיסוציאציה, אך לפני המיון וכן לאחר המיון. דמות זו מראה אוכלוסייה מבודדת של תאים חיוביים ל-EGFP שהראתה עלייה של 40 מדרגות ב-mRNA עבור הסמן הספציפי לאסטרוציטים.LDH 1 L 1. בנוסף, למרות ביטוי משותף של S 100 beta ו-NG2 בתאי OPCs ואסטרוציטים חיוביים, נצפתה הפחתה פי ארבעה ב-mRNA של NG2, סמן לתאי אב של אוליגודנדרוציטים, המעידה על בידוד של אוכלוסיית תאים אסטרוציטית מועשרת. טבלה זו מרכזת את סך ה-RNA וה-DNA, שבודדו מבעלי גילים ומספר חיות משתנים, והיא מובאת כייחוס לתשואה הצפויה של מולקולות מולקולריות לאחר העובדות.לבסוף, נעשה שימוש במבחן לוציפרז כפול (dual luciferase assay) כדי להעריך את הפעילות השעתוקית של אזורים עם היפר-מתילציה בגן הנחקר, לאחר העברת המקטע המתומתיל לווקטור שאינו מתומתיל. אנזים HPA II, המעכל אך ורק DNA שאינו מתומתיל, שימש לאימות מצב המתילציה של הפלסמיד. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים אוכלוסייה מועשרת של אסטרוציטים באמצעות FACS, וכן כיצד למדוד מתילציית DNA של גן ולהקיש על קשר בין שינויים במתילציית ה-DNA של הפרומוטור לבין הפעילות השעתוקית, באמצעות אנליזת HRM (high resolution melt) רגישה למתילציה ומבחן לוציפרז, בהתאמה.

correlating-gene-specific-dna-methylation-changes-with-expression

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זרימת עבודה יעילה ללמוד מתילציה דנ"א ביטוי שינויים גנטיים על הלחץ מוקדם בחיים מוצג. החל מ הפרידה מן האם של עכברים בני יומם ובידוד של רקמות מוח נפרדים, אנחנו מייצגים את הפרוטוקול בו זמנית לבודד DNA ו-RNA של אגרופים רקמות המוח רצף bisulfite עתידיים RT-PCR ניתוח.

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

ההכנה של פרוסות חריפות מוח מhippocampi המבודד, כמו גם את ההקלטות אלקטרו סימולטני של האסטרוציטים ונוירונים...

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

כאן אנו מתארים עיבוד של פרוטוקולים המשמשים כדי לגרום פלסטיות homeostatic בנוירונים לחקר הפלסטיות של קולטני G-חלבון בשילוב astrocytic. לאחרונה משמש כדי לבחון שינויים בקבוצת astrocytic אני mGluRs בעכברים לנוער, ניתן ליישם השיטה למדידת קנה מידה של GPCRs astrocytic השונות, ברקמות של עכברים בוגרים באתרו וin vivo, ולקבל הערכה טובה יותר של הרגישות של קולטני astrocytic לשינויים בפעילות עצבית.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

המאפיינים והתפקודים של אותות Ca2+ תוך-תאיים של אסטרוציטים בסטריאטום עדיין לא נחקרו במלואם. אנו מתארים שיטות לביטוי מדדי סידן מקודדים גנטית באסטרוציטים סטריאטליים באמצעות נגיפים הקשורים לאדנוטיפ 2/5 (AAV2/5), כמו גם נהלים להדמיה מהימנה של אותות Ca2+ בתוך אסטרוציטים סטריאטליים באתרם.

ההדמיה תאית Ca 2 + אותות בstriatal האסטרוציטים מעכברים בוגרים באמצעות אינדיקטורים סידן מבחינה גנטית מקודדים

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בטכניקת מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS) כדי למיין סוגים ספציפיים של תאים עצביים לניתוח עוקב של ביטוי גנים ספציפיים לסוג התא, סמנים אפיגנטיים ו/או ביטוי חלבון.

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

מטרת הדו ח היא לתאר את הפרוטוקול לגילוי immunohistochemical חזקה של סמני epigenetic, 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בפיתוח, postmitotic העכבר הרשתית.

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

אסטרוציטים לפרוש את קליפת המוח באופן אחיד, מה שהופך את הניתוח של המורפולוגיה המורכבת שלהם מאתגר ברמה התאית. הפרוטוקול המסופק כאן משתמש בתיוג צבעוני המבוסס על אלקטרופורציה ברחם כדי לבודד אסטרוציטים קליפתיים ולנתח את נפחם ומורפולוגיה שלהם עם צינור ניתוח תמונה ידידותי למשתמש.

ב אלקטרופולציה הרחם של גנום רב-תכליתי שילוב צבע (MAGIC) סמנים כדי להתאים אישית אסטרוציטים עכבר קליפת המוח

מאמר זה מציג פרוטוקול לשימוש ב-DeepSpaceDB, מסד נתונים דינמי ואינטראקטיבי לתעתיק מרחבי, המציע זרימות עבודה ודוגמאות לחקר ארגון רקמות וביטוי גנים הקשורים למחלות.

כריית מערכי נתונים של טרנסקריפטומיקה מרחבית באמצעות DeepSpaceDB

פרוטוקול זה מספק תיאור מקיף של שיטה לרישום סימולטני של אותות סידן מנוירונים ואסטרוציטים באזורים מוחיים רבים הקשורים לזיכרון ומדגים את יישומו במהלך פרדיגמת התנהגות למידה וזיכרון.

שיטת פוטומטריית סיבים דו-צבעונית לתיעוד פעילות אסטרוציטים-נוירונים באזורים שונים במוח במהלך התנהגויות למידה וזיכרון

למדו להעריך את מצב המתילציה של DNA בגן KCNJ10 באסטרוציטים באמצעות MS.HRMA ומבחן לוציפראז. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לקשר שינויים במתילציה לפעילות תעתיקית.

התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic

גלה סרטונים נוספים