התאמת שינויים גנטיים ספציפי DNA מתילציה עם ביטוי ותעתיק פעילות של astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את מצב המתילציה של ה-DNA של KCNJ 10 באוכלוסייה מועשרת של אסטרוציטים ולתאם שינויים במתילציה של DNA של המקדם עם פעילות אופציונלית שעתוק. זה מושג על ידי בידוד אוכלוסייה מועשרת של אסטרוציטים בקליפת המוח ממוח מכרסם שלם באמצעות מיון עובדות לאחר מכן ה-DNA מבודד מהאוכלוסייה המועשרת של אסטרוציטים. לאחר מכן מוערך מצב המתילציה של ה-DNA של KC J 10 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה רגיש למתילציה או MS. HRMA.

לבסוף, מקדם KC J 10 הוא היפרמתילציה ובדיקת לוציפרים משמשת למתאם שינויים במתילציה של ה-DNA של המקדם עם פעילות שעתוק. בסופו של דבר, MS. HRMA ובדיקת הלוציפראז משמשים למדידת מצב המתילציה של ה-DNA של KCNJ 10 ומתאם שינויים במתילציה של המקדם ופעילות השעתוק של הגן המדגים את ההליך. כפוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי, כל בעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות, הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אלבמה בברמינגהם אישרה שימוש בבעלי חיים.

כל המאגרים והריאגנטים הוכנו על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר ניתוח קליפת המוח מראשה של חיה שהורדמה, על פי פרוטוקול הטקסט, חתכו או טפטפו חור בחלק העליון של צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי לאפשר הזנת צינורות לתוך הצינור. לאחר מכן הוסף תמיסת פפין לצינור.

מניחים את קליפות המוח המנותחות בצלחת תרבית של 10 מילימטר המכילה מדיום דיסוציאציה מאוזן ל-95% O2 עד 5% CO2, והשתמש בסכין גילוח נקי כדי לטחון את הרקמה לחתיכות מילימטר מרובע. עם פיפטה של 10 מיליליטר, גברים מעבירים את הרקמה לצינור של 50 מיליליטר המכיל את תמיסת הפפאן. הניחו לרקמה להתיישב בתחתית פיפטת ההעברה לפני הפריקה.

כדי למזער את כמות מדיום הדיסוציאציה המועבר מבלי לבעבע את תמיסת הפפאן, יש למרוח זרימה קבועה של 95% O2 עד 5% CO2 באמצעות חילופי גזים על פני השטח תוך דגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, השתמש בפיפטה העברה של 10 מיליליטר כדי לאט לאט את הרקמה 10 פעמים צנטריפוגה את תרחיף התאים העכור ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. איזון תמיסת מעכב האלבומין של ה-DNA באמצעות חילופי גזים על פני השטח והשעיה מחדש של התאים הגלולים בשלושה מיליליטר של התמיסה.

לאחר מכן הכן שיפוע צפיפות לא רציף מסחרי בהתאם להוראות היצרן. סובב את שיפוע הצפיפות הלא רציף ב-70 G למשך שש דקות. לאחר מכן בודד את התאים המנותקים מתחתית הצינור באמצעות פיפטה כדי לשאוב את המדיה.

השתמש בשניים עד שלושה מיליליטר של DPBS עם 0.02% אלבומין בסרום בקר ומיליגרם אחד למיליליטר DNA או מדיה מועדפת. כדי לחזור, השעו את התאים המנותקים. העבירו את התאים דרך מסנן של 40 מיקרוגרם לפני ביצוע מיון עובדות ומיצוי DNA או RNA לפי פרוטוקול הטקסט.

לאחר תכנון פריימרים כנגד רצף DNA מומר של בי סולפיט והגברת ה-DNA על פי פרוטוקול הטקסט על ידי סולפיט, המירו 500 עד 1000 ננוגרם של DNA מכל דגימה ותקני DNA מתילציה הנעים בין אפס ל-100% מאותו מין בעלי חיים באמצעות DNA מועדף, פולימראז וחמישה פריימרים מיקרו-מולאריים. הגדר תגובות של 20 מיקרוליטר להגברה של Ms HRM. על פי טבלה זו, הפעל את כל הדגימות כולל פקס, DNA ותקני מתילציה בשלוש עותקים בהתאם לערכת תוכנת הניתוח, פרמטרים לפני ואחרי התחלה ועצירה סביב המעברים של עקומת ההיתוך.

הגדר את פרמטרי ההיתוך, ההתחלה ועצירת ההיתוך של הטרום. אז ההבדל בין השניים הוא 0.2 עד 0.5 מעלות צלזיוס. הגדר לאחר המסה, התחל והפסק באופן דומה וחלץ נתוני הפרש טמפרטורת שיא עבור כל דגימה באמצעות תקני מתילציה באחוזים והפרשי טמפרטורת השיא המתאימים להם.

צור משוואת רגרסיה ליניארית. השתמש במשוואת רגרסיה ליניארית זו כדי להעריך את מצב המתילציה של דגימות לא ידועות לאחר זיהוי איי CPG מעניינים והגברה ושיבוט של אי CPG לוק שני פלסמיד לפי פרוטוקול הטקסט. השתמש בתוכנת חותך מועדפת כדי לאמת אתרים לעיכול הגבלה כדי למנוע חתכים כפולים וליניאריזציה של 30 מיקרוגרם פלסמיד לאחר שהדגימה התעכלה עם האנזימים המתאימים.

חום מנטרל אנזימים בטמפרטורה ומשך הזמן המתאימים בתגובות של 50 מיקרוליטר. השתמש בחמש יחידות של מתילט CPG כדי למתילאט. 700 מיקרוגרם של פלסמידים ליניאריים ב-30 מעלות צלזיוס למשך 13 עד 19 שעות.

לאחר ניקוי ה-DNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט, בצע תקציר הגבלה של HPA שתי הגבלות על דגימות מיקרוגרם אחת של DNA שעבר מתילציה על ידי דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר ניקוי ה- DNA הפעל דגימות על ג'ל DNA של 1% אגרוס ב -100 וולט למשך 45 דקות להדמיה. הנבדק הבא, פלסמידים שעברו מתילציה ולא מתילציה לעיכול כפול עם אנזימי הגבלה מתאימים בן לילה כדי לשחרר את שברי האי לוק שני וקטור ו-CPG באורך מלא.

חום משבית את האנזימים לאחר העיכול. הפעל את הדגימות המעוכלות כפולות על ג'ל אגרוס DNA של 1% ב-100 וולט למשך שעה כדי להפריד וקטור ולהכניס ואז תוך כדי לבישת הגנה מפני אור UV, הנח את הג'ל על אור שחור ועם להבים כירורגיים נקיים, כרת את התוספות המתיליות והלא מתילציה לאחר חילוץ ה-DNA על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש ב-T ארבעה DNA Ligase וביחס של אחד לארבעה של וקטור כדי להכניס כדי להחזיר את התוספות המתיליות והלא מתיליות לווקטור ללא מתילציה דגירה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס או על קרח למשך הלילה לאחר הקשירה.

נקה את ה- DNA ואמת את הקשירה מחדש על ידי הפעלת דגימות על ג'ל ארוס DNA של 1% והעריך את ריכוז תאי הפלסמיד CD 54 הקשורים מחדש על צלחת 12 בארות ב -140,000 תאים לבאר. 24 שעות לאחר מכן. השתמש במגיב טרנספקציה מסחרי כדי להעביר תאים עם ריכוזים שווים של לולאת CPG ללא מתילציה שני פלסמיד בתוספת וניל RAN או וקטור ברזלי אחר או מתילציה c pg לוק שני פלסמיד בתוספת ELLA או וקטור לוציפרים בקרה אחר אפשר לתאים לעבור במשך 24 שעות לפני ביצוע בדיקת לוציפר.

על פי הוראות היצרן, השתמש בלומינומטר כדי לקרוא כל באר בשלוש עותקים. חשב את היחס בין פעילות לוציפרי הגחליליות לוניל או בקרה אחרת. פעילות לוציפר.

לנרמל את פעילות לוציפראז בקרת הגחלילית המתילית לפעילות לוציפראז בקרת גחלילית ללא מתילציה על ידי חלוקת פעילות מתילציה בפעילות לוק מתילית. כפי שהודגם כאן, אוכלוסייה מועשרת של אסטרוציטים נרכשה באמצעות מיון פקס של בעלי חיים טרנסגניים E-G-F-P-S 100 בטא. אוכלוסייה מגודרת הייתה ממוקדת על סמך פיזור קדימה וצדדית, ואוכלוסיית תאים חיים נקבעה באמצעות אינדיקטור תאים מתים של ברומיד והשער המוצג כאן הוא תמונות מייצגות של אסטרוציטים חיוביים ל-EGFP לאחר דיסוציאציה, אך לפני המיון כמו גם לאחר המיון, איור זה מראה אוכלוסיית תאים חיובית מבודדת ל-EGFP שהדגימה עלייה של פי 40 ב-mRNA עבור הסמן הספציפי לאסטרוציטים.

LDH אחד L אחד. בנוסף, למרות ביטוי משותף של S 100 beta ו-NG שני OPCs חיוביים ואסטרוציטים, נצפתה ירידה של פי ארבעה ב-NG שני mRNA, סמן לתאי מבשר אוליגודנדרוציטים המצביע על בידוד של אוכלוסיית תאים אסטרוציטים מועשרת. טבלה זו מפרטת את סך ה-RNA וה-DNA, שבודדו מגילאים ומספר בעלי חיים שונים, והיא רשומה כהתייחסות לתפוקה הצפויה של מולקולות מולקולריות בעקבות עובדות.

לבסוף, נעשה שימוש בבדיקת לוציפרים כפולה כדי להעריך את פעילות השעתוק של אזורים היפר-מתיליים של הגן המעניין לאחר העברת התוסף המתילי לווקטור שאינו מתילציה. HPA 2, המעכל רק DNA שאינו מתילציה שימש לאימות מצב המתילציה של הפלסמיד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד אוכלוסייה עשירה של אסטרוציטים באמצעות עובדות, כמו גם כיצד למדוד מתילציה של DNA של גן ולתאם שינויים במתילציה של ה-DNA של המקדם עם פעילות שעתוק באמצעות ניתוח נמס רגיש למתילציה ברזולוציה גבוהה ובדיקת לוציפראז בהתאמה.